利用比色共振反射光學生物傳感器進行測定的無標記方法

專利名稱：利用比色共振反射光學生物傳感器進行測定的無標記方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測生物分子相互作用的方法。所述檢測可以在不使用標記的情況下進行，并且能夠以高通量方式進行。本發明還涉及光學裝置。
背景技術：
隨著人類基因組測序的完成，分子生物學的下一步重大挑戰之一是了解由DNA編碼的多種蛋白靶如何與其他蛋白，小分子藥用候選物，和大量酶和抑制劑相互作用。參見，例如，Pandey & Mann，“Proteomics to study genes and genomes，”Nature，405，p.837-846，2000；Leigh Anderson等，“Proteomicsapplications in basicand applied biology，”Current Opinion in Biotechnology，11，p.408-412，2000；Patterson，“Proteomicsthe industrialization of proteinchemistry，”Current Opinion in Biotechnology，11，p.413-418，2000；MacBeath & Schreiber，“Printing Proteins as Microarrays forHigh-Throughput Function Determination，”Science，289，p.1760-1763，2000；De Wildt等，“Antibody arrays for high-throughputscreening of antibody-antigen interactions，”Nature Biotechnology，18，p.989-994，2000。為此，能夠同時以高靈敏度對多種不同的生物分子相互作用進行定量的工具可用于藥物發現、蛋白組學和診斷。另外，為了使上述工具能夠廣泛使用，它們在使用時必須簡單，它本身和操作的成本必須低廉，并且必須可應用于多種分析物，所述分析物可能包括例如多核苷酸、肽、小蛋白、抗體、甚至是完整的細胞。
業已開發出了用于檢測包括寡核苷酸的多種生物分子復合物、抗體抗原相互作用、激素-受體相互作用以及酶-底物相互作用的生物傳感器。一般，生物傳感器由兩個元件組成高度專一性的識別元件，和能夠將分子識別事件轉換成可定量信號的轉換器。業已通過多種方法實現了信號轉導、包括熒光、干涉量度學(Jenison等，“Interference-based detection of nucleic acid targets on opticallycoated silicon，”Nature Biotechnology，19，p.62-65；Lin等，“Aporous silicon-based optical interferometric biosensors，”Science，278，p.840-843，1997)和重量分析法(A.Cunningham，BioanalyticalSensors，John Wiley & Sons(1998))。
在所述基于光學的轉導方法中，直接方法不需要用熒光化合物標記分析物，它是有價值的，因為測定相對簡單，并且能夠研究不容易標記的小分子和蛋白的相互作用。直接光學方法包括表面等離子體共振(SPR)(Jordan & Corn，“Surface Plasmon Resonance ImagingMeasurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption ontoChemically Modified Gold Surfaces，”Anal.Chem.，691449-1456(1997))，光柵耦合器(Morhard等，“Immobilization of antibodiesin micropatterns for cell detection by optical diffraction，”Sensorsand Actuators B，70，p.232-242，2000)，橢圓偏光法(Jin等，“Abiosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization ofbiomolecular interactions，”Analytical Biochemistry，232，p.69-72，1995)，損耗波裝置(Huber等，“Direct optical immunosensing(sensitivity and selectivity)，”Sensors and Actuators B，6，p.122-126，1992)，和反射測量術(Brecht & Gauglitz，“Optical probesand transducers，”Biosensors and Bioelectronics，10，p.923-936，1995)。理論上推測的這些檢測方法的檢測極限業已確定，并且用實驗證實了可用于診斷上相關的濃度范圍。不過，迄今為止，這些方法尚未生產出可商業上利用的高通量儀器，所述儀器能夠在沒有任何類型的標記的情況下進行高靈敏度測定，這種測定形式能夠方便地與最常用于高通量生物分子相互作用分析的基于微量滴定板的或基于微陣列的基礎結構兼容。因此，本領域需要能夠實現這些目的的方法。
發明概述在一種實施方案中，本發明提供了包括比色共振反射光學生物傳感器的容器。所述比色共振反射光學生物傳感器構成所述容器的內表面。將一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上的不同位置上。所述容器可包括微量滴定板孔、試管、培養皿或微流體通道。
本發明的另一種實施方案提供了包括一個或多個微量滴定板孔的微量滴定板，其中，一個或多個微量滴定板孔的底面包括比色共振反射光學生物傳感器。將一種或多種特殊結合物質固定在每一個微量滴定板孔的底面上的兩個或兩個以上不同位置上。
本發明的另一種實施方案提供了檢測一種或多種類型的細胞與一種或多種特殊結合物質結合的方法。所述方法包括將所述一種或多種類型的細胞應用在容器內表面上，其中，所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器，其中，將一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上的不同位置上。用光線照射所述容器，并且檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWV)。如果所述一種或多種細胞業已結合在一種或多種特殊結合物質上，則結合了所述一種或多種細胞的不同位置上的PWV就會偏移。所述容器可以是微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養皿或微流體通道。所述一種或多種特殊結合物質可以排列在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上的一系列不同位置上。所述不同位置可以限定直徑為大約50-500微米的斑點陣列。可以通過選自下列一組的方法將所述一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水性結合和親水性結合。所述一種或多種特殊結合物質選自下列一組核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜交溶液、含有來自組合化學文庫的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物和生物學樣品。
本發明的另一種實施方案提供了檢測一種或多種細胞與一種或多種特殊結合物質的結合的方法。所述方法包括將一種或多種特殊結合物質固定在容器內表面的兩個或兩個以上不同位置上，其中，所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器。用光線照射所述容器。檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWVs)。將一種或多種細胞應用在所述容器內表面上。用光線照射所述容器。檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWVs)。將在添加細胞之前獲得的PWVs與在添加細胞之后獲得的PWVs進行比較。如果所述一種或多種細胞業已結合了特殊結合物質，則位于結合了細胞的不同位置上的PWV就會偏移。
附圖簡述

圖1A表示生物傳感器的橫截面圖，其中，所示出的光線照射了生物傳感器的底部；不過，光線能夠從頂部或底物照射所述生物傳感器。圖1B表示生物傳感器的圖，其中，所示出的光線照射了生物傳感器的底部；不過，光線能夠從頂部或底物照射所述生物傳感器；圖2表示比色共振反射生物傳感器的實施方案，它包括按照本發明的方法和組合物制備的一維光柵。
圖3A-B表示包括正方形(圖3A)或孔(圖3B)的矩形柵格的光柵。
圖4表示采用正弦波動光柵形狀的生物傳感器橫截面形狀。
圖5表示由一組同心環組成的共振反射或透射濾光片結構。
圖6表示包括六邊形孔柵格(或六邊形柱柵格)的共振反射或透射濾光片結構，它與圖5所示的同心圓結構非常接近，而不需要將照射光束集中在柵格的任何特定位置。
圖7表示諸如蛋白單層的吸附材料如何增強包括三維光柵的生物傳感器的反射波長的曲線圖。
圖8表示三種類型的表面活化化合物(胺、醛和鎳)與相應的化學接頭分子，它可用于將各種類型的生物分子受體附著在生物傳感器上。
圖9A-C表示可用于擴增結合配偶體物質的方法，如擴增位于生物傳感器表面上的檢測的DNA或檢測的蛋白。
圖10表示生物傳感器的共振波長為檢測光束的入射角的函數。
圖11表示利用兩種耦合光纖照射并且收集來自生物傳感器的反射光的例子。
圖12表示利用分光器以使得照射光和反射光共有到達生物傳感器的共同的平行光通路的例子。
圖13表示檢測系統的示意圖。
圖14表示出現在光纖探頭頂端用于體內檢測生化物質的生物傳感器的例子。
圖15表示峰共振波長對溶解在PBS中的BSA的濃度的依賴性，然后讓所述溶液在生物傳感器表面上干燥。
圖16A-B。圖16A表示用各種濃度的鏈霉抗生物素蛋白檢測業已用連接在生物素受體分子上的NH2表面化合物激活的生物傳感器的結果。圖16B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖17A-B。圖17A表示利用山羊抗體受體分子檢測抗山羊IgG的測定。BSA封閉檢測表面，產生了明確可測量的背景信號，這是由于大量BSA整合在生物傳感器上。66nM濃度的抗山羊IgG很容易超過背景信號測量。圖17B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖18A-B。圖18A表示利用抗人IgG INF-γ受體分子，和神經生長因子(NGF)負對照分析干擾素-γ(INF-γ)的非標記ELISA測定。圖18B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖19A-B。圖19A表示5-氨基酸肽(MW＝860)的檢測，以及隨后用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3切割pNA標記(MW＝130)。圖19B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖20A-B。圖20A表示在連續監控三個單獨的蛋白層的結合期間液體中的共振峰。圖20B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖21A-B。圖21A表示根據圖21所示數據精確測定的終點共振頻率。圖21B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖22A-B。圖22A表示IgG結合的動力學結合測量。圖22B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖23A-B。圖23A表示能切割生物傳感器表面上的結合蛋白的蛋白酶的動力學測量。圖23B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖24表示用于試驗溶液的峰共振波長值的圖。用抗生物素蛋白溶液作為基線參照物，以與抗生物素蛋白+BSA和抗生物素蛋白+b-BSA溶液進行比較。將BSA添加到抗生物素蛋白中，僅僅導致了小的波共振波長增強，因為，預計兩種蛋白不會相互作用。不過，由于生物素和抗生物素蛋白緊密結合(Kd＝10-15M)，所以抗生物素蛋白+b-BSA溶液將包括較大的結合蛋白復合物。因此與抗生物素蛋白+BSA溶液相比，抗生物素蛋白+b-BSA蛋白溶液提供了峰共振波長值的大的偏移。
圖25表示相對沒有固定化學官能團的傳感器的PWV偏移，這是由于NH2、NH2+(NHS-PEG)和NH2+(NHS-PEG-生物素)分子附著在傳感器表面上而記錄到的。誤差棒表示在7個微量滴定板孔上記錄的PWV偏移的標準差。數據表明，所述傳感器能夠區分清潔表面，和具有固定的NH2的表面，并且能夠明確檢測NHS-PEG(分子量大約為2000道爾頓)分子的添加。表面固定的NHS-PEG和NHS-PEG-生物素(分子量大約為3400道爾頓)之間的差異同樣是可以測量的。
圖26A-C表示在接觸各種濃度的抗生物素IgG(0-80mg/ml)并且使其溫育20分鐘時，生物傳感器孔的PWV偏移反應為時間的函數。NHS-PEG表面(圖26B)提供了最弱的反應，而胺活化的表面(圖26A)表明了與高濃度抗生物素IgG的低水平的非專一性相互作用。NHS-PEG-生物素表面(圖26C)明確表明了與抗生物素IgG的強的專一性相互作用——從而提供了與接觸的抗生物素IgG的濃度成比例的強的PWV偏移。
圖27表示在20分鐘之后來自圖26C的PWV偏移幅度，它是以圖26中的抗生物素IgG濃度的函數形式作圖的。觀察到了IgG濃度和測量的PWV偏移之間的大體上線性的相關，并且最低濃度的IgG溶液(1.25mg/ml，8.33nM)與負對照PBS溶液相比是明確可測量的。
圖28表示利用生長在比色共振反射光學生物傳感器上的軟骨細胞進行細胞形態學測定的結果。在所述測定過程中，觀察到細胞保持附著在生物傳感器的表面上；在將2mg/ml胰蛋白酶添加到容納有軟骨細胞的生物傳感器孔中后觀察到的PWV的降低，表明了軟骨細胞細胞形態學的變化。
圖29表示利用腎腫瘤細胞進行細胞粘著測定的結果。將胰蛋白酶添加到容納有生長在生物傳感器的表面上的腎腫瘤細胞的六個生物傳感器孔中。將兩個孔用作三種胰蛋白酶濃度的每一種的重復樣品。在添加胰蛋白酶后，觀察到PWV的降低，表明了所述細胞與傳感器表面分離。
圖30表示用于生物傳感器的角掃描的系統的例子。
圖31表示是作微陣列的生物傳感器的例子。
圖32A-B表示能夠整合比色共振反射生物傳感器的兩種生物傳感器的形式。圖32A表示整合在微量滴定板中的生物傳感器。圖32B表示微陣列載片形式的生物傳感器。
圖33表示使用生物傳感器平臺以較高的密度和通量進行測定的一系列陣列概念。
圖34A-B。圖34A表示由于附著鏈霉抗生物素蛋白受體層導致的共振波長偏移，和隨后的生物素化的IgG的檢測。圖34B表示與生物傳感器結合的分子的示意圖。
圖35A-B。圖35A表示位于比色共振反射生物傳感器微陣列上的兔、雞、山羊和人IgG的點樣。圖35B表示讓抗人-IgG在所述傳感器表面上流過的結果，表明了人-IgG和抗人-IgG之間的較強的結合。
圖36A-B。采用固定在所述傳感器表面上的Poly-T，圖36A表明了固定化的寡核苷酸與Poly-T、Poly-A和T7-啟動子之間的不同程度的雜交親和力。圖36-B表示終點數據與誤差棒。
圖37表示蛋白-DNA相互作用專一性的例子，在這種場合下，可以檢測T7-啟動子DNA和T7RNA聚合酶之間的相互作用專一性。
圖38表示細胞蛋白相互作用測定的示意圖。
圖39表示來自細胞蛋白相互作用測定的結果。
發明詳述比色共振反射光學生物傳感器能夠在不使用熒光標記、比色標記或任何其他類型的標記或標志的前提下在生物傳感器表面上測量生物化學相互作用。生物傳感器表面包括光學結構，在用平行白光照射時，所述結構被設計成只能反射窄的波長帶。窄的波長帶被定義為波長“峰”。當諸如生物學材料的材料沉積在生物傳感器表面上或從生物傳感器表面上除掉時，“峰波長值”(PWV)發生改變。將讀出裝置用于通過平行白光照射生物傳感器表面的不同位置，并且收集平行反射光。將收集到的光線聚攏到波長分光計上，用于測定PWV。
通過將所述結構(生物傳感器一側向上)結合在無底微量滴定板盒的底部，可以將生物傳感器結構整合成標準一次性實驗室用品，如微量滴定板。將生物傳感器整合進普通實驗室形式的盒子中，是與現有的微量滴定板處理設備兼容所需要的，所述設備如混合器、培養箱和液體分配裝置。
在本公開內容中定義的每一種測定方法的功能性優點來自比色共振反射生物傳感器的特性。首先，在不使用標記的前提下測量生物化學相互作用。其次，可以同時監控很多相互作用。第三，將生物傳感器整合進標準微量滴定板中，用于平行測定的隔離和液體封閉。
對于目前用于基因組學、蛋白組學、藥用化合物篩選和臨床診斷用途的大部分測定來說，熒光或比色化學標記通常附著在要研究的分子上，以便能夠方便地顯示它們。由于標記的附著顯著提高了測定復雜性，并且可能通過構象修飾或表位封閉改變分子功能，所以業已出現了各種無標記的生物傳感器技術。無標記檢測現象學包括在用對檢測分子具有高親和力的受體分子活化的表面上測定質量、微波傳遞線路特征、微型懸臂偏轉或光密度的改變。無標記生物傳感器技術的廣泛的商業可接受性，業已受到了它們在生產和包裝上廉價的形式中提供高檢測靈敏度和高檢測并行性的能力的制約。例如，如果生物傳感器面積大到足以包括大量平行測定，則在批量光刻法、蝕刻和沉積方法中在半導體或玻璃晶片上生產的生物傳感器的生產和包裝成本是昂貴的。類似的，在陣列中生產與單個生物傳感器的電連接的要求，造成了在包裝成本和與生物傳感器接觸流體的兼容性方面的困難的挑戰。
定義比色共振反射光學生物傳感器“比色共振反射光學生物傳感器”，或者在本文中被稱作生物傳感器，在這里被定義為子波長結構表面(SWS)生物傳感器和表面浮雕衍射體(SRVD)生物傳感器。參見，例如，美國申請10/059,060，其名稱為“Resonant Reflection Microarray”和美國申請序號10/180,374，和美國申請序號10/180,647。
完整的特殊結合物質在本文中，“完整的特殊結合物質”，表示大體上完整的目標分子，例如，將完整的特殊結合物質大體上從比色共振反射光學生物傳感器上切割下來，得到了大體上完整的、天然的特殊結合物質。
微量滴定板在本文中，“微量滴定板”被定義為具有2、6、8、24、48、96、384、1536或3456個孔的形式的，或任何其他數目孔的微量滴定板或多孔平板。
試驗試劑在本文中，“試驗試劑”被定義為任何酶或化合物和它們的溶液。酶的非限定性例子有蛋白酶、脂酶、核酸酶、裂解酶、肽酶、水解酶、連接酶、激酶和磷酸酶。除了酶、化合物及其溶液之外，“試驗試劑”還表示它們的緩沖液空白物。緩沖液空白物表示與添加到其他所述試驗試劑中的組成相同的試劑或溶液，其中去掉了酶成分。
半滲透性內部套管“半滲透性內部套管”在這里還可以被稱作“插入物”或“套管”，它被定義為能夠支持細胞生長的多孔材料。半滲透性內部套管對于從生長在套管表面上的細胞中分泌、流出或以其他方式排出的蛋白或其他分子可以滲透的，但對于完整的細胞不能滲透。半滲透性內部套管通常保持距離在它上面結合有特殊結合物質的生物傳感器表面或生物傳感器表面上的生長培養基或緩沖液較短的距離，以便所述分泌的、流出的或以其他方式排出的部分能夠自由地通過所述套管擴散。半滲透性內部套管可以放置在如上文所定義的任何類型的比色共振反射光學生物傳感器上，位于微量滴定板孔中或沒有所述孔。
保持與生物傳感器表面或位于生物傳感器表面上的生長培養基或緩沖液表面接觸的半滲透性內部套管在本文中被定義為(1)是這樣定位的，以便所述套管是緊密相鄰的，但是與生物傳感器的表面沒有直接的物理接觸；(2)是這樣的定位的，以使得所述套管與放置在生物傳感器表面上的緩沖液或生長培養基的表面物理接觸；或(3)是以任何方式定位或連接的，以便有利于從細胞中分泌、流出或以其他方式排出的分子能夠擴散通過半滲透性內部套管，并且優選不受阻礙。“保持接觸”還表示“靠近生物傳感器表面”的布置或安裝。
用作半滲透性內部套管的材料的類型可以是，例如，聚對苯二甲酸乙二酯(PET)或聚四氟乙烯(PTFE)，如在商業化可獲得的細胞培養插入物中使用的材料(BD Falcon，Millipore)。
抑制活性“抑制活性”在這里被定義為一種分子或化合物延緩或阻止另一種分子執行催化活性的能力。例如，具有蛋白酶抑制活性的化合物能抑制蛋白酶切割蛋白。所述抑制活性是“針對”所述催化分子執行的。“抑制活性”還表示一種分子或化合物大體上抑制或部分抑制結合配偶體與特殊結合物質結合的能力。
核酸“核酸”在這里被定義為通過3′，5′磷酸二酯鍵連接的天然或非天然核苷酸或其衍生物的單鏈或雙鏈聚合物。
寡核苷酸“寡核苷酸”在這里被定義為通過磷酸二酯鍵結合的天然或非天然核苷酸或其衍生物的單鏈或雙鏈聚合物序列。“寡核苷酸”一般表示長度大約為20個堿基或更少的短的多核苷酸，如果超過這一長度，它們優選被稱作多核苷酸。
蛋白“蛋白”在這里被定義為通過特殊序列上的肽鍵結合的天然或非天然氨基酸或其衍生物的線性聚合物。
肽“肽”在這里被定義為能夠水解成氨基酸并且構成蛋白的基礎結構單元的任何類型的分子。一般表示短的多肽或蛋白片段。
組合化學文庫“組合化學文庫”在這里被定義為通過將它們的組成結構單元材料以多種方式組合產生的多種類型的分子。
細胞膜“細胞膜”在這里被定義為細胞外部的、限制性脂雙層膜。
組織“組織”在這里被定義為一組細胞，通常是混合類型的細胞，并且通常通過細胞外基質結合在一起，它們起著特殊的作用。另外，在更廣泛的意義上，“組織”可以表示來自共同因素的一種細胞類型的生物學分類；例如，結締組織，它們的共同特征是它們的功能，或上皮組織，它們的共同因素是組構模式。
受體“受體”在這里被定義為膜結合或膜封閉的分子，它們以高的專一性結合，或對某些移動性更高的分子(配體)作出反應。
配體“配體”在這里被定義為彼此結合的分子；在正常使用時，為可溶性分子，如激素或神經遞質，其能結合受體。其還與本發明的“結合物質”類似。
細胞因子“細胞因子”在這里被定義為由細胞釋放的蛋白，它能影響其他細胞的行為。與“激素”類似，不過該術語傾向于被用作白細胞介素、淋巴因子和諸如TNF和干擾素的其他相關信號傳導分子的通用名詞。
趨化因子“趨化因子”在這里被定義為能刺激白細胞的趨化性的小的分泌蛋白。
細胞外基質材料“細胞外基質材料”在這里被定義為由細胞產生的并且分泌到周圍介質中的任何材料，不過，通常用于動物組織的非細胞部分。
抗原“抗原”在這里被定義為能誘導免疫反應的物質。抗原決定簇組被稱作表位，并且載體分子上的表位(它可任選地是相同分子的一部分，例如，肉毒桿菌神經毒素A，單個分子具有三種不同的表位。參見Mullaney等，Infect Immun 2001 Oct；69(10)6511-4)使得所述載體分子起著抗原的作用。常見的抗原對其可以產生免疫反應的動物來說是外源的。
多克隆抗體“多克隆抗體”在這里被定義為通過若干種克隆的B-淋巴細胞產生的抗體，完整動物就是這種情況。其通常表示在免疫動物體內產生的抗體。
單克隆抗體“單克隆抗體”在這里被定義為細胞系，無論是在體內還是在培養物中的，它具有單克隆起源。單克隆抗體是通過雜交瘤細胞的單克隆產生的，且因此，是單一種類的抗體分子。
單鏈抗體(Scfv)“單鏈抗體(Scfv)”在這里被定義為重組融合蛋白，其中，輕鏈和重鏈(Vh和Vl)的兩個抗原結合區通過連接肽連接，這使得輕鏈和重鏈能夠在異源生物中等量表達，并且使所述蛋白穩定。
F(Ab)片段“F(Ab)片段”在這里被定義為通過木瓜蛋白酶處理制備的免疫球蛋白的片段。Fab片段由通過二硫鍵結合在重鏈的一部分上的輕鏈組成，并且包括一個抗原結合部位。它們可以被視為單價抗體。
F(Ab′)2片段“F(Ab′)2片段”在這里被定義為通過用胃蛋白酶水解免疫球蛋白分子N-末端至胃蛋白酶攻擊位點獲得的大約90kDa的蛋白片段。其包括通過二硫鍵在Fc片段的短的部分連接在一起的Fab片段。
Fv片段“Fv片段”在這里被定義為免疫球蛋白分子的Fab片段的N-末端部分，其由一個輕鏈和一個重鏈的可變部分組成。
小有機分子“小有機分子”在這里被定義為任何小的含碳分子，它們不另外地被歸類為上述有機分子之一，例如，多肽。
子波長結構表面(SWS)生物傳感器在本發明的一種實施方案中，子波長結構表面(SWS)被用于產生特定波長的強烈的光學共振反射，可將它用于以高靈敏度跟蹤生物學材料的相互作用，如特殊結合物質或結合配偶體或這兩者。比色共振反射衍射光柵表面起著特殊結合物質的表面結合平臺的作用。
子波長結構表面是非常規類型的衍射光學元件，它能模擬薄膜涂層的作用(Peng & Morris，“Resonant scattering from two-dimensional gratings，”J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13，No.5，p.993，May 1996；Magnusson，& Wang，“New principle for optical filters，”Appl.Phys.Lett.，61，No.9，p.1022，August，1992；Peng & Morris，“Experimental demonstration of resonant anomalies in diffractionfrom two-dimensional gratings，”Optics Letters，Vol.21，No.8，p.549，April，1996)。SWS結構包括一維、二維或三維光柵，其中，與入射光的波長相比，光柵周期較小，以便不允許除了反射和透射零級以外的衍射級波長傳播。SWS表面窄帶濾光片可以包括在基片層和覆蓋層之間所夾的光柵，所述光柵填充光柵刻線槽。可任選地不使用覆蓋層。當光柵區的有效折射率大于所述基片或覆蓋層時，就會產生波導。當適當設計濾光片時，入射光進入波導區，并且以衰減模傳播。光柵結構選擇性地以窄帶的波長將光線耦合到所述波導中。光線只能傳播非常短的距離(在10-100微米數量級上)，發生散射，并且與向前和向后傳播的零級光耦合。這種高度敏感的耦合條件，可能在反射的輻射光譜上產生共振光柵效應，導致反射或透射波長的窄帶。所述光柵的厚度和周期小于共振光柵效應的波長。
這種結構的反射或透射顏色可以通過將諸如特殊結合物質或結合配偶體或這兩者添加在覆蓋層或光柵表面的上表面上而進行調節。所添加的分子增加了通過該結構的入射輻射的光程長度，并因此改變了發生最大反射或透射的波長。
在一種實施方案中，在用白光照射生物傳感器時，將它設計成只能反射單一波長或窄帶波長。當特殊結合物質附著在生物傳感器的表面上時，反射波長由于耦合在光柵上的燈光的光程改變而偏移。通過將特殊結合物質連接在生物傳感器表面上，可以在不使用任何類型的熒光探針、顆粒標記或任何其他類型標記的情況下檢測互補性結合配偶體分子。所述檢測技術能夠分辨，例如，大約0.1nm厚的蛋白結合變化，并且能夠用浸泡在流體中的或干燥的生物傳感器表面進行。
例如，檢測系統由例如光源和分光計組成，所述光源以正入射方式通過例如光纖探頭照射生物傳感器的小斑點，所述分光計通過，例如，同樣是正入射的第二個光纖探頭收集反射光。由于在激發/檢測系統和生物傳感器表面之間沒有物理接觸，所以不需要特殊的耦合棱鏡，并且所述生物傳感器可以容易地應用在任何常用測定平臺上，包括，例如微量滴定板和微陣列載片。可以在幾毫秒時間內進行一次分光計讀數，因此，它能夠快速測量在生物傳感器表面上同時發生的大量的分子相互作用，并且實時監控反應動力學。
這種技術可應用于同時測量的大量的生物分子相互作用，特別是當分子標記能改變或抑制研究中的分子的功能時。用蛋白靶高通量篩選藥用化合物，以及用于蛋白組學的蛋白-蛋白相互作用的微陣列篩選是需要由本發明的組合物和方法提供的靈敏度和通量的應用的例子。
圖1A和1B是比色共振反射衍射光柵生物傳感器的一種例子的圖。在圖1中，n基片表示基片材料。n2表示光柵的折射率。n1表示任選的覆蓋層。nbio表示一種或多種特殊結合物質的折射率。t1表示在一維、二維或三維光柵結構上的任選的覆蓋層的厚度。t2表示光柵的厚度。tbio表示一種或多種特殊結合物質層的厚度。在一種實施方案中，n2＜n1(參見圖1A)。對層厚度(即覆蓋層，一種或多種特殊結合物質，或光柵)進行選擇，以便獲得對頂面上的其他分子的共振波長靈敏度。選擇光柵周期，以便獲得理想波長的共振。
SWS生物傳感器包括光柵，它由高折射率材料、能支持光柵的基片層和固定在與基片層相反的光柵表面上的一種或多種特殊結合物質組成。可任選地用覆蓋層覆蓋光柵表面。用高折射率介電薄膜對按照本發明生產的光柵進行涂覆，所述薄膜可能由這樣的材料組成，所述材料包括，例如，硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭和四氮化三硅。具有光學部件的光柵的橫截面輪廓可以包括任何周期性的重復功能，例如，“方波”。光柵還可以包括選自下列一組的重復形式的形狀線、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、長方形和六邊形。本發明的生物傳感器還可以包括光柵，其由例如，用高折射率材料涂覆的塑料或環氧樹脂組成。
傳感器特征線性光柵(即，一維光柵)具有共振特征，其中，照射光偏振化的方向是垂直于光柵周期的。在圖2A中示出了具有光學覆蓋層的線性光柵結構的一種實施方案的示意圖。例如，比色共振反射生物傳感器還可以包括例如二維光柵，例如，六邊形陣列的孔(參見圖3B)或正方形(參見圖3A)。還可以使用其他形狀。線性光柵可以具有相同的節距(即高和低折射率區之間的距離)、周期、層厚度和材料特性，如六邊形陣列光柵。不過，光線必須偏振化成垂直于光柵線，以便與所述光學結構共振耦合。因此，它的偏振光軸垂直于它的線性光柵的偏振濾光片必須插在照射源和生物傳感器表面之間。由于只有一小部分照射光源是正確偏振化的，所以與六邊形光柵相比，需要較長的積分時間收集等量的共振反射光。
光柵還可以包括，例如，“階梯”形狀，其中，將一個固定高度的高折射率區包埋在較低折射率的覆蓋層中。高和低折射率的交替的區域提供了平行于生物傳感器頂面的光導管。
還可能生產共振生物傳感器，其中，所述高折射率材料不是階梯形的，相反，它隨側向位置而改變。圖4表示一種輪廓，其中二維光柵的高折射率材料，n2在高度上是正弦波動的。為了產生特定波長的共振反射，正弦曲線的周期與相同的階梯形結構的周期相同。業已利用GSOLVER(Grating Solver Development Company，Allen，Tex.，美國)計算機模型驗證了正弦波動結構的共振工作，以及它作為生物傳感器的功能。
本發明的生物傳感器還可以包括位于光柵上的與基片層相反的表面上的覆蓋層。當存在覆蓋層時，所述一種或多種特殊結合物質固定在與光柵相反的覆蓋層的表面上。優選的是，覆蓋層包括具有比構成光柵的材料低的折射率的材料。覆蓋層可以由，例如，玻璃(包括旋涂玻璃(spin-on glass)(SOG))、環氧樹脂或塑料組成。
例如，可以將滿足生物傳感器的折射率要求的各種聚合物用作覆蓋層。SOG由于它的有利的折射率、便于操作以及便于使用大量的玻璃表面活化技術用特殊結合物質激活而可以使用。當生物傳感器表面的平整度對于特定系統裝置而言不是問題時，SiN/玻璃的光柵結構可直接用作感測表面，所述表面的激活可以使用與在玻璃表面上相同的方式進行。
共振反射還可以在不用平面覆蓋層覆蓋光柵的條件下獲得。例如，生物傳感器可能只包括用高折射率材料的有結構的薄膜層涂覆的基片。在不使用平面覆蓋層的情況下，周圍的介質(如空氣或水)填充所述光柵。因此，特殊結合物質固定在生物傳感器上位于接觸所述特殊結合物質的光柵的所有表面上而不是僅覆蓋上表面。
一般，本發明的生物傳感器是用白光照射，白光包括具有每一種偏振角的光線。偏振角相對生物傳感器光柵上的重復部件的取向將決定共振波長。例如，“線性光柵”(即，一維光柵)生物傳感器由一組重復的線和間距組成，它具有兩種光學偏振化，其能夠產生單獨的共振反射。被偏振化成垂直于所述線的光線被稱作“s-偏振化”，而被偏振化成平行于所述線的光線被稱作“p-偏振化”。入射光的s和p成分同時存在于未濾光的照射光束中，并且各自產生單獨的共振信號。生物傳感器通常被設計成能最優化僅僅一種偏振化(s-偏振化)的特性，并且通過偏振濾光片可容易地將非最優化的偏振化除掉。
為了去除偏振化依賴性，以便每一個偏振角產生相同的共振反射光譜，可以使用替代性的生物傳感器結構，該結構由一系列同心環組成。在該結構中，每一個同心環的內徑和外徑的差等于光柵周期的大約1/2。每一個后續環的內徑比前一個環的內徑大大約一個光柵周期。所述同心環模式延伸到覆蓋一個傳感器位置-如一系列斑點或微量滴定板孔。每一個單獨的微陣列斑點或微量滴定板孔具有位于它中央的單獨的同心環模式。參見，例如，圖5。所述結構的所有偏振化方向具有相同的橫截面輪廓。所述同心環結構必須在中央被精確地照射，以便保持偏振化獨立性。同心環結構的光柵周期小于共振反射光的波長。光柵周期為大約0.01微米-大約1微米。光柵厚度為大約0.01-大約1微米。
在另一種實施方案中，將一系列孔或柱排列成非常接近上述同心圓結構，而不需要集中在柵格的任何特定部位的照射光束。參見，例如，圖6。這種陣列模式是由從三個方向以相同的角照射在表面上的三個激光光束的光學干涉自動產生的。在這種模式中，孔(或柱)集中在一系列緊密堆積的六邊形的角落，如圖6所示。所述孔或柱還出現在每一個六邊形的中央。所述孔或柱的六邊形柵格具有三個偏振化方向，它們“看上去”具有相同的橫截面輪廓。因此，所述六邊形柵格結構利用任何偏振角的光線提供了相當的共振反射光譜。因此，不需要偏振濾光片來消除不希望的反射信號成分。所述孔或柱的周期可以為大約0.01微米-大約1微米，并且厚度或高度可以為大約0.01微米-大約1微米。
可以用本發明的方法生產的另一種光柵是體積表面浮雕衍射體光柵(SRVD光柵)，又被稱作三維光柵。SRVD光柵的表面在用寬帶光波長照射時，主要反射特定的窄帶光波長。當特殊結合物質和/或結合配偶體固定在SRVD光柵上，從而產生SRVD生物傳感器時，反射的窄帶光波長發生偏移。一維表面，如薄膜干擾濾光片和布拉格反射器可以從寬帶發射源中選擇窄范圍的反射或透射波長，不過，諸如特殊結合物質和/或結合配偶體的其他材料沉積在它們的上表面上，只會導致共振線寬的改變，而不是共振波長的改變。相反，SRVD生物傳感器具有通過將諸如特殊結合物質和/或結合配偶體添加在它表面上來改變反射波長的能力。浮雕衍射體結構的厚度和周期小于從生物傳感器上反射的光線的共振波長。
三維表面浮雕衍射體光柵可以是，例如，三維相位量化階梯形表面浮雕模式，它的溝槽圖案類似于階梯形棱椎。當這樣的光柵被寬帶輻射光束照射時，光線能夠以特定波長從相等間隔的臺階上一致地反射，所述波長通過將二倍的階梯間距乘以周圍介質的折射率給出。特定波長的光線從間隔半波長的階梯上共振衍射或反射，其帶寬與階梯的數目成反比。
三維相位量化階梯形表面浮雕模式的一種例子是類似于階梯形棱椎的模式。每一個倒置的棱椎的直徑為大約1微米，優選，每一個倒置的棱椎的直徑可以為大約0.5-大約5微米，包括，例如，大約1微米。所述棱椎結構可以是緊密堆積的，以便直徑大約150-200微米的一般的微陣列斑點可以整合數百個階梯形棱椎結構。所述浮雕衍射體結構的周期為大約0.1-大約1微米，厚度為大約0.1-大約1微米。圖7示出了個體微陣列位置(整合了數百個棱椎的一個完整的微陣列斑點現在通過一個微陣列斑點的一個棱椎表示)如何進行光學查詢，以便確定特殊結合物質或結合配偶體是否吸附在所述表面上。在用白光照射所述生物傳感器時，沒有明顯結合材料的棱椎結構能夠反射由棱椎結構的階梯高度決定的波長。當較高折射率的材料，如結合配偶體或特殊結合物質整合在反射金屬表面上時，反射波長被修飾成向更長的波長偏移。從階梯形階梯結構上反射的顏色理論上是以階梯高度的2倍乘以涂覆在SRVD生物傳感器的片狀材料的第一表面上的反射材料的折射率得出的。反射材料可以是例如銀、鋁或金。
將上述一種或多種特殊結合物質固定在SRVD生物傳感器的反射材料上。一種或多種特殊結合物質可以排列在所述反射材料的上述一系列一個或多個不同位置上。
由于來自SRVD生物傳感器的光線的反射波長被局限在窄的帶寬，所以所述表面的光學特征的非常小的變化自身在反射波長光譜的易于觀察的改變中顯示。與平表面的反射光譜測定法相比，窄反射帶寬提供了表面吸附靈敏性優點。
在用寬帶光波長照射時，SRVD生物傳感器主要反射第一種單一光學波長的光線，并且在將一種或多種特殊結合物質固定在反射表面上時，反射第二種單一光學波長的光線。對第二種光學波長的反射來自光學干涉。當所述一種或多種特殊結合物質結合在它們各自的結合配偶體上時，由于光學干涉，SRVD生物傳感器還能反射第三種單一光學波長的光線。
反射顏色的讀出可以通過將顯微鏡物鏡聚焦在單個微陣列斑點上并且讀出反射光譜連續進行，或者平行進行，例如，通過將微陣列的反射圖像投射在高分辨彩色CCD照相機上。
在本發明的一種實施方案中，提供了光學裝置。光學裝置包括類似于本發明的生物傳感器的結構；不過，光學裝置不包括固定在光柵上的一種或多種結合物質。光學裝置可以用作，例如，窄帶濾光片。
特殊結合物質和結合配偶體通過例如，物理吸附或通過化學結合，將一種或多種特殊結合物質固定在一維或二維或三維光柵或覆蓋層(如果有的話)上。特殊結合物質可以是，例如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜交溶液、含有來自組合化學文庫的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物或生物學樣品。生物學樣品可以是例如血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤的勻漿物、滑液、糞便、唾液、痰、囊腫液、羊水、腦脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼淚或前列腺液。所述聚合物選自下列一組每個分子上具有多個活性位點的長鏈分子，它由水凝膠、葡聚糖、聚氨基酸及其衍生物組成，所述衍生物包括聚-賴氨酸(包括聚-l-賴氨酸和聚-d-賴氨酸)、聚-phe-賴氨酸和聚-glu-賴氨酸。
優選的是，將一種或多種特殊結合物質排列在生物傳感器上的一系列一個或多個不同位置上。一系列特殊結合物質包括位于本發明的生物傳感器表面上的一種或多種特殊結合物質，以便表面包括很多不同位置，每一個位置具有不同的特殊結合物質或具有不同量的特殊結合物質。例如，一個系列可以包括1、10、100、1,000，10,000或100,000個不同位置。這樣的生物傳感器表面被稱作陣列，因為一種或多種特殊結合物質通常是沿x-y坐標以規則的柵格模式排布的。不過，本發明的陣列可以包括以任何類型的規則或不規則的模式排布的一種或多種特殊結合物質。例如，不同位置可以限定一種或多種特殊結合物質的一系列斑點。一系列斑點的直徑可以為大約50-大約500微米。一系列斑點的直徑還可以為大約150-大約200微米。可以將一種或多種特殊結合物質結合在它們的特殊結合配偶體上。
本發明的生物傳感器上的陣列可以通過將一種或多種特殊結合物質的微滴放置在，例如，光柵或覆蓋層表面的x-y柵格位置上產生。在所述生物傳感器接觸包括一種或多種結合配偶體的測試樣品時，所述結合配偶體優選被吸引到微陣列上包括對所述結合配偶體具有高親和力的特殊結合物質的不同位置上。某些不同位置能夠將結合配偶體聚集在它們的表面上，而其他位置則不能。
特殊結合物質能夠專一性地結合添加在本發明的生物傳感器表面上的結合配偶體。特殊結合物質能夠專一性地結合它的結合配偶體，而基本上不能結合添加在生物傳感器表面上的其他結合配偶體。例如，當所述特殊結合物質是抗體，并且它的結合配偶體是特殊抗原時，所述抗體能專一性地結合所述特殊抗原，而基本上不能結合其他抗原。結合配偶體可以是例如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜交溶液、含有來自組合化學文庫的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物或生物學樣品。生物學樣品可以是例如血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤的勻漿物、滑液、糞便、唾液、痰、囊腫液、羊水、腦脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼淚和前列腺液。
本發明的陣列的一種例子是核酸陣列，其中，所述陣列中的每一個不同位置包括不同的核酸分子。在本實施方案中，在所述核酸微陣列中的斑點能檢測與測試樣品中核酸的相對鏈的互補性化學結合。
盡管微量滴定板是用于生物化學測定的最常見的形式，但微陣列越來越被認為是使可以同時測量的生物化學相互作用的數目最大化，同時使珍貴試劑的體積最小化的方法。通過將特殊結合物質與微陣列點樣器(spotter)應用在本發明的生物傳感器上，可以獲得的特殊結合物質的密度為10,000特殊結合物質/英寸2。通過聚焦照射光束來檢查單個微陣列位置，可以將生物傳感器用作無標記微陣列讀出系統。
另外，可以組合微陣列和微量滴定板實施方案，以便將一種或多種特殊結合物質排列在傳感器表面上的一系列一個或多個不同位置上，所述表面位于微量滴定板的一個或多個孔內，并且包括微量滴定板的一個或多個表面，優選底面。所述特殊結合物質的陣列包括位于微量滴定板孔內傳感器表面上的一種或多種特殊結合物質，以便表面包括一個或多個不同位置，每一個位置具有不同的特殊結合物質，或具有不同量的特殊結合物質。例如，陣列可以包括1、10、100、1,000，10,000或100,000個不同位置。因此，微量滴定板實施方案的每一個孔可以在它里面具有一系列與微量滴定板實施方案的其他孔分離的一個或多個不同位置，這允許在本發明的微量滴定板上對多種不同樣品進行處理，一種或多種樣品用于每一個分離的孔。在任何一個孔內的一個或多個陣列可以與出現在相同微量滴定板上的任何其他微量滴定板孔中的一個或多個陣列相同或不同。
固定或一種或多種特殊結合物質將一種或多種結合物質固定在生物傳感器上，以便特殊結合物質不會被清洗程序洗掉，因此它與測試樣品中結合配偶體的結合不受生物傳感器表面的妨礙。業已實施了若干種不同類型的表面化學策略，以便將特殊結合物質共價附著在，例如，玻璃上，以便用于各種類型的微陣列和生物傳感器。相同的方法可容易地適用于本發明的生物傳感器。對生物傳感器進行表面制備，以便它包括合適的官能團，用于結合一種或多種特殊結合物質，它是生物傳感器生產工藝的主要部分。
可以通過物理吸附(即，不使用化學接頭)或通過化學結合(即，使用化學接頭)以及電化學結合、靜電結合、疏水性結合和親水性結合，將一種或多種特殊結合物質附著在生物傳感器表面上。化學結合能在生物傳感器表面上產生更強的特殊結合物質的附著，并且提供表面結合分子的特定的方向和構象。
在下面的實施例2中提供了特殊結合物質與本發明的生物傳感器化學結合的若干例子。其他類型的化學結合包括，例如，通過以下官能團的結合胺基、醛基、鎳基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、硫醇基、有機磷酸酯基、脂基、磷脂基或類固醇基。所述表面可用于將若干種不同類型的化學接頭附著在生物傳感器表面上，如圖8所示。例如，可以將胺表面用于附著若干種類型的接頭分子，同時將醛表面用于直接結合蛋白，而不需要額外的接頭。可以將鎳表面用于結合具有整合的組氨酸(“his”)標記的分子。利用鎳-激活的表面進行的“his-標記的”分子的檢測為本領域所熟知(Whitesides，Anal.Chem.68，490，(1996))。
將特殊結合物質固定在塑料、環氧樹脂或高折射率材料上，基本上可以按照固定在玻璃上的方法進行。不過，可以取消酸洗滌步驟，其中，這種處理會破壞固定所述特殊結合物質的材料。
為了檢測濃度低于大約0.1ng/ml的結合配偶體，優選擴增并且將結合在生物傳感器上的結合配偶體轉換成生物傳感器表面上的額外的層。作為增加了的光程長度的結果，可以容易地檢測增加了的沉積在生物傳感器上的質量。通過將更大的質量整合在生物傳感器表面上，還可以增加所述表面上結合配偶體的光密度，因此能夠在不添加物質的情況下產生更大的共振波長偏移。添加物質可以通過例如，酶促方法，通過“夾心”測定，或者通過將物質以具有各種大小和組成的適當綴合的珠或聚合物形式直接應用在生物傳感器表面上而實現。這種原則業已應用在其他類型的光學生物傳感器上，以用于證實靈敏度相對不進行質量放大的靈敏度極限而言提高了超過1500x。參見，例如，Jenison等，“Interference-based detection of nucleic acidtargets on optically coated silicon”，Nature Biotechnology，1962-65，2001。
作為例子，圖9A示出了NH2-活化的生物傳感器表面可能具有特殊結合物質，包括固定在該表面上的單鏈DNA捕獲探針。所述捕獲探針選擇性地與它的互補性靶結合配偶體相互作用。反過來，可以將所述結合配偶體設計成包括能夠結合“檢測”分子的序列或標記。如圖9A所示，檢測分子可以包括，例如，連接在辣根過氧化物酶(HRP)上的接頭，當所述接頭接觸正確的酶時，會選擇性地僅將額外材料沉積在生物傳感器上存在檢測分子的部位。所述方法能夠在幾分鐘內將，例如，300_的可檢測生物材料添加在生物傳感器上。
還可將“夾心”方法用于增強檢測靈敏度。在該方法中，可以將大分子量分子用于放大低分子量分子的存在。例如，分子量為，例如，大約0.1kDa-大約20kDa的結合配偶體可以進行標記，例如，用琥珀酰亞胺基-6-[a-甲基-a-(2-吡啶基-二硫代)甲苯甲酰胺]己酸酯(SMPT)或庚二亞胺酸二甲酯(dimethylpimelimidate)(DMP)、組氨酸或生物素分子進行標記，如圖9B所示。當所述標記是生物素時，生物素分子能強有力地與鏈霉抗生物素蛋白結合，它的分子量為60kDa。由于生物素/鏈霉抗生物素蛋白相互作用是高度專一性的，所以所述鏈霉抗生物素蛋白能夠將只能由的小的結合配偶體產生的信號放大60倍。
通過使用化學衍生化的小顆粒能夠將檢測靈敏度進一步提高。用膠態金、各種塑料，或直徑大約為3-300nm的玻璃制備的“納米顆粒(nanoparticle)”可以用能夠使它們選擇性地與結合配偶體共價結合的分子種類涂覆。例如，如圖9C所示，能夠用鏈霉抗生物素蛋白共價涂覆的納米顆粒來增強生物素-標記的結合配偶體在生物傳感器表面上的可見度。盡管鏈霉抗生物素蛋白分子本身的分子量為60kDa，但衍生化的珠的分子量可以為任何大小，包括，例如，60KDa。大型珠的結合，會導致生物傳感器表面上光密度的大的改變，并且導致可容易檢測的信號。該方法可能導致靈敏度分辨率增加大約1000x。
裝有液體的容器本發明的光柵可以包括內表面，例如，裝有液體的容器的底面，裝有液體的容器可以是，例如，微量滴定板孔、試管、培養皿或微流體通道。本發明的一種實施方案是整合在任何類型微量滴定板中的生物傳感器。例如，通過將反應容器壁組裝在共振反射表面上，可將生物傳感器整合在微量滴定板的底面中，如圖32A和32B所述，以便每一個反應“斑點”能夠接觸不同的檢測樣品。因此，每一個單獨的微量滴定板孔可以起著單獨的反應容器的作用。因此，單獨的化學反應可以在相鄰的孔中進行，而沒有混雜的反應流體，并且可以將化學上不同的試驗溶液應用到單獨的孔中。
可以用若干種方法將本發明的生物傳感器或光柵附著在無底微量滴定板的底面上，所述方法包括例如，粘合劑附著、超聲波焊接和激光焊接。
用于藥物高通量篩選實驗室、分子生物學研究實驗室和診斷測定實驗室的最常見的測定形式是微量滴定板。所述板是標準尺寸的塑料盒，它可能包括排列成柵格的大約2、6、8、24、48、96、384、1536或3456個單獨的反應容器。由于所述平板的標準機械結構，所以將液體分配、自動化平板操縱和檢測系統設計成能夠用這種常見形式工作。本發明的生物傳感器可以整合在標準微量滴定板的底面中。參見，例如，圖32A。由于生物傳感器表面能夠以大的面積生產，并且由于所述讀出系統不會與生物傳感器表面物理接觸，所以可以確定任意數目的單獨的生物傳感器區域，這些區域只會受到照射光學元件和x-y臺的聚焦分辨率的制約，所述臺掃描橫過所述生物傳感器表面的所述照射/檢測探頭。
使用生物傳感器的方法本發明的生物傳感器可用于并行地研究一種或多種特殊結合物質/結合配偶體相互作用。一種或多種特殊結合物質與它們各自的結合配偶體的結合，可以在不使用標記的情況下檢測，其中通過將一種或多種結合配偶體應用在在它們的表面上固定有一種或多種特殊結合物質的生物傳感器上。用光線照射生物傳感器，并且檢測來自生物傳感器的最大反射波長，或最小透射光波長。如果一種或多種特殊結合物質業已結合在它們各自的結合配偶體上，那么與一種或多種特殊結合物質沒有結合在它們各自的結合配偶體上的情況相比光線的反射波長會發生偏移。在用包括所述一種或多種特殊結合物質的一系列一個或多個不同位置涂覆生物傳感器時，檢測來自所述生物傳感器的每一個不同位置的最大反射波長或最小透射光波長。
在本發明的一種實施方案中，可以將多種特殊結合物質，例如，抗體以陣列形式固定在本發明的生物傳感器上。參見，例如，圖31。然后讓所述生物傳感器與包括結合配偶體，如蛋白的目標測試樣品接觸。只有能專一性地結合固定在生物傳感器上的抗體的蛋白保持結合在所述生物傳感器上。這種方法基本上是酶聯免疫吸附測定的大規模形式；不過，不需要使用酶或熒光標記。對于高通量應用來說，生物傳感器可以排列成一系列陣列，其中，構成特殊結合物質陣列的若干生物傳感器以陣列排列。參見，例如，圖33。所述一系列陣列可以是，例如，浸沒在微量滴定板中的，以便同時進行多種測定。在另一種實施方案中，生物傳感器可以出現在光纖探頭的頂端，以便對生物化學物質進行體內檢測。參見圖14。
可以通過將一種或多種酶應用在業已固定了一種或多種特殊結合物質的生物傳感器上來檢測酶活性。洗滌所述生物傳感器，并且用光線照射。檢測來自所述生物傳感器的光線反射波長。當所述一種或多種酶通過酶促活性通過，例如，將所有或部分特殊結合物質從所述生物傳感器表面上切割下來而改變了所述生物傳感器的所述一種或多種特殊結合物質時，所述光線的反射波長發生了偏移。本發明的另一種實施方案是檢測一種或多種完整的特殊結合物質從比色共振反射光學生物傳感器的表面上切割的方法。該方法包括將一種或多種結合物質固定在比色共振反射光學生物傳感器的表面上的不同位置，從而檢測所述不同位置的PWV，應用一種或多種切割分子，檢測不同位置的PWV，并且比較起始PWV與隨后的PWV。檢測一種或多種完整的特殊結合物質的切割，并且峰波長值(PWV)是結合在生物傳感器上的所述特殊結合物質的相對量度。切割分子是能夠切割其他分子的分子，例如，切割分子可以是酶，如蛋白酶、脂酶、核酸酶、裂解酶、肽酶、水解酶、連接酶、激酶和磷酸酶。
比色共振反射光學生物傳感器可以構成微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養皿或微流體通道的內表面。所述特殊結合物質的固定可以通過與，例如，以下官能團結合而受到影響鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、硫醇基、有機磷酸酯基、脂基、磷脂基或類固醇基。另外，通過物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水性結合或親水性結合，將所述特殊結合物質固定在比色共振反射光學生物傳感器的表面上。
可以將一種或多種特殊結合物質排列在生物傳感器的表面上的一系列一個或多個不同位置上。所述一個或多個不同位置可以限定直徑大約為50-500微米，或大約150-200微米的微陣列斑點。
所述檢測一種或多種完整的特殊結合物質從比色共振反射光學生物傳感器表面上切割的上述方法還可以包括其他步驟。可以將一種或多種特殊結合物質固定在在微量滴定板的孔中限定陣列的一個或多個不同位置上。限定微陣列的所述一個或多個不同位置可以位于比色共振反射光學生物傳感器的表面上，反過來，所述表面又可以包括所述孔的內表面。測定所述孔內一個或多個不同位置的PWV。將一種或多種切割分子應用在所述孔上。檢測所述孔內一個或多個不同位置的PWV。比較起始PWV和隨后的PWV。檢測所述孔內一個或多個不同位置上的一種或多種完整的特殊結合物質的切割。峰波長值(PWV)是結合在所述生物傳感器上的所述特殊結合物質的相對量度。
本發明的另一種實施方案提供了檢測一種分子如何有效抑制酶或結合配偶體的活性，即，檢測所述分子的“抑制活性”的方法。在一種實施方案中，將懷疑具有抑制活性的一種或多種分子添加到附著了一種或多種特殊結合物質的生物傳感器上，然后添加已知能對所述特殊結合物質產生作用的一種或多種酶。例如，蛋白酶、脂酶、核酸酶、裂解酶、肽酶、水解酶、連接酶、激酶、磷酸酶或能夠產生特殊結合物質的可檢測變化的任何其他類型的酶。所述酶能夠影響特殊的結合配偶體，例如，通過從生物傳感器上切割大體上完整的一種結合物質或結合物質的一部分。還可以將已知能結合固定在所述生物傳感器上的一種或多種特殊結合物質的一種或多種結合配偶體添加在所述生物傳感器上。
沒有抑制活性的分子使得酶活性不會減弱；具有大體上完全抑制活性的分子能夠大體上完全停止反應；而具有部分抑制作用的分子能夠部分停止所述反應。另外，沒有抑制活性的分子允許結合配偶體結合在它的特殊結合物質上。具有部分抑制作用的分子允許結合配偶體部分或較弱地結合在它的特殊結合物質配偶體上。具有抑制活性的分子，能夠抑制結合配偶體與它的特殊結合配偶體的結合。因此，所述方法提供了檢測一種或多種分子對酶或結合配偶體的抑制活性的技術。
檢測一個或多個不同位置的PWV之后，將懷疑具有抑制活性的一種或多種分子應用在一個或多個不同位置上，并且將一種或多種酶或結合配偶體應用在不同位置上。檢測一個或多個不同位置的PWV，并且與起始PWV進行比較。另外，所述懷疑具有抑制活性的一種或多種分子可以與一種或多種酶或結合配偶體混合，可將它們一起應用在所述一個或多個不同位置上。上述起始PWV相對于上述隨后的PWV的減少或增加，是(1)被所述酶改變的結合物質的比例或來自所述生物傳感器表面的結合在生物傳感器上的結合配偶體的量的相對量度或(2)懷疑具有抑制活性的一種或多種分子的相對效力的量度。
上述檢測一種或多種分子對酶或結合配偶體的抑制活性的方法還可以包括其他步驟。例如，可以將一種或多種特殊結合物質固定在在微量滴定板或其他液體容納裝置的孔中限定陣列的一個或多個不同位置上。限定陣列的所述一個或多個不同位置位于比色共振反射光學生物傳感器的表面上，其包括所述孔的內表面。檢測所述孔中所述一個或多個不同位置的PWV，然后將懷疑具有抑制活性的一種或多種分子應用到所述孔中。將一種或多種酶或結合配偶體應用到所述孔中，并且檢測所述孔中所述一個或多個不同位置的PWV。將起始PWV與隨后的PWV進行比較，并且發現一種或多種分子對所述孔內的每一個不同位置上的酶或結合配偶體的抑制活性。另外，所述懷疑具有抑制活性的一種或多種分子能夠與一種或多種酶或結合配偶體混合，將它們同時應用到所述孔中。
另外，可以將測試樣品，例如，含有結合配偶體的細胞裂解物應用在本發明的生物傳感器上，然后洗滌，以便除去未結合的材料。結合在生物傳感器上的結合配偶體可以從生物傳感器上洗脫，并且被鑒定，例如，通過質譜分析法鑒定。可任選地將噬菌體DNA展示文庫應用在本發明的生物傳感器上，然后洗滌，以便除去未結合的材料。可以分離結合在生物傳感器上的單個噬菌體顆粒，并且隨后對所述噬菌體顆粒中的插入片段進行測序，以便確定所述結合配偶體的特征。
本發明的另一種實施方案提供了檢測細胞遷移和趨化性的方法。具體地講，細胞能夠在比色共振反射光學生物傳感器的一端生長，在孔中或者以陣列形式生長。包括所述細胞的生物傳感器的末端可任選地被通過使用半透膜，從放置趨化劑的相反一端分離。然后可以使用由圖象分光計，或另外由能夠移動以便從生物傳感器的多個位置上讀取數據的光纖探頭組成的檢測系統檢測所述細胞的位置，并且反過來允許計算細胞遷移速度。
本發明的另一種實施方案提供了檢測細胞生長模式變化的方法。簡單地講，細胞能夠在比色共振反射光學生物傳感器上生長；檢測PWV；將試劑應用在所述細胞上；檢測PWV；并且比較起始PWV和隨后的PWV，其中，起始PWV相對隨后的PWV的差異表明了細胞生長模式的變化。PWV的差異與細胞生長模式的變化相關。
細胞生長模式的變化可選自下列一組細胞形態學、細胞粘著、細胞遷移、細胞增殖和細胞死亡。一種類型的原核或真核細胞或兩種或兩種以上類型的真核或原核細胞可以在所述生物傳感器上生長。所述生物傳感器可以構成選自下列一組的容器內表面微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養皿和微流體通道。
本發明的另一種實施方案提供了檢測在保持與比色共振反射光學生物傳感器接觸的半滲透性內部套管中生長的細胞中釋放的分子的方法。所述半滲透性內部套管可以是，例如，可拆卸的多孔或不可拆卸的多孔插入部件，它保持與所述生物傳感器表面接觸或緊靠該表面，其中，所述套管是從在它表面上培養的細胞中分泌的分子可透過的，并且，其中，所述套管是完整的細胞不可透過的。可以將套管安裝在微量滴定板或其他容器的孔中，其中，本發明的生物傳感器構成所述孔或其他容器的內表面。
該方法可以包括以下步驟將一種或多種特殊結合物質固定在比色共振反射光學生物傳感器的表面上的一個或多個不同位置；檢測所述一個或多個不同位置的PWV；使細胞在保持與比色共振反射光學生物傳感器接觸的半滲透性內部套管的所述一個或多個不同位置上生長；檢測所述一個或多個不同位置的PWV；并且比較起始PWV和隨后的PWV。檢測從生長在保持與比色共振反射光學生物傳感器接觸的半滲透性內部套管中的細胞釋放的分子與所述一種或多種特殊結合物質的結合。另外，起始PWV是與生物傳感器結合的所述特殊結合物質的相對量度，而起始PWV相對隨后的PWV的差異是從生長在半滲透性內部套管中的細胞釋放的與所述特殊結合物質結合的分子的相對量度。所述半滲透性內部套管是可拆卸的或不可拆卸的多孔插入部件。
檢測從生長在保持與比色共振反射光學生物傳感器接觸的半滲透性內部套管中的細胞釋放的分子的上述方法還可以包括其他步驟。例如，可以將一種或多種結合物質固定在在微量滴定板的孔中限定陣列的一個或多個不同位置上，其中，所述比色共振反射光學生物傳感器構成所述孔的內表面。檢測在所述孔中限定陣列的所述一個或多個不同位置的PWV，然后在保持與所述孔接觸的半滲透性內部套管中生長細胞。最后的步驟是檢測所述孔中所述一個或多個不同位置的PWV，并且比較起始PWV和隨后的PWV。起始PWV相對隨后的PWV的差異，表明了從生長在孔內的所述半滲透性內部套管上的細胞分泌的一種或多種分子與固定在比色共振反射光學生物傳感器的表面上的孔中的一個或多個不同位置上的所述一種或多種特殊結合物質的相對結合。
檢測結合配偶體與特殊結合物質結合的能力，任選地后隨檢測從所述生物傳感器的一個或多個不同位置大體上完全或部分除掉結合的特殊結合物質的能力，是本發明的重要方面。本發明的生物傳感器還能夠檢測并且定量來自樣品的結合配偶體的量，所述樣品結合在限定陣列的一個或多個不同位置上，其通過測量光線反射波長的偏移實現。例如，在一個或多個不同位置上的波長偏移可以與其他不同位置上的正和負對照進行比較，以便測定所結合的特殊結合物質的量。重要的是，可以將多個這樣的一個或多個不同位置排列在生物傳感器表面上，并且所述生物傳感器可以構成容器內表面，如大約2、6、8、24、48、96、384、1536或3456個孔的微量滴定板。例如，在將96個生物傳感器附著在固定裝置上，并且每一個生物傳感器包括大約100個不同位置時，可以同時進行大約9600種生物化學測定。
因此，與用于表面等離子體共振、共振鏡子和波導生物傳感器的測定方法不同，所述方法使得能夠在共振光學生物傳感器表面上同時進行數千種單獨的結合反應。很顯然，這種技術可用于并行測量大量生物分子相互作用的應用中，特別是當分子標記能改變或抑制被研究的分子的功能時。用蛋白靶對藥用化合物文庫進行高通量篩選，和蛋白組學的蛋白-蛋白相互作用的微陣列篩選是需要由本發明方法提供的靈敏度和通量的應用的例子。
檢測系統檢測系統可以包括生物傳感器，將光線導向生物傳感器上的光源，和檢測從生物傳感器上反射的光線的探測器。在一種實施方案中，通過采用濾光片可以簡化讀出裝置，以便只有超過確定閾值的正結果會啟動檢測。
光源能夠從生物傳感器的頂面照射，即，固定一種或多種特殊結合物質的表面，或者從它的底面照射。通過測量本發明的生物傳感器的每一個不同位置上的共振波長的偏移，可能確定在它上面結合了結合配偶體的不同位置。可以將偏移程度用于確定測試樣品中結合配偶體的量，以及一種或多種特殊結合物質與測試樣品的結合配偶體的化學親和力。
生物傳感器可以被照射兩次。第一次測量確定了在生物傳感器上固定了一種或多種特殊結合物質的生物傳感器陣列的一個或多個不同位置的反射光譜。第二次測量確定了在將一種或多種結合配偶體應用在生物傳感器上之后的反射光譜。兩次測量之間的峰波長差是業已專一性地結合在生物傳感器上或結合在生物傳感器的一個或多個不同位置上的結合配偶體的量的量度。這種照射方法能夠控制生物傳感器表面上的小的不均勻性，這種不均勻性可能導致峰共振波長中具有小的波動的區域。這種方法還能夠控制固定在生物傳感器上的特殊結合物質的不同的濃度或分子量。
可以利用計算機模擬來確定峰共振波長和入射照射角之間的預期的依賴性。圖1所示的生物傳感器可用于說明的目的。所選擇的基片是玻璃(n基片＝1.50)。光柵是四氮化三硅正方形的光帶圖形(t2＝180nm，n2＝2.01(n＝折射率)，k2＝0.001(k＝吸收系數))，其周期為510nm，填充系數為56.2％(即，56.2％的表面被四氮化三硅正方形所覆蓋，而其余部分是位于正方形之間的面積)。位于四氮化三硅正方形之間的面積用較低折射率的材料填充。還用相同的材料覆蓋所述正方形，以便提供均勻的扁平頂面。對于這種模擬來說，選擇玻璃層(n1＝1.40)，其以t2＝100nm覆蓋四氮化三硅正方形。
利用GSOLVER軟件構建作為波長函數的反射強度的模型，它利用了完整的三維矢量代碼，其中使用雜合嚴格的耦合波分析(Rigorous Coupled Wave Analysis)和模式分析(Modal analysis)。GSOLVER計算來自任意復雜的光柵結構的平面波照射的衍射場和衍射效率。所述照射可以來自任何入射光和任何偏振化。
圖10圖示峰共振波長對入射照射角的依賴性。所述模擬表明，在入射光角和測量的峰波長之間存在顯著相關。這一結果表明，照射光束的瞄準，以及照射光束和反射光束之間的排列，會直接影響測量的共振峰譜線寬度。如果照射光束的瞄準較差，將會有不同的照射角入射在生物傳感器表面上，并且要測量比純粹的平行光入射更寬的共振峰。
由于生物傳感器的較低的靈敏度限制與測定峰最大值的能力相關，所以重要的是測量窄的共振峰。因此，在所述生物傳感器上使用瞄準照射系統，提供了最大可能的靈敏度。
用于照射生物傳感器表面和用于收集反射光的一種類型的檢測系統是探頭，它包括，例如，六個連接在光源上的照射光纖，和一個連接在分光計上的收集光纖。光纖的數目并不重要，任何數目的照射或收集光纖都是可行的。所述光纖是成束排列的，以便所述收集光纖位于束的中央，并且由六個照射光纖環繞。光纖束的頂端與準直透鏡連接，所述透鏡將照射聚焦在生物傳感器的表面上。
在這種探頭結構中，照射和收集光纖是并排排列的。因此，當準直透鏡正確調整到將光線聚焦在生物傳感器表面上時，人們可以看到六個明確確定的照射的圓環區和一個中央黑暗區。由于所述生物傳感器不能散射光線，而是反射平行光束，所以沒有光線會入射在收集光纖，并且不會出現共振信號。只有通過對準直透鏡進行散焦，直到六個照射區重疊成一個中央區，才可以將任何光線都反射到收集光纖中。由于只有進行散焦的、略微非平行的光線才可能產生信號，所以所述生物傳感器不會被單一入射角所照射，而是由多種入射角照射。入射角的范圍導致了混合的共振波長，這是由于圖10所示的依賴性。因此，測量的共振峰比其他方式可能出現的共振峰更寬。
因此，需要照射并且收集光纖探頭，以便在空間上擁有相同的光程。可以用若干種方法共同定位照射和收集光程。例如，一個照射光纖，它的第一末端與光源連接，所述光源將光線導向生物傳感器上，和一個收集光纖，它的第一末端與探測器連接，所述檢測器檢測從生物傳感器上反射的光線，它們彼此由第二個末端連接在第三個光纖探頭上，該探頭可以同時起著照射器和收集器的作用。第三個光纖探頭以對生物傳感器直角入射角定向，并且支持反向照射和反射光學信號。在圖11中示出了這樣一種檢測系統的例子。
檢測的另一種方法涉及使用分光器，它能夠使與光源連接的一個照射光纖的方向與和探測器連接的收集光纖成90度角。引導光線通過照射光纖探頭進入分光器，由它將光線導向生物傳感器。反射光向后返回進入分光器，由它將光線導向收集光纖探頭。在圖12中示出了這種檢測裝置的例子。分光器允許照射光線和反射光線在分光器和生物傳感器之間擁有共同的光程，因此可以完美地使用平行光而不進行散焦。
角度掃描本發明的檢測系統是基于生物傳感器表面的平行白光照射，和反射光束共振峰的光譜學測量的。生物傳感器表面上的分子結合是通過峰波長值的偏移表現的，而波長的增加相當于分子吸收的增加。
正如在理論模擬和實驗數據中所表明的，共振峰波長在很大程度上取決于檢測光束的入射角。圖10表示模擬本發明的生物傳感器的這種依賴性。由于共振峰波長的角度依賴性，所以入射白光需要很好地瞄準。光束的角分散加寬了共振峰，并且降低了生物傳感器的檢測靈敏度。另外，來自光譜學測量的信號質量取決于光源的能量和檢測器的靈敏度。為了獲得高信噪比，可能需要每一個檢測位置的超長的積分時間，因此，延長了讀出生物傳感器平板的總時間。可調諧激光光源可用于檢測光柵共振，不過價格昂貴。
在本發明的一種實施方案中，通過將激光光束用于照射生物傳感器，并且將光檢測器用于測量反射光束能量解決了上述缺陷。可以將掃描鏡裝置用于改變激光光束的入射角，并且將光學系統用于保持入射激光光束的瞄準。參見，例如，“Optical Scanning”(Gerald F.Marchall ed.，Marcel Dekker(1991)。任何類型的激光掃描都可以使用。例如，在本發明中可以使用以每秒鐘大約2線-大約1,000線的速度產生掃描線的掃描裝置。在本發明的一種實施方案中，掃描裝置每秒鐘可以掃描大約50線-大約300線。
在一種實施方案中，所述反射光束通過激光掃描光學系統的一部分，并且通過一個光檢測器測量。所述激光光源可以是二極管激光器，其波長為，例如，780nm、785nm、810nm或830nm。這種類型的激光器二極管在最高達到150mW的能量水平容易得到，并且它們的波長與高靈敏度的Si光電二極管相當。因此，所述檢測器可以是基于光電二極管生物傳感器的。在圖13中示出了這種檢測系統的一種例子。光源(300)向掃描裝置(400)提供光線，由它將光線導入光學系統(500)。光學系統(500)將光線導入生物傳感器(600)。光線從生物傳感器(600)上反射到光學系統(500)中，后者將光線導入光學信號探測器(700)。在圖30中示出了檢測系統的一種實施方案，該附圖表明，在掃描鏡改變其角位置時，在所述表面上的激光光束的入射角名義上改變了鏡面角位移的兩倍。所述掃描鏡裝置可以是線性檢流計，在大約2Hz至最高大約120Hz的頻率下工作，并且機械掃描角為大約10度-大約20度。在該例子中，一次掃描可以在大約10毫秒內完成。還可以使用共振檢流計或多邊形掃描儀。圖30中所示出的例子包括用于角掃描的簡單的光學系統。它由一對透鏡組成，在它們之間具有共同的焦點。可以設計所述光學系統，以便獲得激光瞄準和反射光束收集的最佳性能。
角分辨率取決于檢流計規格和反射光采樣頻率。假設檢流計分辨率為30arcsec mechanical，則相應的生物傳感器的角掃描分辨率為60arcsec，即0.017度。另外，假設采樣速度為100ksamples/sec，則在10毫秒內具有20度的掃描。結果，量子化步驟對于1000個樣品為20度，即每個樣品0.02度。在本例子中，共振峰寬度為0.2度，正如由Peng和Morris所顯示的(Experimental demonstration ofresonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings，Optics Lett.，21549(1996))，它能由10個數據點覆蓋，每一個數據點相當于該檢測系統的分辨率。
該檢測系統的優點包括通過激光光束獲得的良好的入射光瞄準，由于激光器二極管的高的光束能量產生的高信噪比，由于用一個元件光檢測器替代了分光計而導致的低成本，以及由于角掃描產生的共振峰的高分辨率。
光纖探頭生物傳感器本發明的生物傳感器可以出現在多種模式光纖探頭的頂端。這種光纖探頭可用于疾病和狀況的生物標記的體內檢測，所述疾病和狀況例如，心臟動脈疾病、癌癥、炎癥和膿毒病。可以將一個生物傳感器元件(包括，例如，數百個光柵周期)生產成光纖探頭頂端，或用玻璃基片制成，并且附著在光纖探頭頂端。參見圖14。將單一光纖用于提供照射和測量共振反射信號。
例如，類似于圖11的光纖探頭結構可用于將照射光纖和檢測光纖耦合成單一反向光纖，其中將生物傳感器嵌入或附著在它的頂端。將光纖探頭插入哺乳動物體內，例如人體。可以在將所述探頭插入體內時照射并且檢測反射信號。
提供以下實施例只是用于說明目的，而不希望限定上面以廣義形式描述的本發明的范圍。在本公開內容中所引用的所有參考文獻都被收作本文參考。
實施例1固定化蛋白檢測為了證實生物傳感器對它表面上的生物分子進行定量的能力，將以各種濃度溶解在H2O中的BSA的小滴應用在圖1所示生物傳感器上。讓3μl小滴風干，留下分布在大約2mm直徑范圍內的少量BSA。在小滴沉積之前和之后測量每一個生物傳感器位置的峰共振波長，并且記錄峰波長偏移。參見圖34。
實施例2一種或多種特殊結合物質的固定將以下方案用在比色共振反射生物傳感器上，以便用胺官能團激活所述表面。可以將胺基用作若干類型接頭分子的隨后的共價結合的通用表面。
通過在過氧硫酸蝕刻劑(piranha etch)(70/30％(v/v)濃硫酸//30％過氧化氫)中浸泡12小時來清洗本發明的玻璃基片生物傳感器。用水充分洗滌所述生物傳感器。將所述生物傳感器浸泡在溶于無水丙酮的3％3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中1分鐘，然后用無水丙酮漂洗，并且風干。另外，將生物傳感器浸泡在溶于乙醇(Aldrich)的10％3-氨丙基三乙氧基硅烷(Pierce)溶液中1分鐘，然后用乙醇簡短地漂洗。然后在70℃下干燥激活的傳感器10分鐘。然后用水洗滌所述生物傳感器。
利用半定量方法驗證氨基在所述生物傳感器表面上的存在。將來自每一批氨基官能化生物傳感器的一個生物傳感器用5mL的50mM碳酸氫鈉，pH8.5簡短地洗滌。然后將所述生物傳感器浸泡在5mL的50mM碳酸氫鈉，pH8.5中，該溶液含有0.1mM硫代-琥珀酰亞胺基-4-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-丁酸酯(s-SDTB，Pierce，Rockford，IL.)，并且劇烈振蕩30分鐘。通過將3.0mg的s-SDTB溶解在1mL的DMF中來制備s-SDTB溶液，并且用50mM碳酸氫鈉，pH8.5稀釋到50mL。在溫育30分鐘之后，用20mL的ddH2O洗滌所述生物傳感器三次，隨后用5mL 30％高氯酸處理。橙色溶液的形成，表明了生物傳感器業已被胺成功的衍生化；未處理過的玻璃生物傳感器上沒有出現顏色變化。
在上述方法之后，通過高氯酸處理之后的溶液在495nm的吸收可以用作所述表面上胺基定量的指標。在一種類型的實驗中，Sigma載片、Cel-Associate載片和內部生物傳感器載片的吸收分別為0.627、0.647和0.728。這表明，生物傳感器表面的NH2活化水平與通過商業渠道獲得的微陣列玻璃載片的活化水平相當。
在用胺活化所述生物傳感器的上述方案之后，可以將接頭分子附著在所述生物傳感器上。在選擇交聯劑時，應當考慮諸如活性基團選擇性、間隔臂長度、溶解度和可切割性的問題。反過來，所述接頭分子能結合被用于專一性識別結合配偶體的所述特殊結合物質。作為一種例子，業已將下面所述方案用于將生物素接頭分子結合在胺活化的生物傳感器上。
用生物素活化胺涂覆的生物傳感器的方案用PBS(pH8.0)洗滌胺涂覆的生物傳感器三次。在PBS緩沖液(pH8)中以0.5mg/ml的濃度制備硫代-琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯(硫代-NHS-LC-生物素，Pierce，Rockford，Illinois)溶液。將2ml的硫代-NHS-LC-生物素溶液添加到每一個胺涂覆的生物傳感器上，并且在室溫下溫育30分鐘。用PBS(pH8.0)洗滌生物傳感器三次。所述硫代-NHS-LC-生物素接頭的分子量為556.58，長度為22.4_。所得到的生物傳感器可用于捕獲抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白分子。
用醛活化胺涂覆的生物傳感器的方案在0.1M磷酸鈉、0.05％疊氮化鈉、0.1％氰基硼氫鈉，pH7.0中，制備2.5％戊二醛溶液。將2ml的硫代-NHS-LC-生物素溶液添加到每一個胺涂覆的生物傳感器上，并且在室溫下溫育30分鐘。用PBS(pH7.0)洗滌生物傳感器三次。戊二醛接頭的分子量為100.11。可以將得到的生物傳感器用于結合蛋白和其他含胺的分子。反應通過形成席夫堿進行，隨后進行還原性胺化，得到了穩定的二級胺鍵。在一種實驗中，將通過本發明制備的涂覆的醛載片與通過商業渠道獲得的醛載片(Cel-Associate)進行比較時，發現在通過本發明人制備的載片上鏈霉抗生物素蛋白和抗兔IgG的結合增強了10倍。
用NHS活化胺涂覆的生物傳感器的方案在碳酸鈉緩沖液(pH8.5)中制備25mM N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)。將2ml的DSC溶液添加到每一個胺涂覆的生物傳感器上，并且在室溫下溫育2小時。用PBS(pH8.5)洗滌生物傳感器三次。DSC接頭的分子量為256.17。將所得到的生物傳感器用于含有羥基或胺的分子。該接頭是現有最小的同雙功能NHS酯交聯劑之一。除了上述方案之外，業已報道了很多其他表面活化和分子接頭技術，這些技術能最優化不同類型的生物分子的測定性能。其中最常見的是胺表面、醛表面和鎳表面。反過來，所述活化的表面可用于將若干不同類型的化學接頭附著在生物傳感器表面上，如表1所示。盡管將胺表面用于附著若干類型的接頭分子，但可以將醛表面用于直接結合蛋白，而不需要額外接頭。鎳表面被專門用于結合具有整合的組氨酸(“his”)標記的分子。用鎳活化的表面檢測“his-標記的”分子是眾所周知的(Sigal等，Anal.Chem.68，490(1996))。表1證實了用于制備和使用生物傳感器的步驟的順序的例子，以及可用于表面活化化學、化學接頭分子、特殊結合物質和結合配偶體分子的多種選項。還存在通過用諸如HRP或鏈霉抗生物素蛋白的較大的分子進行放大和使用諸如葡聚糖或TSPS的聚合材料增加可用于分子結合的表面積來增強檢測信號的可能性。

表1實施例3IgG測定作為檢測生物化學結合的初步證明，進行了測定，其中，通過用在實施例2中所描述的氨基表面化學激活制備生物傳感器，然后附著生物素接頭分子。將所述生物素接頭用于與鏈霉抗生物素蛋白受體分子專一性地相互作用和有效地將其連接在所述表面上，這通過在室溫下接觸溶于PBS中的50μg/ml濃度的鏈霉抗生物素蛋白溶液2-4小時來實現。所述鏈霉抗生物素蛋白受體能夠將任何生物素化的蛋白結合在所述生物傳感器表面上。對本實施例來說，將溶于磷酸緩沖液(PBS)中的3μl的生物素化的抗人IgG小滴沉積在生物傳感器表面上的4個不同位置上，其濃度為200μg/ml。讓所述溶液在生物傳感器上溫育30分鐘，然后用PBS充分漂洗。在生物素活化之后、鏈霉抗生物素蛋白受體應用之后以及在ah-IgG結合之后，測量所述4個位置的峰共振波長。圖34表示添加鏈霉抗生物素蛋白和ah-IgG都能導致共振波長的顯著的可測量的增強。
實施例4生物素/鏈霉抗生物素蛋白測定進行一系列測定，以便檢測生物素受體層對鏈霉抗生物素蛋白的結合。首先用胺化學活化生物傳感器，然后按上文所述方法附著NHS-生物素接頭層，然后，將溶于PBS中的3μl的鏈霉抗生物素蛋白小滴以不同的濃度應用在生物傳感器上。讓所述小滴在生物傳感器表面上溫育30分鐘，然后用PBS充分洗滌，用DI水漂洗。在鏈霉抗生物素蛋白結合之前和之后測量峰共振波長，并且峰共振波長偏移如圖16所示。觀察到了峰波長和鏈霉抗生物素蛋白濃度之間的線性關系，且在這種場合下，測量的最低鏈霉抗生物素蛋白濃度為0.2μg/ml。這種濃度相當于摩爾濃度為3.3nM。
實施例5蛋白-蛋白結合測定進行一種測定，以便證實蛋白-蛋白相互作用的檢測。正如以前所描述的，用胺化學和NHS-生物素接頭層活化生物傳感器。通過讓生物傳感器在室溫下接觸溶于PBS中的濃度為50μg/ml的溶液60分鐘，將山羊抗生物素抗體受體層附著在生物素接頭上，然后用PBS洗滌，并且用DI水漂洗。為了抑制非專一性蛋白與生物傳感器表面上的未結合的生物素的相互作用，讓所述生物傳感器表面接觸溶于PBS中的1％牛血清清蛋白(BSA)溶液30分鐘。該步驟的意圖是“阻斷”不希望的蛋白與所述生物傳感器相互作用。如圖17所示，將大量BSA整合到受體層中，正如通過增強誘導的峰波長所顯示的。在阻斷之后，將3μl各種濃度的抗山羊IgG小滴應用到生物傳感器表面上的不同位置上。讓所述小滴溫育30分鐘，然后用DI水充分漂洗。在對每一個斑點進行阻斷之前、阻斷之后、受體層結合之后以及抗山羊IgG檢測之后測量生物傳感器峰共振波長。圖17表示10μg/ml的抗山羊IgG濃度產生了易于測量的波長偏移。
實施例6未標記的ELISA測定生物傳感器陣列平臺的另一種應用是它在不需要酶標記，以及隨后的酶專一性底物相互作用以產生有色染料的前提下進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)。圖18表示實驗結果，其中，制備生物傳感器，以便用IFN-γ抗體受體分子檢測干擾素-γ(IFN-γ)。用SMPT接頭分子(Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois)將受體分子共價附著在NH2-活化的生物傳感器表面上。如圖18所示，測量生物傳感器表面上兩個相鄰位置的使用NH2、SMPT和抗人IFN-γ受體分子的峰共振波長偏移。讓以上兩個位置接觸溶于PBS中的濃度為100μg/ml的兩種不同的蛋白溶液。第一個位置接觸IFN-γ，預計它能與受體分子結合，而第二個位置接觸神經生長因子(NGF)，預計它不能結合所述受體。在溫育30分鐘之后，通過從底部照射測量所述生物傳感器，同時頂面保持浸泡在液體中。接觸IFN-γ的位置記錄到了0.29nm的波長偏移，而接觸NGF的位置記錄到了僅為0.14nm的波長偏移。因此，在不使用任何類型的酶標記或顏色產生性酶反應的前提下，所述生物傳感器能夠分辨含有不同類型蛋白的溶液。
實施例7蛋白酶抑制劑測定(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3)進行天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶抑制劑測定，以便驗證生物傳感器在與藥用化合物篩選相關的實驗中測量小分子存在和切割的能力。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(需要半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶)是一種蛋白酶家族，它能介導細胞死亡，并且在細胞凋亡中起著重要作用。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3，即一種效應子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，是研究的最充分的哺乳動物天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，因為它能夠專一性地切割大部分已知的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-相關底物。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3測定就是基于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3對4-氨基酸肽底物NHS-Gly-Asp-Glu-Val-Asp對硝基苯胺(NHS-GDEVD-pNA)的水解的，從而導致了pNA部分的釋放。
附著在GDEVD的N-末端的NHS分子提供了活性末端基團，以使得NHS-GDEVD-pNA復合物能夠共價結合在生物傳感器上，其中使得該復合物的pNA部分的朝向遠離所述表面。通過以這種方式附著，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3具有它的底物切割位點的最佳入口。
通過在3∶1的H2SO4∶H2O2溶液中清洗(室溫，1小時)制備生物傳感器，然后進行硅烷化(溶解在無水丙酮中的2％的硅烷，30秒)并且附著聚-phe-賴氨酸(PPL)層(溶解在pH6.0的PBS中的100μg/ml PPL，含有0.5M NaCl，10小時)。通過讓生物傳感器接觸溶于PBS中的10mM溶液(pH8.0，室溫，1小時)來附著NHS-GDEVD-pNA復合物。將微孔腔室密封在所述生物傳感器表面上，并且通過添加溶于1x酶緩沖液中的100μl的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(100ng/ml，室溫，90分鐘)來切割pNA。在接觸天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3溶液之后，用PBS洗滌所述生物傳感器。將使用分光光度計的單獨組的實驗用于證實所述復合物與生物傳感器的表面的附著，以及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3從表面結合的復合物中除掉pNA分子的功能活性。
在NHS-GDEVD-pNA復合物附著之前、所述復合物(MW＝860Da)附著之后以及在用天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3切割pNA(MW＝136)之后測量生物傳感器的峰共振頻率。如圖19所示，所述肽分子的附著是明確可測量的，正如隨后除掉pNA一樣。Δλ＝0.016nm的pNA去除信號為0.003nm的最小可檢測峰波長偏移的5.3x。所添加的分子量和扣除的分子量的比例(860Da/136Da＝6.32)與所觀察到的添加的和扣除的材料的峰波長偏移的比例(0.082nm/0.016nm＝5.14)非常吻合。
本實驗的結果證實，生物傳感器能夠在沒有標記的情況下測量小肽(在這種情況下，為5-聚體肽)，甚至檢測通過酶活性去除分子的130Da的部分。
實施例8蛋白-蛋白結合測定的反應動力學由于本發明的生物傳感器在浸泡在液體中時能夠作為時間的函數被連續地查詢，所以生物傳感器可用于進行終點檢測實驗，并且用于獲得有關生物化學反應的動力學信息。作為一種例子，圖20示出了通過向所述表面上連續添加各種結合配偶體連續測量一個生物傳感器位置的實驗的結果。在所述實驗過程中，檢測探頭通過生物傳感器基片的背面照射所述生物傳感器，同時在所述裝置的頂面進行生物化學反應。將橡膠墊圈密封在測量的生物傳感器位置周圍，以便限制所述添加的試劑，并且所有測量都是在生物傳感器的頂面浸泡在緩沖液中的情況下進行的。在初步清洗之后，用NH2和NHS-生物素接頭分子活化所述生物傳感器。如圖20所示，將幾種不同濃度(1、10、100、1000μg/ml)的山羊α-生物素抗體連續添加到所述生物傳感器上，并且溫育30分鐘，同時監控峰共振波長。在應用最高濃度的α-生物素IgG之后，通過添加各種濃度(0.1、1、10和100μg/ml)的α-山羊IgG將第二層蛋白結合在生物傳感器表面上。同樣，在讓每一種溶液在生物傳感器上溫育30分鐘時，連續監控共振峰。圖20表示在每一個溫育階段結束時共振峰如何偏向更大的波長。
圖21表示來自圖20的最終共振峰過渡的動力學結合曲線，其中，將100μg/ml的α-山羊IgG添加到所述生物傳感器上。該曲線表現了在動力學結合實驗中通常觀察到的曲線類型，其中，首先觀察到了基準頻率的快速增加，隨后是反應的逐漸飽和。這種類型的反應曲線出現在實驗中測量的所有的過渡中。圖22表示IgG結合的動力學結合測量。
通過酶的活性從生物傳感器表面上除去材料同樣是容易觀察到的。當來自上述實驗的生物傳感器(具有山羊抗生物素IgG和抗山羊IgG的兩種蛋白涂層)接觸濃度為1mg/ml的胃蛋白酶時，這種酶能夠解離IgG分子，并且將它們從生物傳感器表面上除掉。如圖23所示，從所述表面上除掉結合的分子可以作為時間的函數而觀察到。
實施例9蛋白組學用途本發明的生物傳感器可用于蛋白組學用途。生物傳感器陣列能夠接觸包括結合配偶體混合物的測度樣品，該測試樣品包括，例如，蛋白或噬菌體展示文庫，然后漂洗生物傳感器表面，以便除掉所有未結合的材料。對生物傳感器進行光學探測，以便確定在生物傳感器表面上的不同位置上業已經歷了最大程度的結合，并且提供結合材料的定量量度。然后，將所述生物傳感器放入“流動室(flow cell)”中，其允許(例如，＜50微升)固定體積的流體與生物傳感器表面接觸。激活一個電極，以便只從選擇的生物傳感器陣列不同位置上洗脫結合材料。結合材料在流動室液體中被稀釋。將流動室液體從生物傳感器表面上用泵抽走，并且儲存在微量滴定板或某些其他容器中。用新的溶液取代所述流動室液體，并且激活新的生物傳感器電極，以便洗脫它的結合的結合配偶體。重復以上過程，直到生物傳感器的所有不同目標位置液體洗脫，并且集中在單獨容器中。如果所述測試樣品液體包括蛋白混合物的話，則可以用諸如電噴霧串聯質譜分析法的技術分析單獨容器中的蛋白含量。如果所述樣品液體包含噬菌體展示文庫，則可以通過與宿主菌株溫育，濃縮擴增，以及分析相關的文庫DNA序列來鑒定單獨容器中的噬菌體克隆。
實施例10均勻的測定證明SWS生物傳感器能檢測與它表面接觸的均勻流體的光密度，并且能夠區分折射率相差小到Δn＝4×10-5的流體。由于溶液包括兩種折射率與含有兩種結合的相互作用蛋白的溶液不同的游離的非相互作用蛋白，所以在沒有任何類型的顆粒標記或化學標記的前提下，SWS生物傳感器能夠測量蛋白-蛋白相互作用何時在溶液中發生。
制備三種測試溶液用于進行比較1.溶解在磷酸緩沖溶液(PBS)中的抗生物素蛋白，(10μg/ml)2.溶解在PBS中的抗生物素蛋白(10μg/ml)+牛血清清蛋白(BSA)(10μg/ml)3.溶解在PBS中的抗生物素蛋白(10μg/ml)+生物素化的BSA(b-BSA)(10μg/ml)將一個SWS生物傳感器用于所有測量，以便消除任何可能的生物傳感器之間的偏差。將每一種測試溶液的200μl的樣品應用到生物傳感器上，并且平衡10分鐘時間，然后測量SWS生物傳感器峰共振波長值。在樣品之間，用PBS充分洗滌生物傳感器。
在圖24中對測試溶液的峰共振波長值進行作圖。取抗生物素蛋白溶液作為基線參照物，以用于與抗生物素蛋白+BSA和抗生物素蛋白+b-BSA溶液進行比較。將BSA添加到抗生物素蛋白中，僅僅導致了小的共振波長增加，因為這兩種蛋白預計不會相互作用。不過，由于生物素和抗生物素蛋白強有力結合(Kd＝10-15M)，抗生物素蛋白+b-BSA溶液會包括更大的結合的蛋白復合物。因此，與抗生物素蛋白+BSA相比，抗生物素蛋白+b-BSA溶液的峰共振波長值提供了較大的偏移。
BSA(MW＝66KDa)和b-BSA(MW＝68KDa)之間的分子量差異是非常小的。因此，含有非相互作用蛋白(抗生物素蛋白+BSA)和相互作用蛋白(抗生物素蛋白+b-BSA)的溶液之間測量的差異僅僅是由于這兩種分子之間結合相互作用的差異造成的。所述結合的分子復合物導致了所述溶液具有與不含結合復合物的溶液不同的光學折射率。所述光學折射率變化是通過SWS生物傳感器測量的。
實施例11微量滴定板測定作為構成微量滴定板內表面的比色共振反射光學生物傳感器上的生物化學結合檢測的證明，進行了以下測定。選擇用于本研究的蛋白-蛋白系統是利用固定在生物傳感器表面上的生物素作為特殊結合物質對抗生物素IgG抗體的檢測。因此，開發了將生物素固定在生物傳感器表面上的方案，該方案利用雙功能聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS-PEG)接頭分子(Shearwater Polymers，Inc.)在胺表面基團和生物素之間起著中間物的作用。NHS-PEG分子是專門設計的，以便NHS能夠優先結合胺活化的表面，從而使得該分子的PEG部分的朝向遠離該表面。NHS-PEG接頭分子起著使生物素分子與生物傳感器表面分離一小段距離的作用，以便它可以保持它的構象，并因此保持它對其他分子的親和力。PEG還可起著抑制蛋白與生物傳感器的非專一性結合的作用。
在胺活化的生物傳感器片附著到微量滴定板底部之后，用三種不同的表面官能團制備單獨的微量滴定板孔，以便提供足夠的實驗對照，以用于檢測抗生物素IgG。首先，在不進行額外改性的前提下研究胺活化的表面。胺活化的表面預計能非專一性地結合蛋白，但是沒有高的親和力。其次，制備了具有NHS-PEG雙功能接頭分子的微量滴定板孔。預計NHS-PEG分子能夠提供不會結合蛋白的表面。第三，制備了具有NHS-PEG-生物素接頭分子的微量滴定板孔。預計NHS-PEG-生物素分子能夠與抗生物素IgG強有力結合。
為了用生物素激活胺涂覆的生物傳感器，將溶解在TPBS(0.01％TWEENTM20的參考緩沖液，溶解在磷酸緩沖液中，pH8)中的濃度為1.0mg/ml的2ml的NHS-PEG-生物素(Shearwater)溶液添加到所述生物傳感器表面上，并且在37℃下溫育1小時。用相同的方法附著沒有生物素的NHS-PEG(Shearwater)分子。所有購買的試劑都是以包裝形式使用的。
進行蛋白-抗體親和力測定，以便證實生物傳感器的工作。制備三種單獨的生物傳感器表面狀態(NH2、NHS-PEG、NHS-PEG-生物素)的基質，并且接觸7種濃度的山羊抗生物素IgG(Sigma)。在單獨的微量滴定板孔中測量每一個基質位置，同時測量總共21個孔。由于預期NHS-PEG孔不能結合蛋白，它們提供了用于取消共同的模式效應的參考，如測試樣品的折射率影響和在測定過程中環境溫度波動。
圖25對PWV偏移進行作圖-與沒有固定的化學官能團的生物傳感器進行參考，是由于NH2、NH2+(NHS-PEG)和NH2+(NHS-PEG-生物素)分子與生物傳感器表面的附著而記錄的。誤差棒表示在7個微量滴定板孔上記錄的PWV偏移的標準差。數據表明，所述生物傳感器能夠區分清潔表面，和固定有NH2的表面，并且明確檢測NHS-PEG(MW＝2000Da)分子的添加。表面固定化NHS-PEG和NHS-PEG-生物素(MW＝3400Da)之間的差異同樣是可以測量的。
圖26A-C表示在接觸各種濃度的抗生物素IgG(0-80mg/ml)并且溫育20分鐘時生物傳感器孔作為時間函數的PWV偏移反應。NHS-PEG表面(圖26B)提供了最低的反應，而胺活化的表面(圖26A)表現了與高濃度抗生物素IgG的低水平的非專一性相互作用。NHS-PEG-生物素表面(圖26C)明確表現出與抗生物素IgG的強的專一性相互作用，從而提供了與預期的抗生物素IgG濃度成比例的強的PWV偏移。
20分鐘之后，將PWV相對圖26C的偏移幅度在圖25中作為抗生物素IgG濃度的函數作圖。觀察到了IgG濃度和測量的PWV偏移之間的大致上的線性相關，并且，最低濃度IgG溶液(1.25μg/ml，8.33nM)相對負對照PSB溶液是明顯可測量的。
在圖27中示出了通過酶的活性從生物傳感器表面上除掉材料。當所述生物傳感器接觸濃度為1mg/ml(體積＝100μl)的胃蛋白酶時，所述酶解離山羊-抗生物素IgG和抗山羊IgG，并且將它們從生物傳感器表面上除掉。可以觀察到作為時間函數的所述表面的結合分子的去除。
實施例12在比色共振反射光學生物傳感器(96孔微量滴定板)上生長細胞在接種培養物之前，對構成微量滴定板的內表面的比色共振反射光學生物傳感器進行滅菌。滅菌是通過將生物傳感器放入Biosafety通風櫥中，并且讓微量滴定板和防護盒接觸紫外線12-48小時，更優選大約16-36小時，更優選18-30小時，且最優選大約24小時而實現的。從生長在軟骨細胞生長培養基(Cell Applications，Inc.)中的軟骨細胞和生長在RPMI(Sigma)中的HEK人腎腫瘤細胞(ATCC)的活的培養物中收獲細胞。將1×105-1×106個細胞添加到96個孔的每一個孔中，并且將微量滴定板放入防護盒，并且在CO2培養箱中，在37℃下溫育24-48小時。
可以通過比色共振反射光學生物傳感器表面的峰波長值檢測在生物傳感器位置上的細胞生長，或更通常的是使用顯微鏡、數碼相機、常規照相機或其他觀察裝置監控，其中進行放大或不放大，所述裝置采用了基于透鏡的光學元件或基于電子的電荷耦合裝置(CCD)技術。
實施例13在比色共振反射光學生物傳感器上檢測細胞形態學變化利用構成微量滴定板的內表面的比色共振反射光學生物傳感器檢測細胞形態學變化。按照實施例12的方法讓軟骨細胞生長到10-90％匯合的單層。用鹽平衡緩沖液，如Hank氏培養基(Sigma)洗滌細胞單層，并且檢驗單層的穩定性，用諸如Hank氏培養基的鹽平衡的培養基洗滌或溫育所述細胞10分鐘。可以通過在洗滌或溫育步驟之前、期間或之后檢測任何位置的峰波長值來評估任何生物傳感器位置的單層穩定性。
將溶于Tris-EDTA中的0.25％胰蛋白酶加溫到室溫，并且添加到生物傳感器孔中，同時檢測峰波長值。還采用沒有生長細胞的空白對照。參見圖28，跟蹤反應進程12分鐘。貫穿所述測定，發現所述細胞保持附著在生物傳感器的表面上；在向容納有軟骨細胞的生物傳感器孔中添加2mg/ml胰蛋白酶后觀察到的PWV的減弱，表明了軟骨細胞細胞形態學的變化。對于添加胰蛋白酶，對照(無軟骨細胞)孔表現出不明顯的反應。
圖29表示使用腎腫瘤細胞的細胞粘著測定結果。將胰蛋白酶添加到容納有生長在生物傳感器的表面上的腎腫瘤細胞的六個生物傳感器孔中。將兩個孔用作三種胰蛋白酶濃度的每一種的重復樣品。在添加胰蛋白酶后，觀察到的PWV的減弱，表明了所述細胞與生物傳感器的表面的脫附。
業已觀察到原代和腫瘤細胞系在所述微量滴定板孔中的比色共振反射光學生物傳感器表面上生長良好，并且業已觀察到真核細胞產生了非常穩定的PWVs。
實施例14檢測從生長在保持與比色共振反射光學生物傳感器接觸的半滲透性內部套管中的細胞中釋放的分子可以使用構成微量滴定板孔的內表面的比色共振反射光學生物傳感器檢測從細胞中分泌、流出或以其他方式排出的分子。將抗白細胞介素-1的抗體固定在微量滴定板孔內的比色共振反射光學生物傳感器的表面上。將半滲透性內部套管插入所述孔，然后放入小鼠巨噬細胞(ATCC CRL-2019)和RPMI 1640生長培養基(Sigma)。按照實施例12所述方法生長細胞，同時在生物傳感器表面上的若干位置檢測比色共振反射光學PWV。在將脂多糖(Sigma)用于刺激白細胞介素-1產生時，發現了PWVs隨時間推移而增強，因為從巨噬細胞中分泌的白細胞介素-1通過半滲透性內部套管擴散，并且與固定在生物傳感器表面上的白細胞介素-1抗體結合。
實施例15在比色共振反射光學生物傳感器上的蛋白微陣列證明比色共振反射光學生物傳感器能夠以陣列形式進行測定，本實施例說明了檢測不同類型的IgG之間的不同的結合親和力的能力。
在本實施例中，將生物傳感器片切割成1英寸×2英寸的矩形區域。該傳感器由疏水性TaO表面組成，在它上面使用Affymetrix GMS針和環點樣儀用400微米點樣環點樣了1mg/ml的兔-IgG、雞-IgG、山羊-IgG和人-IgG(所有IgG均購自Sigma)。一共形成了4排各7個斑點(參見圖35-A)，其中，兔-IgG構成了第一排；雞-IgG構成了第二排；山羊-IgG構成了第三排；而人IgG構成了第四排。在點樣之后，在室溫下溫育IgG 30分鐘。然后將由Jobin Yvon高分辨率成像分光計組成的SRU微陣列掃描儀用于掃描所得到的數據，如圖35-A所示。
在點樣之后，讓1mg/ml的明膠(Sigma)流動到所述表面上，以作為阻斷劑來阻止結合劑(抗人-IgG)與非點樣區域的非專一性結合。然后在PBS中漂洗整個微陣列載片三次，每次10秒鐘，然后用H2O漂洗三次，同樣每次10秒鐘。然后使用SRU微陣列掃描儀掃描所得到的微陣列，最后，將100μg/ml的抗人-IgG流動到整個表面上，并且在室溫下溫育30分鐘，然后使用與上述相同的PBS漂洗方法漂洗。再次用SRU微陣列掃描儀掃描所得到的包括所述結合相互作用的微陣列。該最后掃描和在阻斷之后進行的掃描之間的差別表明了結合在微陣列上每一個斑點上的材料的量(參見圖35-B)。具體地講，人-IgG和抗人-IgG之間的高度親和力是與圖35-B中最下面一排相應的強反應的證據。另外，在圖35-B中0.04nm/強度計數的強度等級上，通過所述微陣列系統觀察到了0.8-nm-1.0-nm波長偏移的結合結果，該結果與用基于孔的測定獲得的觀察結果吻合。
實施例16在比色共振反射光學生物傳感器上證明DNA-DNA結合相互作用為了在比色共振反射光學生物傳感器上證明雜交事件的檢測，用與固定的胸腺嘧啶的18個堿基的寡核苷酸序列(poly-T)雜交的腺嘌呤的18個堿基的寡核苷酸序列(poly-A)進行實驗，其中使用與生物傳感器片結合的無底96-孔平板。所述poly-A序列具有附著在它的3′-末端的Cy-5標記，以便允許利用熒光驗證結合。
具體地講，首先用聚-苯丙氨酸-賴氨酸(PPL)(Sigma)對具有疏水性TaO頂層的生物傳感器進行涂覆；然后將所述生物傳感器結合在無底聚苯乙烯96-孔微量滴定板(Greiner)上。制備由3×SSC緩沖液(Sigma)和0.1％SDS(Sigma)組成的雜交緩沖溶液。然后，將9個孔(分成三組，每組三個孔)用于檢查三種不同的分析物，每一個重復三次。具體地講，在第一和第二組孔中，添加溶解在水中的10mM的poly-T(Oligos Etc.，Inc.)。在第三組孔中，固定來自T7啟動子區(New England BioLabs)的DNA。在固定之后，首先用雜交緩沖液漂洗所有孔，然后，將雜交緩沖液添加到第一組孔中，從而提供基線反應曲線。在第二組孔中，添加poly-A(具有Cy-5標記)，以便誘導固定化的poly-T和poly-A之間的雜交。在第三組孔中，將poly-A(具有Cy-5)添加到固定化的T7DNA上，以便產生非專一性結合。
圖36歸納了上述實驗的結果。在圖36A中，示出了來自poly-T、poly-A和T7-啟動子的結合量的曲線圖。在圖36B中，將相同的數據作為終點與誤差棒一起作圖。從上述曲線中很容易看出，所述生物傳感器可以測量poly-T和poly-A之間的專一性雜交，以及區分上述強的相互作用與較弱的非專一性相互作用。
實施例17在比色共振反射光學生物傳感器上證明蛋白-DNA相互作用在另一種實施方案中，證實了利用比色共振反射光學生物傳感器檢測蛋白和DNA之間的相互作用的能力。在這種場合下，T7啟動子DNA和T7RNA聚合酶之間的相互作用被用作例子。
使用與無底96-孔聚苯乙烯微量滴定板(Greiner)的底部結合的TaO-涂覆的生物傳感器，首先將聚-苯丙氨酸-賴氨酸(PPL)(Sigma)用于對所述傳感器表面進行涂覆。具體地講，用PPL對12個孔進行涂覆，將三個孔用于要分析的四種分析物中的每一種。
在第一組孔中，添加pH＝7.4的PBS緩沖液(Sigma)。在第二組孔中，添加T7 RNA聚合酶(New England BioLabs)的反應緩沖液。在第三組孔中，首先固定T7-啟動子DNA(New EnglandBioLabs)，然后添加溶解在反應緩沖液(New England BioLabs)中的T7 RNA聚合酶。在第四組孔中，固定T7-啟動子DNA，然后添加反應緩沖液。原則上講，T7反應緩沖液只應當提供非專一性反應，除非同時存在T7 DNA和T7 RNA聚合酶。如圖37所示，圖中就示出了這種情形。具體地講，注意到在第175個時間步驟上，進行漂洗處理，以便除去緩沖液影響；在該漂洗步驟之后，可以看出蛋白-DNA相互作用僅發生在同時容納有T7啟動子DNA和T7 RNA聚合酶的孔中。
實施例18現有用于研究細胞-蛋白相互作用和其他細胞相互作用的技術是耗時的和勞動密集型的，因為它們可能涉及很多步驟，包括放射性同位素或熒光標記、洗滌、封閉和檢測。參見，例如，表2。用于研究細胞-蛋白相互作用和其他細胞相互作用的現有技術還會使用大量的昂貴試劑。本發明提供了用于測定細胞相互作用的組合物和方法，本發明的方法比常規方法更快，并且與常規方法相比需要使用更少的試劑。
本發明的方法和組合物提供了無標記的、簡單的、高通量測定，以用于鑒定對特殊結合物質(包括蛋白)的細胞專一性、細胞遷移、細胞趨化性、特殊結合物質-細胞相互作用、細胞-細胞外基質相互作用和細胞-細胞相互作用。
在本發明的一種實施方案中，所述方法和組合物能夠顯著減少細胞測定中試劑的使用。與微量滴定板完整細胞測定相比，試劑使用可以減少至少100倍。更重要的是，本發明的簡單的圖像細胞測定可以取代現有的耗時和勞動密集型細胞遷移測定，和細胞趨化性測定，具有更高的精確度和可再現性。
由于生物分子和生物學細胞與生物傳感器表面相互作用，所以比色共振反射光學生物傳感器技術對光學特性變化非常敏感。這一特征提供了所述生物傳感器在生物學應用中的重大優點，如研究生物分子之間的相互作用，包括結合在細胞表面，如細胞表面受體或細胞表面標記上的生物分子和生物分子之間的相互作用。由于比色共振反射光學生物傳感器技術直接檢測生物相互作用，所以所述熒光標記、放射性同位素標記或諸如酶和生物學基序的生物學標記是不需要的。比色共振反射光學生物傳感器細胞附著測定提供了直接檢測分子和位于細胞表面上的它的對應體之間的相互作用的新方法。比色共振反射光學生物傳感器細胞附著測定的原理是固定化的靶分子以及它在細胞表面上的對應體之間的親和力結合會導致細胞與所述生物傳感器表面相互作用，其中，可以檢測這種相互作用。
本發明的一種實施方案提供了包含比色共振反射光學生物傳感器的容器，其中，所述比色共振反射光學生物傳感器構成所述容器的內表面。例如，所述比色共振反射光學生物傳感器可以構成所述容器的底面。將一種或多種特殊結合物質，如兩種或兩種以上特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上不同位置上。在兩個或兩個以上不同位置上可能具有不同量的一種特殊結合物質。例如，容器可以包括微量滴定板孔、試管、培養皿或微流體通道。本發明的一種實施方案提供了包括一個或多個微量滴定板孔的微量滴定板，其中，一個或多個微量滴定板孔的底面包括比色共振反射光學生物傳感器。可以將一種或多種特殊結合物質固定在所述每一個微量滴定板孔的底面上的兩個或兩個以上不同位置上。
本發明提供了檢測一種或多種類型的細胞與一種或多種特殊結合物質結合的方法。在本發明的一種實施方案中，將一種或多種類型的細胞應用在容器內表面上。可以使用任何類型的細胞，例如，包括原核細胞、真核細胞、人工細胞、細胞膜或人工細胞膜。例如，所述細胞可以作為貼壁細胞在培養物中生長，或作為懸浮細胞在培養物中生長。所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器，其中，兩種或兩種以上特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上的不同位置上。用光線照射所述容器，并且檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWVs)。峰波長值(PWV)是與生物傳感器結合的結合物質和/或細胞的相對量度。如果所述一種或多種細胞業已結合了特殊結合物質的話，那么在結合所述一種或多種細胞的不同位置上會發生PWV偏移。例如，與沒有結合特殊結合物質的生物傳感器部分或與僅結合了特殊結合物質的生物傳感器部分，或與特定基線PWV相比，所述PWV偏移了。
例如，所述一種或多種特殊結合物質可以排列在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上的一系列不同位置上。所述不同位置可以限定直徑大約為50-500微米的一系列斑點。所述一種或多種特殊結合物質可以在所述容器內表面上隨機地排列。例如，可以通過諸如物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水性結合和親水性結合的方法，將所述一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上。
本發明的另一種實施方案提供了檢測一種或多種細胞與特殊結合物質結合的方法。所述方法包括將一種或多種特殊結合物質，如兩種或兩種以上特殊結合物質固定在容器內表面的兩個或兩個以上不同位置上，其中，所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器，并且用光線照射所述容器。測定不同位置的一種或多種峰波長值。將一種或多種細胞應用在所述容器內表面上。用光線照射所述容器，并且檢測每一個不同位置的一種或多種峰波長值。比較所述峰波長。如果所述一種或多種細胞業已結合了特殊結合物質，那么在結合了特殊結合物質的不同位置上的PWV會發生偏移。
在工作實施例中，包括線性光柵比色共振反射光學生物傳感器作為內表面的微量滴定板孔具有固定在生物傳感器表面上的1μl的抗人CD3和1μl的抗小鼠CD3單克隆抗體。參見圖38和圖39。對所述微量滴定板孔進行掃描，并且分析抗體涂層。參見圖39。在Jurkat細胞(1×105)與生物傳感器表面溫育20分鐘之后，掃描所述微量滴定板孔，并且觀察細胞附著模式，如圖39所示。
該測定明確證實了Jurkat細胞能與業已用ahCD3對來自96孔微量平板生物傳感器孔的內側涂覆的不同位置相互作用，并且沒有觀察到來自使用抗小鼠CD3單克隆抗體的不同位置的可檢測信號。例如，所述細胞附著測定可用于鑒定參與細胞粘著、遷移、趨化性和入侵的分子。該測定還可用于鑒定細胞表面分子，所述分子可調節例如，細胞粘著、遷移、趨化性和細胞入侵。另外，所述測定可以提供研究細胞-細胞相互作用、細胞-基質相互作用和細胞-分子相互作用的新型工具。競爭細胞附著測定，可以提供藥物篩選的新工具，以用于鑒定專一性靶定參與細胞相互作用的分子的化合物。
表2

權利要求
1.一種容器，其包括比色共振反射光學生物傳感器，其中，所述比色共振反射光學生物傳感器構成所述容器的內表面，其中，將一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上的不同位置上。
2.如權利要求1的容器，其中，所述容器包括微量滴定板孔、試管、培養皿或微流體通道。
3.一種微量滴定板，其包括一個或多個微量滴定板孔，其中，一個或多個微量滴定板孔的底面包括比色共振反射光學生物傳感器，其中，將一種或多種特殊結合物質固定在每一個微量滴定板孔的底面的兩個或兩個以上不同位置上。
4.一種檢測一種或多種類型的細胞與一種或多種特殊結合物質結合的方法，其包括(a)將所述一種或多種類型的細胞應用在容器內表面上，其中，所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器，其中，將一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面的兩個或兩個以上的不同位置上；(b)用光線照射所述容器；(c)檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWV)；其中，如果所述一種或多種細胞業已結合在一種或多種特殊結合物質上的話，那么在結合了所述一種或多種細胞的不同的位置上的PWV會偏移。
5.如權利要求4的方法，其中，所述容器是微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養皿或微流體通道。
6.如權利要求4的方法，其中，所述一種或多種特殊結合物質被排列在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上的一系列不同位置上。
7.如權利要求6的方法，其中，所述不同位置限定了一系列直徑大約為50-500微米的斑點。
8.如權利要求4的方法，其中，通過選自下列一組的方法將所述一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水性結合和親水性結合。
9.如權利要求4的方法，其中，所述一種或多種特殊結合物質選自核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜交溶液、含有來自組合化學文庫的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物和生物學樣品。
10.檢測一種或多種細胞與一種或多種特殊結合物質的結合的方法，其包括(a)將一種或多種特殊結合物質固定在容器內表面上的兩個或兩個以上不同位置上，其中，所述容器內表面包括比色共振反射光學生物傳感器；(b)用光線照射所述容器；(c)檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWV)；(d)將一種或多種細胞應用在所述容器內表面上；(e)用光線照射所述容器；(f)檢測每一個不同位置上的一種或多種峰波長值(PWV)；(g)比較步驟(c)的PWV′s和步驟(f)的PWV′s；其中，如果所述一種或多種細胞業已結合在一種或多種特殊結合物質上，那么結合了所述細胞的不同位置上的PWV就會偏移。
11.如權利要求10的方法，其中，所述容器是微量滴定板孔、微量滴定板、試管、培養皿或微流體通道。
12.如權利要求10的方法，其中，將一種或多種特殊結合物質排列在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上的一系列不同位置上。
13.如權利要求12的方法，其中，所述不同位置限定了一系列直徑大約為50-500微米的斑點。
14.如權利要求10的方法，其中，通過選自下列一組的方法將所述一種或多種特殊結合物質固定在包括比色共振反射光學生物傳感器的所述容器的內表面上物理吸附、化學結合、電化學結合、靜電結合、疏水性結合和親水性結合。
15.如權利要求10的方法，其中，所述特殊結合物質選自核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA雜交溶液、含有來自組合化學文庫的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有機分子、細胞、病毒、細菌、聚合物和生物學樣品。
全文摘要
本發明提供了用于測定細胞相互作用的組合物和方法，該方法比常規方法更快，并且需要使用比常規方法更少的試劑。
文檔編號B01L3/00GK1879018SQ200480026721
公開日2006年12月13日 申請日期2004年9月22日 優先權日2003年9月22日
發明者林波, B·T·昆寧哈姆, 李允中 申請人:Sru生物系統公司