。
[0027] 實施例2
[0028] (1)實驗步驟如實施例1的步驟(1)。
[0029] (2)全細胞催化反應:反應體系為0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L氯化銨，lmol/L葡萄 糖，0.0 lmo 1/L的Tri s-鹽酸緩沖液，pH 8.0，60g/L的細胞，反應體積50mL，在30 °C反應溫度 下，200rpm震蕩反應反應時間48h。
[0030] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產物苯丙氨酸的收率為 85.2%，e.e.值為99.9%。
[0031] 實施例3
[0032] (1)實驗步驟如實施例1的步驟(1)。
[0033] (2)全細胞催化反應:反應體系為0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L組氨酸，lmol/L異丙 醇，0.01 mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH 9.5，50g/L的細胞，反應體積50mL，在35°C反應溫度下， 200rpm震蕩反應反應時間48h。
[0034] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產物苯丙氨酸的收率為 52.1%，e.e.值為99.9%。
[0035] 實施例4
[0036] (1)實驗步驟如實施例1的步驟(1)。
[0037] (2)全細胞催化反應:反應體系為0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L丙氨酸，ImoVL木糖， 0.01 mol/L的乙酸鈉沖液，pH 6.5，80g/L的細胞，反應體積50mL，在25°C反應溫度下，200rpm 震蕩反應反應時間48h。
[0038] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產物苯丙氨酸的收率為 59.1%，e.e.值為99.9%。
[0039] 實施例5
[0040] (1)實驗步驟如實施例1的步驟(1)。
[0041 ] (2)全細胞催化反應:反應體系為0.5mol/L苯丙酮酸，lmol/L氯化銨，lmol/L半乳 糖，0.0 lmo 1/L的磷酸鉀沖液，pH 8.0，40g/L的細胞，反應體積50mL，在20 °C反應溫度下， 200rpm震蕩反應反應時間48h。
[0042] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產物苯丙氨酸的收率為 46.5%，e.e.值為99.9%。
[0043] 實施例6
[0044] (1)實驗步驟如實施例1的步驟(1)。
[0045] (2)全細胞催化反應:反應體系為0.5mol/L苯丙酮酸，lmo VL甲酸銨，lmo VL葡萄 糖，0.01m〇l/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.5，15g/L的細胞，反應體積50mL，在40°C反應溫度下， 300rpm震蕩反應反應時間48h。
[0046] (3)分離與檢測:反應液離心去除沉淀，上清液加入等體積的甲醇，混合震蕩均勻， 離心棄掉沉淀，上清液稀釋備用。用高效液相色譜檢測，計算產物苯丙氨酸的收率為 67.7%，e.e.值為99.9%。
[0047]底物苯丙酮酸和產物L-苯丙氨酸用高效液相色譜檢測，色譜柱為Chirex 3126,檢 測波長254nm(附圖1、2)。其檢測條件為：流動性為含有2mM的CuS〇4的95/5的水/異丙醇溶 液;流速為lml/min;柱溫為35°C。
[0048] 本發明篩選得到南海芽孢桿菌(Bacillus nanhaiensis)，經過菌株培養，細胞制 備，在加入氨基供體和輔助底物情況下，細胞催化苯丙酮酸不對稱還原胺化得到產物手性 苯丙氨酸。確定了該菌株全細胞催化苯丙酮酸不對稱還原胺化的反應體系和反應條件。操 作方便，設備簡單，在生物催化制備手性苯丙氨酸領域具有較好的工業應用前景，對于今后 生物催化專用酶源的開發和手性化合物合成方法的研究具有較為重要的意義。
【主權項】
1. 一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征在于包括以下步 驟： 1) 細胞液制備:將菌種接入2216L培養基中培養，得發酵液，離心獲得細胞，用緩沖液重 懸、洗滌，配制成細胞液;所述菌種為南海芽孢桿菌(Bacillus nanhaiensis)DSF-15A2,所 述南海芽抱桿菌(1^(：;[11113 11&1111&丨6118丨8)03?-15六2已于2014年03月25日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.8969; 2) 全細胞催化反應:在步驟1)得到的細胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供體作為底物，再 加入輔助底物用于輔酶循環再生，反應后得到含有產物L-苯丙氨酸的反應液； 3) 分離與檢測：將步驟2)得到的含有產物L-苯丙氨酸的反應液離心去除沉淀，上清液 加入等量的甲醇，震蕩混合均勻，離心去除沉淀，上清液稀釋后進行測定，苯丙酮酸的濃度 用高效液相色譜檢測，產物L-苯丙氨酸的濃度和對映體過量值用高效液相色譜測定，所述 沉淀為蛋白質。2. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟1)中，所述菌種接入的量按質量百分比為2216L培養基的1%;所述2216L培養基 的組成可為：1~15. Og/L蛋白胨，1~10.0 g/L酵母粉，0.1~lg/L牛肉膏，0.1~2g/L檸檬酸 鈉，0.1~lg/L NH4N03，0.1~2g/L乙酸鈉，用海水配制至1L。3. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟1)中，所述培養的條件為:起始PH6.5~8.0，裝液量體積分數為5%~15%，培養 溫度20~40 °C，搖床轉速150~250rpm，培養時間12~48h;所述離心的條件可為:在冷凍離 心機中，4°C，8000rpm，離心 15min。4. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟1)中，所述緩沖液采用濃度〇. 01~〇. 2mol/L，pH為7~13的Tris-鹽酸、乙酸鈉、 碳酸鈉、磷酸鉀中至少一種，優選pH 8的Tris-鹽酸緩沖液。5. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟1)中，所述重懸的條件為棄上清液，沉淀用Tris-鹽酸緩沖液重懸，pH 6.5~ 8.0;所述洗滌可重復操作3次;所述細胞液的質量濃度可為0.025~100g/L。6. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟2)中，所述氨基供體選自丙氨酸、氨水、NH 4C1、NH4N03、甲酸銨中的一種，優選氨 水或NH4C1。7. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟2)中，所述輔助底物選自葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、異丙醇中的至少一種，優 選葡萄糖和甘油中的至少一種。8. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟2)中，所述反應的條件為pH 7~13,反應溫度20~50°C，震蕩速率100~300rpm， 反應時間30~180h。9. 如權利要求1所述一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于在步驟3)中，所述高效液相色譜測定，色譜柱為手性柱Chirex 3126柱，檢測波長 254nm，檢測條件為:流動性為含有2mM的CuS〇4的95/5的水/異丙醇溶液;流速為lml/min;柱 溫為35°C。
【專利摘要】一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，涉及手性苯丙氨酸。將菌種接入2216L培養基中培養，得發酵液，離心獲得細胞，用緩沖液重懸、洗滌，配制成細胞液；所述菌種為南海芽孢桿菌(Bacillus？nanhaiensis)DSF-15A2，保藏中心登記入冊編號為CGMCC？No.8969；在細胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供體作為底物，再加入輔助底物用于輔酶循環再生，反應后得到含有產物L-苯丙氨酸的反應液，離心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震蕩混合均勻，離心去除沉淀，上清液稀釋后進行測定，苯丙酮酸的濃度用高效液相色譜檢測，產物L-苯丙氨酸的濃度和對映體過量值用高效液相色譜測定。CGMCC No.896920140325
【IPC分類】C12N1/20, C12P13/22, C12R1/07
【公開號】CN105647835
【申請號】
【發明人】方柏山, 任紅, 王世珍
【申請人】廈門大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年8月8日