乙締基]苯基} -N-苯基苯胺的合成
[0034] 將（0. 71g，2mm〇U蝕，2E)-3,3(苯基苯胺）2(1,4-亞苯基）丙締醒， (0. 63g，5mmol) 2-琉基苯胺和化136g，0.Smmol)對甲基苯橫酸加入到燒瓶中，用DMF作溶 劑加熱到120°C，攬拌16小時。將反應液傾入到1000 mL水中并在其中攬拌6小時，用CH2CI2 萃取。有機層用飽和氯化鋼溶液洗涂，無水MgS〇4干燥，過濾，蒸除溶劑。粗產品用柱色譜 分離，石油酸/乙酸乙醋（2 : 1)作淋洗液，得到棟黃色固體，即為4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺。 產率：21%。
[0035]IHNMR(400MHz, (16-DMS0) : 5 (ppm) :8. 08(d,J= 7. 84Hz, 2H), 7. 96(d,J =8Hz, 2H), 7. 73 (d,J= 8. 48Hz, 4H), 7. 63 (d,J= 8. 08Hz, 2H), 7. 51 (t,J= 8. 04Hz, 4H)，7. 43 (dd,Ji= 7. 2細z,J2= 7. 56Hz, 4H)，7. 21 (t,J= 7. 48Hz,IH)，7. 16 (d,J= 7. 72Hz, 2H). 7. 05 (d,J= 8. 48Hz, 4H).
[003引 實施例2
[0037] 4-[巧)-2- (IH-苯并咪挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (IH-苯并咪挫-2-基） 乙締基]苯基} -N-苯基苯胺的合成
[003引合成工藝同實施例1，合成獲得4-[巧苯并咪挫-2-基）乙締 基]-N-{4-[巧)-2-(1H-苯并咪挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺，產率：17%。 [0039]IHNMR(400MHz,d6-DMS0) : 5(ppm) :12. 55(S,2H)，7. 65(m,J= 7.67Hz，6H)，7.55(d，J= 7.64Hz, 4H), 7.41 (t,J= 7.84Hz, 2H), 7.16 (t,J= 7. 76Hz, 5H)，7. 11 (d,J= 7. 68Hz, 4H)，7. 07 (d,J= 8. 24Hz, 4H).
[0040] 實施例3
[0041] 1?心甜3和化la細胞培養
[0042] 1?心甜3或化La細胞株貼壁培養于內含10%胎牛血清培養液中，在37°C，5%C〇2 的飽和濕度解箱中培養，每2~3d換液傳代I次。待細胞生長到對數期，接片培養：①將蓋 玻片于無水乙醇中浸泡30min，酒精燈烘干后放入一次性35mm培養皿中；②將100mL細胞 瓶中的細胞用PBS洗S遍，用Iml0. 25 %膜酶消化3-5分鐘，小屯、地倒出培養基，加入少量 新鮮培養基吹打均勻，細胞計數后，留下合適密度的細胞，將培養基加至所需體積（控制細 胞終濃度為lxl〇5)，接種至內含蓋玻片的培養皿中，放入C〇2培養箱中培養，使細胞爬片生 長。
[004引 實施例4
[0044] 4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基） 乙締基]苯基} -N-苯基苯胺染色1?心甜3和化Ia細胞
[004引將4-[似-2-加-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧)-2-加-苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺稀釋至濃度為的5yM的染料溶液，在C〇2培養箱 中對細胞染色30min。染色后的玻片取出，洗去未結合的多余染液，細胞生長面朝下蓋在載 玻片上，在單光子共聚焦顯微鏡和雙光子巧光顯微鏡下觀察細胞著色部位，巧光分布及亮 度變化等，結果見圖1-圖2。
[0046] 圖1 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺對活性1?心甜3和化Ia細胞進行染色得到 單光子共聚焦巧光顯微照片。其中a圖為用4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締 基]-N-{4-[巧)-2-(1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的巧光顯 微照片；b圖為明場照片；C圖為左中兩圖的合并圖即共定位圖。
[0047] 圖2 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺對活性1?心甜3和化Ia細胞進行染色在800納米 激光福照下得到的雙光子巧光顯微照片。其中a圖為用4-[巧苯并嚷挫-2-基） 乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的雙 光子巧光顯微照片；b圖為明場激光掃描的微分顯微照片；C圖為左中兩圖的合并圖。
[004引 實施例5
[0049] 4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基） 乙締基]苯基}-N-苯基苯胺和艦化丙晚共染實驗
[0050] 將接種好的化La細胞爬片，用PBS洗S遍，分別用血清稀釋和DMSO=PBS(1:50)混 合溶液稀釋的5yM的染料溶液在C〇2培養箱中染色細胞30min。PBS洗去未結合的多余染 液，再用PBS稀釋的5yM的艦化丙晚溶液在C〇2培養箱中染色細胞30min。
[0051] 將染色后的玻片取出，洗去未結合的多余染液，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在 單光子共聚焦顯微鏡下觀察細胞著色部位，巧光分布及亮度變化等，結果見圖3。
[0052] 圖3 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺和艦化丙晚對活化Ia細胞進行染色后，分別在405 和561納米激光福照下分為兩個通道收集得到的單光子共聚焦巧光顯微照片。其中a為 405納米激發綠色通道的照片，b為561納米激發紅色通道的照片，C為明場照片，d圖為a、 b、CS者合并圖片。
[00閲 實施例6
[0054] 4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (1H-苯并嚷挫-2-基） 乙締基]苯基} -N-苯基苯胺和DAPI共染實驗
[00巧]將接種好的化La細胞爬片，用PBS洗S遍，分別用血清稀釋和DMSO=PBS(1:50)混 合溶液稀釋的5yM的探針溶液在C〇2培養箱中染色細胞30min。PBS洗去未結合的多余染 液，再用PBS稀釋的5yM的DAPI溶液在C〇2培養箱中染色細胞30min。
[0056] 將染色后的玻片取出，洗去未結合的多余染液，細胞生長面朝下蓋在載玻片上，在 單光子共聚焦顯微鏡下觀察細胞著色部位，巧光分布及亮度變化等，結果見圖4。
[0057] 圖4 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺、DAPI分別依次對活性化Ia細胞進行染色后，分 別在405和561納米激光福照下分為兩個通道收集得到的單光子共聚焦巧光顯微照片。其 中a為綠色通道的照片，b為藍色通道的照片，C圖為前兩者合并圖片。
【主權項】
1. 一種具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料是三苯胺 雜環類化合物，其化學結構通式如式（I)所示：其中：上述式中R表示NH或S原子。2. 如權利要求1所述具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述R 表示S原子。3. 如權利要求1所述具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述 染料是4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基）乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基） 乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺。4. 權利要求1-3之一所述具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料在顯示活細胞 中細胞質雙光子成像中的應用。5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于：所述活細胞為HeLa細胞或RBL-2H3細胞。
【專利摘要】本發明公開了一種具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料，該染料是三苯胺雜環類化合物，其化學結構通式如式(I)所示。本發明還公開了所述染料在顯示活細胞中細胞質雙光子成像中的應用。實驗證實本發明的染料具有比較大的雙光子熒光活性吸收截面、優秀的細胞膜通透性和低毒性等特點，還具有適用范圍廣，價格低，能與已有的探針DAPI具有良好生物相容性的特點，在激光激發熒光生物標記領域具有廣闊應用前景。
【IPC分類】C07D277/64, C07D235/14, C09B23/14, C09K11/06, G01N21/64
【公開號】CN105153733
【申請號】CN201510481534
【發明人】于曉強, 馮瑞卿, 孫渝明, 李學晨
【申請人】山東大學
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年8月7日