一種多功能模擬酶復合球的制備方法及其應用與流程

本發明屬于酶催化與環境毒物催化降解技術領域，涉及一種多功能模擬酶復合球的制備方法及其應用。

背景技術：

酶是重要的生物催化劑，具有專一性強、催化效率高、無污染等優良性能。絕大多數酶是大分子蛋白質，必須在溫和適宜的條件下才能發揮催化作用，在高溫、高離子濃度、強酸、強堿及部分有機溶劑中均不穩定，容易變性失活而降低其催化性能。為了解決這些問題，研究工作者們嘗試對天然酶進行修飾形成模擬酶以改良其催化性能。模擬酶是一類人工合成的非蛋白結構但是卻與天然酶具有相類似的催化活性的催化劑。并且，固定化修飾的酶穩定性有所增加,有一定的形狀和機械強度,可以裝填在反應器中長期使用,便于實現生產自動化和連續化。常見的酶的固定化有吸附、包埋、結合和交聯等方式。其中，包埋固定化法是近年來發展迅速的一種新興固定化技術，是把酶固定在聚合物材料的格子結構或微囊結構等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內與酶相接觸，并使其保持活性且能反復利用。常用的包埋固定化載體有瓊脂、明膠、海藻酸鈉（sa）、聚乙烯醇和丙烯酰胺。其中，海藻酸鈉是一種線性天然生物大分子多糖類，在單元糖環上具有羧基和羥基等功能基團，溫和條件下可與二價陽離子（如ca²⁺、zn²⁺）形成凝膠，并且由于海藻酸可生物降解、生物相容性和黏附性好而廣泛應用。藥學中利用海藻酸鈉的成膜性制備微囊，利用其溶解度特性、凝膠和聚電解質作為緩釋制劑的載體、包埋劑或生物粘附劑等。

血紅素（hemin）作為辣根過氧化物酶（hrp）等血紅素類蛋白質的催化活性中心，是由二價鐵離子鑲嵌在原卟啉環中構成的一種小分子鐵卟啉化合物，能夠催化h2o2氧化底物反應產生顏色變化，表現出類過氧化物酶的活性。然而，血紅素本身催化活性低且不溶于水，在水溶液中易聚集成活性很低的二聚體，在氧化性媒介中結構易被破壞而致催化活性減弱。為了解決這些問題，研究工作者們嘗試對血紅素進行化學修飾以改良其催化性能。近年來，隨著納米技術的高速發展，貴金屬納米材料（如納米金）由于粒徑小、表面活性高和比表面積大而被廣泛用作催化劑。目前，對金納米顆粒的類過氧化物酶催化性能的研究已顯成熟，特別是，采用納米金顆粒修飾過氧化物酶以提高其催化性能的研究已被廣泛報道，一些經過生物礦化生成的小尺寸（小于5nm）金納米顆粒不僅本身具有一定的過氧化物酶活性，而且可接近或深入被修飾的過氧化物酶的催化活性中心，極大地發揮其納米導線功能，促進酶催化反應的電子傳輸能力。

與此同時，磁性四氧化三鐵（fe3o4）納米材料因具有量子尺寸、小尺寸、表面和宏觀量子隧道效應，以及獨特的磁性可回收利用性質，在現代社會越來越受到人們的關注，在物質分離、催化及環境毒物降解領域發揮極大作用。而且這些納米材料制備簡單、廉價、穩定性高，且具有抗變形性和可回收利用性，在酶催化降解應用中比天然酶更具有優勢。另外，球形石墨烯（sg）因具有優良的機械性質、特殊的單原子層平面二維結構和超高的比表面積，廣泛用于結合一些納米材料形成復合催化劑，提高對污染物的吸附能力。

技術實現要素：

本發明通過模擬天然酶的催化原理，提供一種多功能模擬酶復合球的制備方法，制備出一種具有顯著酶催化活性和高吸附降解性的磁性模擬酶復合球（sa-hemin-au-sg-fe3o4）。具有催化活性高、穩定性好、可回收利用等優點。

同時，本發明還提供了上述多功能模擬酶復合球的應用，將該模擬酶復合球用于一些環境有機毒物，如苯酚（ph）、亞甲基藍（mb）和羅丹明b（rb）等的快速催化、吸附降解。

本發明的技術方案如下：

一種多功能模擬酶復合球的制備方法，在堿性條件下，以血紅素（hemin）為還原劑和穩定劑，與氯金酸（haucl4）混合后礦化反應，形成具有高催化活性的金納米簇模擬酶（hemin-au），再與球形石墨烯（sg）和四氧化三鐵（fe3o4）混合反應后，加入海藻酸鈉（sa）與鈣離子進行包埋處理，得到多功能模擬酶復合球（sa-hemin-au-sg-fe3o4）。

上述一種多功能模擬酶復合球的制備方法，步驟包括：

1）室溫條件下，將fecl3·6h2o溶解于乙二醇中，溶解濃度0.157～0.252m，攪拌，待完全溶解后加入乙酸鈉，乙酸溶解濃度0.763～0.851m，繼續攪拌30min后，轉移到高壓釜中，調節溫度為200℃，反應8h，然后冷卻至室溫，用磁鐵分離，收集磁鐵吸附的固體，用水和乙醇洗滌，在60℃下烘干12h，得到中空納米球fe3o4，備用；

2）室溫條件下，將血紅素溶解于0.01m的naoh水溶液中，配制濃度為0.25～2.0mg/ml的血紅素溶液，然后將血紅素溶液與10.0mm的氯金酸水溶液等體積混合，攪拌下緩慢滴加1.0m的naoh水溶液，調節溶液ph為10.0，37℃水浴反應8h，隨后加入球形石墨烯，加入濃度為2.5～7.5mg/ml，加入步驟1）制得的中空納米球fe3o4，加入濃度為7.5～37.5mg/ml，0～65℃攪拌反應6.0～18h，制得hemin-au-sg-fe3o4復合物；

3）將步驟2）制得的hemin-au-sg-fe3o4復合物加入到0.5～4.5wt%的海藻酸鈉水溶液（5.0ml）中，分散濃度以血紅素濃度計算為0.025～0.2mg/ml，超聲30min混合均勻后，吸取溶液，滴入到1.0～5.5wt%的氯化鈣水溶液中，形成圓形小顆粒，然后靜置1.5h使其固定化，再用超純水洗滌，低溫干燥，得到sa-hemin-au-sg-fe3o4磁性模擬酶復合球，即多功能模擬酶復合球。

進一步地，步驟1）中，fecl3·6h2o溶解于乙二醇中，溶解濃度優選0.183m；乙酸溶解濃度優選0.804m。

進一步地，步驟2）中，血紅素溶液濃度優選為1.0mg/ml，球形石墨烯加入濃度優選5mg/ml、中空納米球fe3o4加入濃度優選25mg/ml。

進一步地，步驟2）中，優選37℃攪拌反應12h。

進一步地，步驟3）中，海藻酸鈉水溶液濃度優選2.0wt%。

進一步地，步驟3）中，優選用1.0ml的注射器吸取溶液，以每秒一滴的速度滴入到20.0ml的氯化鈣水溶液中；所述的氯化鈣水溶液濃度優選3.0wt%。

所述的制備方法中，室溫為20～25℃。

本發明所述多功能模擬酶復合球，適用于催化降解環境有機毒物，尤其適用于苯酚（ph）、亞甲基藍（mb）和羅丹明b（rb）等的快速催化、吸附降解。

所述多功能模擬酶復合球在催化降解環境有機毒物的應用，方法為：將多功能模擬酶復合球直接加入到含有環境有機毒物的水溶液中，震蕩反應0.5～2h。

進一步地，多功能模擬酶復合球加入濃度優選5mg/ml；光照條件下震蕩反應優選1h。

本發明功能模擬酶復合球制備方法，通過模擬天然酶的催化原理，首先在堿性條件下以hemin作為還原劑和穩定劑，將氯金酸（haucl4）礦化形成具有高催化活性的金納米簇模擬酶（hemin-au），然后將該模擬酶與sg和fe3o4“一鍋式”混合反應，形成hemin-au-sg-fe3o4中間體復合物，進而通過安全、環保以及工藝優良的天然高分子材料sa包埋，原位合成催化活性高、穩定性好、可回收利用的磁性模擬酶復合球（sa-hemin-au-sg-fe3o4）。并對其中hemin-au復合物的形貌進行透射電鏡（tem，圖1）表征。然后，利用光度分析法一方面研究了該磁性模擬酶復合球的制備條件，另一方面研究了該復合物的類過氧化物酶催化活性；研究表明，該復合材料一方面由于sg和fe3o4具有巨大的表面積和內部空腔，會吸附小顆粒分子在其表面上，另一方面由于hemin、sg、fe3o4分子均具有六元環結構，容易形成π-π共軛效應，使它們之間的聯系更加緊密，加速電子的傳遞和轉移，從而提高了模擬酶的催化活性，可用于一些環境有機毒物如苯酚（ph）以及染料如亞甲基藍（mb）和羅丹明b（rhb）的快速催化、吸附降解中。

本發明與現有的模擬酶復合球相比，其主要優勢包括：

1）以hemin作為還原劑和穩定劑，實現金的原位生物礦化，形成具有顯著酶催化功能的hemin-au復合物，不涉及復雜光電儀器使用，具有操作簡單、成本低廉等優點；

2）sg特殊的單原子層平面二維結構和超高的比表面積，吸附連接豐富的hemin-au復合物在其表面，顯著增強單位體積內酶分子的個數，從而增強復合物催化性能；

3）hemin、sg、fe3o4分子均具有六元環結構，容易形成π-π共軛結構，使它們之間的聯系更加緊密，加速電子的傳遞和轉移，另外，sg、fe3o4本身具有一些類過氧化物酶活性，與hemin-au結合后，使得整體活性增強；

4）選用sa包覆，一方面sa具有豐富的羧基和羥基等功能基團，易與hemin中的羧基結合實現酶的固定化包埋；另一方面，sa可生物降解、生物相容性和黏附性好，不僅環境無毒，而且可以很好的黏附在磁性顆粒表面；另外，fe3o4具有磁性，可回收利用，回收操作簡便快捷，使其更廣泛的應用于不同領域、不同環境中。

附圖說明

圖1(a)hemin-au復合物的透射電鏡tem表征；(b)hemin-au復合物紫外表征圖；

圖2(a)(a)sa，(b)hemin，(c)hemin-au，(d)hemin-au-sg和(e)hemin-au-sg-fe3o4催化活性比較（插圖為反應產物顏色的比較）；(b)海藻酸鈉固定化的磁性模擬酶實物圖；

圖3合成sa-hemin-au-sg-fe3o4顆粒的主要條件的優化，(a)naoh用量的優化，(b)合成時間的優化，(c)sa的用量的優化和(d)cacl2的用量的優化顆粒與tmb-h2o2顯色反應是溫度條件的優化；

圖4sa-hemin-au-sg-fe3o4顆粒與tmb-h2o2顯色反應條件的考察，(a)ph條件的考察，(b)反應溫度的考察；

圖5sa-hemin-au-sg-fe3o4顆粒(a)儲存穩定性和(b)催化活性的考察；

圖6以(a)sa球為對照，sa-hemin-au-sg-fe3o4球在(b)黑暗，(c)室內，(d)太陽光下分別催化降解亞甲基藍時(a)亞甲基藍的吸光度隨著時間變化的曲線和(b)染料催化降解率；

圖7以(a)sa球為對照，sa-hemin-au-sg-fe3o4球在(b)黑暗，(c)室內，(d)太陽光下分別催化降解羅丹明b時（a）羅丹明b的吸光度隨著時間變化的曲線和（b）染料催化降解率；

圖8以(a)sa球為對照，sa-hemin-au-sg-fe3o4球在(b)黑暗，(c)室內，(d)太陽光下分別催化降解苯酚時(a)苯酚的吸光度隨著時間變化的曲線和(b)有機毒物催化降解率。

具體實施方式

下面通過實施例進一步的描述本發明技術方案。這些描述并不是對本發明內容作進一步的限定。凡對本發明內容所作的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。

下述實施例中：氯化血紅素，純度為98%；氯金酸，含金量≥47.8%；海藻酸鈉、氯化鈣、氫氧化鈉，30%過氧化氫、苯酚、亞甲基藍和羅丹明b均為分析純；

若無特別說明，室溫為20～25℃；溶液均由二次去離子水配制。

實施例1

一種多功能模擬酶復合球的制備方法，各原料的配比如下：

haucl4：10.0mm，1.0ml

hemin：0.25mgml^-1，1.0ml

naoh：1.0m，105μl

sg：5.0mg

sa：0.5wt%，1.0ml

fe3o4：15.0mg

cacl2：1.0wt%，20.0ml

其步驟為：

1）室溫條件下，將fecl3·6h2o（1.73g）溶解于乙二醇（35ml）中，溶解濃度0.183m，磁力攪拌，待完全溶解后加入3.83g乙酸鈉，乙酸鈉在溶液中0.804m，繼續攪拌30min后轉移到高壓釜中，調節溫度為200℃，反應8h，然后冷卻至室溫，用磁鐵分離，收集磁鐵吸附的固體，用水和乙醇洗滌，在60℃下烘干12h，得到中空納米球fe3o4，備用；

2）室溫條件下，將血紅素溶解于0.01m的naoh水溶液中，配制濃度為0.25mg/ml的血紅素溶液，然后將血紅素溶液與1.0ml、10.0mm的氯金酸水溶液等體積混合，磁力攪拌下緩慢滴加105μl、1.0m的naoh水溶液，調節溶液ph為10.0，37℃水浴反應8h，隨后加入5.0mg球形石墨烯，15.0mg步驟1）制得的中空納米球fe3o4，0℃一鍋式攪拌反應6.0h，制得hemin-au-sg-fe3o4復合物；

3）將步驟2）制得的hemin-au-sg-fe3o4復合物加入0.5wt%的海藻酸鈉水溶液5.0ml中（分散濃度以血紅素濃度計算為0.025～0.2mg/ml），超聲30min混合均勻后，用1.0ml的注射器吸取溶液，將其以每秒一滴的速度滴入到20.0ml、1.0wt%的氯化鈣水溶液中，滴入后會立刻形成圓形小顆粒，然后靜置1.5h使其固定化，再用超純水洗滌，低溫干燥，得到sa-hemin-au-sg-fe3o4磁性模擬酶復合球，即多功能模擬酶復合球。

實施例2

一種多功能模擬酶復合球的制備方法，各原料的配比如下：

haucl4：10mm，1.0ml

hemin：0.60mgml^-1，1.0ml

naoh：1.0m，115μl

sg：10.0mg

sa：1.0wt%，1.0ml

fe3o4：25mg

cacl2：1.5wt%，20ml

其步驟為：

1）室溫條件下，將fecl3·6h2o（1.73g）溶解于乙二醇（35ml）中，溶解濃度0.183m，磁力攪拌，待完全溶解后加入3.83g乙酸鈉，乙酸鈉在溶液中0.804m，繼續攪拌30min后轉移到高壓釜中，調節溫度為200℃，反應8h，然后冷卻至室溫，用磁鐵分離，收集磁鐵吸附的固體，用水和乙醇洗滌，在60℃下烘干12h，得到中空納米球fe3o4，備用；

2）室溫條件下，將血紅素溶解于0.01m的naoh水溶液中，配制濃度為0.60mg/ml的血紅素溶液，然后將血紅素溶液與1.0ml、10.0mm的氯金酸水溶液等體積混合，磁力攪拌下緩慢滴加115μl、1.0m的naoh水溶液，調節溶液ph為10.0，37℃水浴反應8h，隨后加入10.0mg球形石墨烯、25.0mg步驟1）制得的中空納米球fe3o4，25℃一鍋式攪拌反應8.0h，制得hemin-au-sg-fe3o4復合物；

3）將步驟2）制得的hemin-au-sg-fe3o4復合物加入1.0wt%的海藻酸鈉水溶液5.0ml中（分散濃度以血紅素濃度計算為0.025～0.2mg/ml），超聲30min混合均勻后，用1.0ml的注射器吸取溶液，將其以每秒一滴的速度滴入到20.0ml、1.5wt%的氯化鈣水溶液中，滴入后會立刻形成圓形小顆粒，然后靜置1.5h使其固定化，再用超純水洗滌3遍，低溫干燥，得到sa-hemin-au-sg-fe3o4磁性模擬酶復合球，即多功能模擬酶復合球。

實施例3

一種多功能模擬酶復合球的制備方法，各原料的配比如下：

haucl4：10.0mm，1.0ml

hemin：1.0mgml^-1，1.0ml

naoh：1.0m，125μl

sg：12.0mg

sa：2.5w%，1.0ml

fe3o4：35.0mg

cacl2：3.0w%，20ml

其步驟為：

1）室溫條件下，將fecl3·6h2o（1.73g）溶解于乙二醇（35ml）中，溶解濃度0.183m，磁力攪拌，待完全溶解后加入3.83g乙酸鈉，乙酸鈉在溶液中0.804m，繼續攪拌30min后轉移到高壓釜中，調節溫度為200℃，反應8h，然后冷卻至室溫，用磁鐵分離，收集磁鐵吸附的固體，用水和乙醇洗滌，在60℃下烘干12h，得到中空納米球fe3o4，備用；

2）室溫條件下，將血紅素溶解于0.01m的naoh水溶液中，配制濃度為1.0mg/ml的血紅素溶液，然后將血紅素溶液與1.0ml、10.0mm的氯金酸水溶液等體積混合，磁力攪拌下緩慢滴加125μl、1.0m的naoh水溶液，調節溶液ph為10.0，37℃水浴反應8h，隨后加入12.0mg球形石墨烯，35.0mg步驟1）制得的中空納米球fe3o4，55℃一鍋式攪拌反應10.0h，制得hemin-au-sg-fe3o4復合物；

3）將步驟2）制得的hemin-au-sg-fe3o4復合物加入2.5wt%的海藻酸鈉水溶液5.0ml中（分散濃度以血紅素濃度計算為0.025～0.2mg/ml），超聲30min混合均勻后，用1.0ml的注射器吸取溶液，將其以每秒一滴的速度滴入到20.0ml、3.0wt%的氯化鈣水溶液中，滴入后會立刻形成圓形小顆粒，然后靜置1.5h使其固定化，再用超純水洗滌，低溫干燥，得到sa-hemin-au-sg-fe3o4磁性模擬酶復合球，即多功能模擬酶復合球。

實施例4

一種多功能模擬酶復合球的制備方法，各原料的配比如下：

haucl4：10.0mm，1.0ml

hemin：1.0mgml^-1，1.0ml

naoh：1.0m，120μl

sg：10.0mg

sa：2.0wt%，1.0ml

fe3o4：50.0mg

cacl2：3.0wt%，20ml

其步驟為：

1）室溫條件下，將fecl3·6h2o（1.73g）溶解于乙二醇（35ml）中，溶解濃度0.183m，磁力攪拌，待完全溶解后加入3.83g乙酸鈉，乙酸鈉在溶液中0.804m，繼續攪拌30min后轉移到高壓釜中，調節溫度為200℃，反應8h，然后冷卻至室溫，用磁鐵分離，收集磁鐵吸附的固體，用水和乙醇洗滌，在60℃下烘干12h，得到中空納米球fe3o4，備用；

2）室溫條件下，將血紅素溶解于0.01m的naoh水溶液中，配制濃度為1.0mg/ml的血紅素溶液，然后將血紅素溶液與1.0ml、10.0mm的氯金酸水溶液等體積混合，磁力攪拌下緩慢滴加120μl、1.0m的naoh水溶液，調節溶液ph為10.0，37℃水浴反應8h，隨后加入10.0mg球形石墨烯，50.0mg步驟1）制得的中空納米球fe3o4，37℃一鍋式攪拌反應12.0h，制得hemin-au-sg-fe3o4復合物；

3）將步驟2）制得的hemin-au-sg-fe3o4復合物加入2.0wt%的海藻酸鈉水溶液5.0ml中（分散濃度以血紅素濃度計算為0.025～0.2mg/ml），超聲30min混合均勻后，用1.0ml的注射器吸取溶液，將其以每秒一滴的速度滴入到20.0ml、3.0wt%的氯化鈣水溶液中，滴入后會立刻形成圓形小顆粒，然后靜置1.5h使其固定化，再用超純水洗滌，低溫干燥，得到sa-hemin-au-sg-fe3o4磁性模擬酶復合球，即多功能模擬酶復合球。

將在實施例4條件下所制得的模擬酶的拓撲結構及相關酶活性和環境穩定性進行考察。

如圖1a為合成的金納米簇的透射電鏡圖（tem），從圖中可知所制備的hemin-au納米粒子粒徑均勻，分散性較好，平均尺寸大小為2.0-3.0nm。已有研究表明，金納米顆粒的尺寸小于5.0nm時具有高效的催化活性，即金納米簇的“小尺寸效應”,可望賦予hemin-au較高的催化活性。圖1b為hemin-au的紫外吸收圖，由圖可知，hemin-au在330nm和385nm處有兩個吸收峰，分別對應au和hemin的特征吸收峰，進一步證明hemin-au模擬酶的成功合成。

圖2系統研究了hemin、hemin-au、hemin-au-sg和sa-hemin-au-sg-fe3o4的催化性能。由圖2a可知，hemin、hemin-au、hemin-au-sg和sa-hemin-au-sg-fe3o4對應的催化產物的吸光度值逐漸增大，即催化活性依次升高，sa-hemin-au-sg-fe3o4催化活性最高。原因可能是：一方面，hemin-au具有較hemin高的催化活性，另一方面，納米sg、fe3o4本身就具有類過氧化物酶的活性，將其與hemin-au和sg一鍋反應，其巨大的表面積和內部空腔，會吸附小顆粒分子到其表面，并且hemin、sg、fe3o4分子都具有六圓環結構，容易形成π-π共軛結構，這種共軛結構會使它們之間的聯系更加緊密，加速了電子的傳遞和轉移。圖2b為使用sa包埋模擬酶復合球形成的顆粒，可以看出制得的顆粒為球形，表面光滑，大小均勻。由于顆粒中有磁性fe3o4，可用磁鐵回收,重復利用,回收操作比較簡便快捷，可使其更廣泛的應用于不同領域、不同環境中。

另外，對合成過程進行了條件優化。如圖3a所示，合成sa-hemin-au-sg-fe3o4最適宜的堿量為100mm，過酸或過堿會影響固定化的效果。圖3b考察了制備小球時的固定化時間，結果表明最適宜的固定花時間為1.5小時。這可能是由于固定化時間短，sa與鈣離子反應不充分，sa形成的膜不穩固，容易破裂；而固定化時間太長會使sa收縮嚴重，阻斷sa包裹的分子從里面出來的通道，影響催化反應。另外，sa作為模擬酶復合球的載體，對模擬酶復合球的活性有顯著的影響。其濃度太小，凝膠的孔徑較大，顆粒容易破裂使模擬酶復合球流失，導致酶活性降低；其濃度過大，凝膠的孔徑越小，酶與底物進出的通道小，影響酶與底物的結合，使顆粒催化活性較小，所以sa的最佳濃度為2.0w%，如圖3c所示。圖3d考察了氯化鈣濃度的影響，由圖可知，氯化鈣濃度過大，產品顆粒表面會布滿鈣離子，堵塞凝膠的孔徑，切斷酶與底物進出的通道，另外，鈣離子會與hemin反應使其活性降低；鈣離子濃度太低會使凝膠強度太小，導致酶流失，所以適宜的鈣離子濃度為3.0w%。

圖4為對模擬酶復合球的催化反應條件的優化。由圖4a可知，ph值對模擬酶復合球的活性有較大的影響。原因可能是，顆粒表面的sa在酸性條件下形成不溶于水的海藻酸，使顆粒表面收縮變緊，孔徑變小，阻斷了顆粒內部酶的出入，導致其催化活性降低；而隨著ph值的增加，顆粒表面的sa會逐漸溶解，孔徑變大，加速sa-hemin-au-sg-fe3o4與反應底物的接觸，催化活性增強。但是ph值過高，會使孔徑過大，雖然會使其催化活性增大，但是會導致模擬酶復合球顆粒的破裂，使sa-hemin-au-sg-fe3o4完全流出。因此，過酸過堿都會影響顆粒活性，弱酸弱堿范圍內使用最好。同時，由圖4a看出，溫度過低或過高都會影響顆粒的活性，固定化顆粒發揮活性的適宜溫度為37°c。

圖5考察了模擬酶復合球的環境穩定性。由圖5a可知，將顆粒儲存在水中12個月，催化tmb-h2o2顯色的活性幾乎沒有太大改變。圖5b展示了固定化顆粒在催化tmb-h2o2顯色使用5次后，依然保持很高的催化活性。從而說明，sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球在水中具有很高的穩定性，模擬酶復合球可以重復利用。

實施例5多功能模擬酶復合球應用

將本發明實施例1制備的多功能模擬酶復合球用于環境有機毒物（ph）及染料（mb、rhb）的吸附與催化降解

以ph、mb和rhb為例，將該磁性模擬酶復合球用于環境污染物的降解研究，結果如圖6、圖7和圖8所示。如圖6所示，以sa小球作對比，將sa小球（0.25g）加入到mb溶液（10^-4m，50ml）中，由于sa小球內部多孔的結構，可以較容易的吸附大量小分子，所以mb溶液顏色逐漸變淺，sa小球顏色由透明變成藍色。同理，將sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球（0.25g）在不同的條件下與mb（10^-4m，50ml）作用，大約1小時后mb有不同程度的褪色，從圖6a中也可以看出，mb的紫外吸光度逐漸降低。從圖6b中看出單純sa小球（a）的降解吸附率為29%，sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球在黑暗（b）、室內（c）、太陽光（d）條件下對mb的降解率分別為69.5%、70.5%、81%，從而說明sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球對mb具有顯著的催化降解能力，且在太陽光下的降解效果更明顯。這可能是由于hemin-au-sg-fe3o4之間的π-π共軛結構加速了模擬酶復合球與底物之間的電子傳遞或者轉移速率，從而提高了模擬酶復合球的酶催化能力。

圖7為sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球降解rhb的考察。與降解mb現象類似，大約2小時后rhb會不同程度的褪色（圖7a），從7b中看出sa小球的降解吸附率為28.7%，在黑暗、室內、太陽光條件下的降解率分別為59.6%、72.8%、83.1%，進而說明sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球對rhb具有顯著的催化降解能力，且在太陽光下的降解效果更明顯。原因可能是光催化降解，也可能是hemin-au-sg-fe3o4之間的π-π共軛結構使加速了模擬酶復合球與底物之間的電子傳遞或者轉移速率，從而提高了模擬酶復合球的酶催化能力。

另外，將sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球（0.25g）在不同的條件下與ph（99.8%，20ml）作用，并加入200μl30%的雙氧水，室溫攪拌，可以觀察到混合體系中有大量的熱和氣泡產生。隨后，每隔5分鐘取降解體系上清液（50μl）與fecl3溶液（1.0m，150μl）混合反應。由圖8a可知，sa對ph幾乎沒有降解功能，而sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球對ph降解效果明顯，尤其以在太陽光下降解效果最為明顯。另外，對沒有加sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球的空白體系，在加入fecl3后溶液由黃色變為紫色，這是由于fecl3與苯酚反應生成2,4,6-三氯苯酚紫色絡合物所致，說明體系中的苯酚沒有被降解，而對加入sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球的體系，開始加入fecl3時溶液變為紫色，大約1h后，加入fecl3后上清液顏色不再發生變化，此時體系中的苯酚被降解完全，這是由于在sa-hemin-au-sg-fe3o4的催化作用下，雙氧水將苯酚氧化變成苯醌，而苯醌與fecl3不反應，沒有紫色絡合物生成。從8b中看出sa小球的降解吸附率為8.07%，在黑暗、室內、太陽光條件下的降解率分別為60.41%、73.36%、92.77%，進而說明sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球對ph具有顯著的催化降解能力，且在太陽光下的降解效果更明顯。

對比例1

一種基于血紅素介導金礦化途徑的雙催化功能模擬酶的制備方法，步驟包括：

（1）取氯化血紅素，室溫下加水攪拌，配制為濃度0.10mg/ml的hemin溶液，4℃儲存；取氯金酸加水，配制為濃度10mm的haucl4溶液；取naoh加水，配制為濃度1.0m的naoh溶液；

（2）將步驟（1）制備的1.0mlhaucl4溶液與1.0mlhemin溶液等體積混合，5min后，劇烈攪拌下加入20μlnaoh溶液，然后在水浴中繼續攪拌，37℃反應8h，8000r/s離心20min，取上清液采用14kda的透析袋去離子水透析處理12h，得基于血紅素介導金礦化途徑的雙催化功能模擬酶（即hemin-auncs復合物），于4℃保存。

實施例1及對比例1產品性能對比

本發明實施例1所制備的sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球與對比例1中的hemin-au模擬酶同時應用于對染料（mb、rhb、ph）的降解實驗中，結果發現，sa-hemin-au-sg-fe3o4具有顯著高于hemin-au的降解性能。原因如下：（1）sg特殊的單原子層平面二維結構和超高的比表面積，可吸附連接豐富的hemin-au復合物，顯著增強單位體積內酶分子的個數，從而增強復合物催化性能；（2）hemin、sg、fe3o4分子均具有六元環結構，容易形成π-π共軛結構，使它們之間的聯系更加緊密，加速電子的傳遞和轉移，另外，sg、fe3o4本身具有一些類過氧化物酶活性，與hemin-au結合后，使得整體活性增強；（3）sa具有豐富的羧基和羥基等功能基團，易與hemin中的羧基結合實現酶的固定化包埋，并且可生物降解、生物相容性和黏附性好，環境無毒，可以很好的黏附在磁性顆粒表面；（4）fe3o4具有磁性，可回收利用，回收操作簡便快捷，使其更廣泛的應用于不同領域、不同環境中。基于此，sa-hemin-au-sg-fe3o4模擬酶復合球可廣泛應用于催化降解染料中。