一種復配菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種復配菌及其應用。本發明公開的一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens），其保藏編號為CGMCC?No.7364。本發明篩選出對營養條件要求不高的三種凈化水質的細菌進行復配使用，克服了調水產品投入水體中由于營養條件不均衡造成投入到水體中的凈化水質細菌生長緩慢或者死亡的弊端，從而起到迅速凈化水質的作用。
【專利說明】一種復配菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復配菌及其應用。
【背景技術】
[0002]在水產養殖中后期，由于過量投喂飼料或水質污染造成養殖水體中氨氮和亞硝酸鹽含量過高，對養殖動物造成嚴重危害。而現在市售的一些調節水質的產品見效慢或者沒有效果，給養殖戶造成不必要的經濟損失。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種復配菌及其應用。
[0004]本發明提供的一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),其保藏編號為 CGMCC N0.7364。
[0005]一種復配菌也屬于本發明的保護范圍，由保藏編號為CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏編號為CGMCC N0.7365的鹽田鹽單胞菌(Halomonas campisalis)組成。
[0006]—種復配菌也屬于本發明的保護范圍，由保藏編號為CGMCC N0.7363的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri )、保藏編號為CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏編號為 CGMCC N0.7365 的鹽田鹽單胞菌(Halomonascampisalis)組成。
[0007]上述復配菌中，所述保藏編號為CGMCC N0.7363的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri )、保藏編號為 CGMCC N0.7364 的解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏編號為CGMCC N0.7365的的鹽田鹽單胞菌(Halomonas campisalis)的數量比為1:1:1。
[0008]一種消除亞硝酸鹽的制劑也屬于本發明的保護范圍，該制劑由上述任一所述的復配菌和碳源組成。
[0009]上述制劑中，所述復配菌中的各菌與所述碳源的比例均為IO1tlCfu:lg。
[0010]上述任一所述的制劑中，所述碳源為葡萄糖。
[0011]上述任一所述的菌、上述任一所述的制劑在降低水體中亞硝酸鹽和/或氨氮含量中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0012] 上述應用中,所述水體為魚塘水體。
[0013]本發明篩選出對營養條件要求不高的三種凈化水質的細菌進行復配使用，克服了調水產品投入水體中由于營養條件不均衡造成投入到水體中的凈化水質細菌生長緩慢或者死亡的弊端，從而起到迅速凈化水質的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為亞硝酸鹽含量檢測曲線I。[0015]圖2為亞硝酸鹽含量檢測曲線2。
【具體實施方式】[0016]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0017]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0018]氯化銨緩沖溶液按照如下方法制備:在1000mL容量瓶中加入500mL蒸餾水，加入20mL濃鹽酸，混勻，加入50mL氨水，用蒸餾水定容至刻度，調節pH值至9.6-9.7之間。
[0019]60%乙酸溶液按照如下方法制備:將600mL冰乙酸加入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1L。
[0020]對氨基苯磺酸溶液按照如下方法制備:稱取5g對氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶保存，一周內有效。
[0021]N-1萘基乙二胺溶液(lg/L)按照如下方法制備:稱取0.1g N-1萘基乙二胺，加少量60%乙酸溶液溶解并用蒸餾水定容至IOOmL,混勻后置棕色瓶中，在冰箱內保存，I周內有效。
[0022]顯色劑按照如下方法制備:臨用前將N-1萘基乙二胺溶液(lg/L)和對氨基苯磺酸溶液等體積混合。
[0023]亞硝酸鈉標準溶液按照如下方法制備:稱取250.0mg經115°C士 5°C烘至恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，將溶液移入500mL容量瓶中，加IOOmL氯化銨緩沖液，加水稀釋至刻度，混勻后在4°C避光保存，此溶液每毫升相當于500 μ g亞硝酸鈉。
[0024]亞硝酸鈉標準工作液:吸取亞硝酸鈉標準溶液1.0OmL,置于IOOmL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當于5.0μ g亞硝酸鈉。
[0025]實施例中亞硝酸鹽含量檢測方法如下:
[0026]一、標準曲線的繪制
[0027]分別吸取亞硝酸鈉標準工作液10 μ L、15 μ L、20 μ L、40 μ L、60 μ L、80 μ L、100 μ L加入96孔板，分別在各孔中加入氯化銨緩沖溶液與60%乙酸混合液(體積比2:1) 150 μ L，水90 μ L，顯色劑100 μ L，混勻后避光反應25min。采用酶標儀在540nm下測定各反應液的吸光度。以吸光度為橫坐標，各溶液中所含亞硝酸鈉的質量(μ g)為縱坐標，繪制標準曲線。
[0028]二、樣品測定
[0029]取40 μ L離心后的養殖水體樣品上清液，加入96孔板中，分別在各孔中加入氯化銨緩沖溶液與60%乙酸混合液(體積比2:1) 150 μ L，水90 μ L，顯色劑100 μ L，混勻后避光反應25min。采用酶標儀在540nm下測定反應液的吸光度。
[0030]三、根據公式I進行樣品中亞硝酸鹽含量計算
[0031]X=mX 1000/40 (公式 I)
[0032]式中:
[0033]X為所測樣品中亞硝酸鹽的濃度(mg/L)；
[0034]m為將所測樣品吸光度帶入步驟一的標準曲線中計算得出的40 μ L樣品中亞硝酸
鹽絕對含量。
[0035]奧尼羅非魚購自北京市昌平區小湯山奧尼羅非魚養殖基地。
[0036]0.85%的氯化鈉水溶液按照如下方法配制:稱取0.85g氯化鈉，用蒸餾水溶解并定容至100ml。
[0037]P/oBTB酒精溶液按照如下方法制備:lg麝香草酚溶于IOOmL無水乙醇中。
[0038]BTB選擇性培養基按照如下方法制備:KN03lg/L、KH2PO4lg/L, CaCl20.2g/L、MgS04lg/L、琥珀酸鈉(丁二酸鈉)8.5g/L，每升固體培養基另外加1%BTB酒精溶液1ml，調PH6.8-7.0。將上述成分按相應濃度用蒸餾水溶解并定容配制成IL溶液，作為備用培養基。
[0039]維氏鹽溶液:K2HP045g/L、MgS042.5g/L、NaC12.5g/L、FeSO4.7H200.05g/L、MnSO4.4H200.05g/L，余量為水。
[0040]氨氮培養基按照如下方法制備=NH4Cl0.4g/L、琥珀酸鈉2.17g/L、維氏鹽溶液50mL，將上述成分按相應濃度或體積用蒸餾水溶解并定容配制成IL溶液。
[0041]實施例1、菌的篩選及鑒定
[0042]一、施氏假單胞菌150-2[0043](一)從北京昌平養殖區、周邊縣市養殖水體和種植農作物的土樣中采集的436株好氧反硝化菌中篩選出施氏假單胞菌150-2
[0044]該種菌株可用LB培養基培養，培養基成分如下:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL,配制成IL液體培養基，pH7.0。37°C恒溫震蕩培養。
[0045]該菌的篩選過程如下:將從水樣和土樣中得到的436株細菌在BTB選擇性培養基中分離培養24h，挑取特異性單菌落，接入氨氮培養基馴化，然后用氨氮培養基擴大培養，離心測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮含量等指標，選取降解氨氮、亞硝酸氮能力較好的菌株。
[0046]150-2具有較高的反硝化能力，在以多種氮作為氮源時無亞硝酸鹽及氨氮的積累，在多種碳源下均具有良好的去除亞硝酸鹽能力，同時在50L魚池模擬應用試驗中對亞硝酸鹽的控制能力較好。
[0047](二)150-2經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心鑒定并保藏
[0048]鑒定方法為16SDNA序列分析:以提取的150-2基因組DNA為模板，以擴增細菌16SrDNA的通用引物為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物測序，并將測序結果在GenBank數據庫中進行 BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對,確定其種屬。
[0049]150-2經鑒定為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri),該菌株于2013年03月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC N0.7363。
[0050]二、解淀粉芽孢桿菌150-4
[0051](一)從北京市昌平區某畜禽養殖場養殖動物的糞便中分離得到的406株芽孢桿菌中篩選出解淀粉芽孢桿菌150-4
[0052]150-4來源于北京市昌平區某畜禽養殖場養殖動物的糞便。
[0053]該種菌株可用LB培養基培養，培養基成分如下:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉log、蒸餾水1000mL,配制成IL液體培養基，pH7.0。37°C恒溫震蕩培養。
[0054]該菌的篩選過程如下:將從北京市昌平區某畜禽養殖場養殖動物的糞便中分離得到的406株芽孢桿菌在BTB選擇性培養基中分離培養24h，挑取特異性單菌落，接入氨氮培養基馴化，后用氨氮培養基擴大培養，離心測定氨氮、硝酸氮、亞硝氮含量等指標，選取降解氨氮、亞硝酸氮能力較好的菌株。
[0055]1、芽孢桿菌的初篩[0056]采用養魚廢水作為培養基，對上述406株芽孢桿菌在養殖廢水中作用時間為48h，每隔6h取水樣檢測亞硝酸鹽及氨氮含量，進行初步篩選。
[0057]使亞硝酸鹽濃度降低的菌株共119株，其中亞硝酸鹽去除率100%的有95株，而同時具有100%去除亞硝酸鹽的去除率及氨氮去除能力的菌株為19株，如表1所示。
[0058]表1芽孢桿菌的初篩
[0059]
【權利要求】
1.一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),其保藏編號為CGMCCN0.7364。
2.一種復配菌，由保藏編號為CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和保藏編號為 CGMCC N0.7365 的鹽田鹽單胞菌(Halomonascampisalis)組成。
3.一種復配菌，由保藏編號為CGMCC N0.7363的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri )、保藏編號為 CGMCC N0.7364 的解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏編號為CGMCC N0.7365的鹽田鹽單胞菌(Halomonas campisalis)組成。
4.根據權利要求3所述的復配菌，其特征在于:所述復配菌中保藏編號為CGMCCN0.7363的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、保藏編號為CGMCC N0.7364的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和保藏編號為CGMCC N0.7365的的鹽田鹽單胞菌(Halomonascampisalis)的數量比為 1:1:1。
5.一種消除亞硝酸鹽的制劑，該制劑由權利要求3或4所述的復配菌和碳源組成。
6.根據權利要求5所述的制劑，其特征在于:所述復配菌中的各菌與所述碳源的比例均為 IO10Cfu:lg。
7.根據權利要求5或6所述的制劑，其特征在于:所述碳源為葡萄糖。
8.權利要求1-4任一所述的菌、權利要求5-7任一所述的制劑在降低水體中亞硝酸鹽和/或氨氮含量中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述水體為魚塘水體。
【文檔編號】C02F3/34GK103667122SQ201310613192
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】譙仕彥, 丁修良, 王煒宏, 鄭玉琦 申請人:北京龍科方舟生物工程技術有限公司