一株枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其應用，屬于發酵技術領域。
【背景技術】
[0002] 芽孢桿菌的菌體呈桿狀，形態為長直或接近直，大小為0.3~2.2 X 1.2~7.0微米。 多數運動，鞭毛典型側生。菌體可形成耐熱內生孢子，在一個孢子囊細胞中，孢子不多于1 個。菌體暴露在空氣中并不妨礙孢子的形成，革蘭氏反應陽性，僅在生長早起可能出現陰 性。有機化能營養，可利用多種底物進行嚴格呼吸代謝，嚴格發酵代謝或者呼吸和發酵二者 兼有的代謝。在呼吸代謝中，最終的電子受體是分子氧，在一些種中可以用硝酸鹽代替氧， 大多數的種可以產生氫氧化物酶。嚴格好氧或兼性厭氧。
[0003] 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中的一個種，呈桿狀，很少成鏈，染色均勻，鞭毛側生。 內生孢子的大小為0.8 XI. 5~1.8微米，游離孢子的表面著色較弱，萌發時芽孢殼赤道裂， 營養細胞露出后，孢子殼消解緩慢。菌落形態為圓形或不規則形，菌落直徑2~4mm，邊緣粗 糙。菌落表面粗糙褶皺，白色不透明。最適生長溫度為28~30°C，最適生長pH在5.5到8.5之 間。該種可產生多肽抗菌素，一個菌株可產生一種或多種抗菌素，釋放對菌體有溶菌作用的 酶。
[0004] 蠶豆醬是以蠶豆等為原料發酵釀制而成的保持蠶豆醬原形的半流動粘稠體或半 固態調味品。蠶豆醬在我國有著悠久的歷史，營養豐富，味道鮮美，有助消化，增進食欲，因 此深受廣大消費者的歡迎。然而，在蠶豆醬的發酵制備過程中，常因醬醅中有害微生物的繁 殖，而破壞發酵過程，影響醬體的風味，甚至產生不利于身體健康的有害物質。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
[0006] 所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，已于2016年1月21日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 12090,保藏地址為北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0007] 本發明所述的枯草芽孢桿菌分離自安徽某知名醬品傳統方法釀制的醬醅，該菌株 具有典型特征的M13-PCR指紋，即菌株專一性的特征指紋，如圖1所示；測序分析，其16s rDNA序列基因型如SEQ ID N0.1所示，NCBI登錄號為KT982215。
[0008]所述枯草芽孢桿菌對蠟狀芽孢桿菌以及酵母菌具有較明顯的抑制作用。其基因組 內存在編碼細菌素 Subtilosin以及制磷脂菌素 Plipastatin的基因。
[0009] 所述枯草芽孢桿菌為從風味口感較佳的傳統方法釀制的豆瓣醬醬醅中篩選得到 的，其保藏條件如下:從生長良好的LB培養基平板中取單菌落移入新鮮的液體LB培養基中， 37 °C搖床培養24h，取1.3mL菌液移入盛有0.5mL無菌甘油（40 %，v/v)的甘油管中，放-80°C 冰箱保存。
[0010] 所述LB培養基為：蛋白胨1%;酵母粉0.5%;NaCl 1%;ρΗ自然。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌的培養條件為:將甘油管保藏的枯草芽孢桿菌接入LB液體培養 基，在37°C、180rpm搖瓶培養24h即可到達對數期中后期。
[0012] 本發明還提供了一種所述枯草芽孢桿菌的應用，用于抑制發酵過程中醬醅中蠟狀 芽孢桿菌等潛在病原菌的生長。
[0013] 本發明提供的枯草芽孢桿菌是蠶豆醬發酵過程中的無害菌，對醬醅中有害微生物 的抑制有一定的作用，對醬醅中微生物組成以及病原菌的抑制有著深刻的影響，可用于抑 制豆瓣醬生產過程中的有害菌。
[0014] 生物材料保藏
[0015] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，已于2016年1月21日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 12090,保藏地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
【附圖說明】
[0016] 圖 1 Rep-PCR(M13-PCR)擴增指紋圖譜，M:DL 10000marker，1.12:樣品。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1枯草芽孢桿菌的篩選
[0018]從傳統發酵豆瓣醬60天左右的醬醅中取lg樣品加入到9mL無菌水中，輕微振蕩制 成懸濁液，將懸濁液梯度稀釋，涂布于LB平板，37°C好氧培養24至48h。挑取白色扁平有褶皺 的單菌落反復進行平板劃線分離，重復三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。
[0019] 鑒定主要通過：1)菌落特征觀察：用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在2~4mm之間， 圓形或不規則，表面粗糙有褶皺，白色不透明等符合枯草芽孢桿菌菌落特征的菌株。2)個體 形態觀察：用光學顯微鏡革蘭氏染色觀察。挑選桿狀、革蘭氏陽性的菌株。將滿足鑒定條件 的菌株挑出甘油管保藏。
[0020] 以1~2 %接種量取-80 °C甘油貯存液接種于LB培養基中，37 °C振蕩靜置培養24h。 取適量培養液離心211^11(4000印111，4°(：)，棄盡上清液，得到適量菌體，用(^48法提取基因組 DNA。用細菌通用引物對上游引物27F擴增16s rDNA，反應條件為:94°C預變性3min后進入以 下循環：94°C變性4〇8,56°(：退火358,72°(：延伸8〇8,30個循環 ；72°(：延伸1〇1^11。經1%瓊脂糖 凝膠電泳鑒定結果良好。將擴增產物寄送上海生工基因測序，如SEQ ID NO. 1所示，在NCBI 網站上進行BLAST序列比對，確定為枯草芽孢桿菌。
[0021] 實施例2枯草芽孢桿菌CGMCC No. 12090對醬醅中蠟狀芽孢桿菌的抑制（濾紙片 法）
[0022]該實驗所用的培養基為LB培養基:蛋白胨1%;酵母粉0.5%;NaCl 1%;ρΗ自然。三 角瓶分裝，裝液量40mL，121°C滅菌，20min。固體LB瓊脂含量為2%。
[0023]以1 %接種量取-80 °C甘油貯存液接種于新鮮LB液體培養基，37 °C搖床培養24小 時，轉速180rpm。接著以2 %接種量傳代培養，培養24h左右可用作實驗菌。實驗所用蠟狀芽 孢桿菌活化及傳代過程同上。傳代后的實驗菌(枯草芽孢桿菌)和指示菌(蠟狀芽孢桿菌）的 菌濃均在10 8CFU/mL左右。將指示菌稀釋至106級別，均勻涂布于LB平板，用直徑為1.5cm的濾 紙片蘸取實驗菌菌液，輕輕放置于涂有指示菌的LB平板上，所有操作均在無菌環境中進行。 將LB平板放置于37°C培養箱中培養24h即可觀察實驗結果。實驗結果見附表1。
[0024] 表1枯草芽孢桿菌061〇：如.12090抑菌譜
[0025]
[0026] 注:指示菌株均為醬醅中分離所得；
[0027]沒有抑菌圈；
[0028] +:抑菌圈直徑2~3cm;
[0029] ++:抑菌圈直徑大于3cm;
[0030] 實施例3應用于傳統發酵蠶豆醬
[0031] CGMCC No.l2090Bacillus subtilis HYM05菌株在LB液體培養基中培養 1 天，作為 種子液。將種子液接種至醬醅，發酵過程中蠟狀芽孢桿菌的數量變化有明顯區別，對照為未 接種種子液的醬醅，未接種所述芽孢桿菌的醬體中檢測到較大數量(約2.55X 104CFU/g)的 蠟狀芽孢桿菌，而接種的醬體中蠟狀芽孢桿菌數量維持在一個較低的水平（約1.32 X 102CFU/g)。
[0032] 可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發 明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保 護范圍。
【主權項】
1. 一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2016年1月21日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 12090,保藏地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。2. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在抑制豆瓣醬發酵過程中蠟狀芽孢桿菌的生長中的 應用。3. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在抑制豆瓣醬發酵過程中酵母菌的生長中的應用。4. 權利要求1所述枯草芽孢桿菌的培養方法，其特征在于，是將甘油管保藏的枯草芽孢 桿菌接入LB液體培養基中，在37°C、轉速180rpm的搖床中振蕩培養24h至對數中后期。5. 應用權利要求1所述枯草芽孢桿菌發酵豆瓣醬的方法，其特征在于，是將枯草芽孢桿 菌種子液在豆瓣醬發酵過程的中前期添加入到醬醅中。6. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在抑制蠟狀芽孢桿菌生長中的應用。7. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在抑制酵母生長中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一株枯草芽孢桿菌及其應用，屬于發酵技術領域。所述枯草芽孢桿菌已于2016年1月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.12090，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。該菌株具有較好的抑菌性能，能有效地控制豆瓣醬發酵過程中蠟狀芽孢桿菌的生長，而蠟狀芽孢桿菌是一種潛在病原菌。CGMCC NO.1209020160121
【IPC分類】A23L11/00, C12N1/20, C12R1/125
【公開號】CN105647836
【申請號】
【發明人】朱林江, 李崎, 范子豪, 鄭飛云, 王金晶, 李永仙, 劉春鳳, 王佳琪
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月16日