T-2毒素免疫親和柱的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于T-2毒素單克隆抗體的免疫親和柱的制備方法。通過細胞融合所得到的單克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖4B偶聯得到的免疫親和吸附劑填充與固相萃取管中得到了可以特異性吸附T-2毒素的免疫親和柱。本發明制備的免疫親和柱能特異性的與T-2毒素結合，最大結合容量約為240ngT-2；重復使用三次，回收率不低于90%。本發明可用于谷物及谷物制品檢測T-2毒素殘留的前處理方法。
【專利說明】T-2毒素免疫親和柱的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于檢測【技術領域】，具體地涉及涉及一種τ-2毒素的免疫親和柱的制備方法。
【背景技術】
[0002]Τ-2毒素(T-2 toxin)屬于單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)中的A族,是鐮刀菌屬(Fusarium)的部分菌種生成的一組結構相似的化合物中毒性最強的毒素之一，主要污染谷物及其制品，結構為白色針狀結晶，熔點為150-151°C，難溶于水，易溶于極性溶劑，如三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯等。
[0003]單端孢霉烯族毒素對小麥黃化芽鞘和胚根的生長有強生物活性，能夠抑制小麥的生長，并導致芽鞘、胚根變色潰爛。1989年，王裕中等測定了禾谷鐮刀菌產生的不同種毒素對不同種小麥黃化芽鞘的生物活性，其中DON對黃化芽鞘生長具有很高的抑制率，是活性最強的毒素之一。除了以上列舉的毒素對植物的危害外，單端孢霉烯族毒素還對人和動物有很大的危害，如常食用的食物如肉、奶、蛋中均有真菌毒素及其代謝物殘留，而且由于單端孢霉烯族毒素具有較強抗熱能力，不會因加熱而破壞，所以烹飪也不能解決，如果人畜食用了帶毒的糧食或飼料后，可發生不同種類和程度中毒癥狀。臨床表現為嗜睡、嘔吐、食欲喪失、免疫功能障礙、胃腸功能障礙和繁殖功能障礙等。
[0004]1999年，啟東華寶三聯牧場飼料由于使用污染的原料，致使多頭豬病死，后來發現主要原因就是赤霉菌產生了的大量F-2毒素(類雌激素)及一定量的T-2毒素，引起了豬機體激紊亂，內環境不平衡，內臟出血性損害或消化系統傷害，致使抵抗力下降，機體易感各種疾病，最后導致死亡，2008年，美國也出現了由于T-2毒素的污染導致的大面積畜禽死亡的現象，所以當糧食被污染后誤入食物鏈，對畜禽及人類健康有很大的影響(Weber，2008)。
[0005]目前T-2毒素常用的檢測方法很多，根據真菌毒素含量常用的檢測方法，可分為3類:(I)生物學檢測法；(2)理化檢測方法(薄層層析法TLC、高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC ; (3)免疫化學檢測法(ELISA、CLEIA等方法)(吳文達，2009)。其中，高效液相色譜法HPLC、氣象色譜法GC是定量的檢測方法，結果準確可靠，缺點是檢出限較高、儀器設備較為昂貴；薄層層析法TLC靈敏度不高且不適用于檢測大量樣品的實際需要，近年來應用較少；酶聯免疫吸附ELISA法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，但實驗過程需較長時間，各個步驟需徹底洗滌，并且需要特定的酶和底物顯色，因此耗時長，程序繁瑣。而且T-2毒素毒性劇烈，前處理過程中操作人員反復暴露在T-2毒素的環境中，增加了實驗的風險。因此建立快捷有效的樣品前處理技術已成為T-2毒素檢測分析中亟待解決的問題。
[0006]免疫親和色譜柱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一種新型的樣本前處理技術，它是將免疫反應與色譜分析方法相結合，利用抗原抗體結合的高度特異性和親和力，用適當的方法將特異性的抗原或抗體結合到層析載體上，以便有效的分離和純化各自互補的免疫物質。目前已在抗體、激素、多肽、病毒以及亞細胞化合物的分析中廣泛應用。本發明旨在提供一種T-2毒素免疫親和柱的制備方法，作為谷物及谷物制品檢測T-2毒素的前處理方法。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種T-2毒素免疫親和柱的制備方法，所研制的親和柱是采用T-2毒素單克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖4B (CNBr-Sepharose 4B)偶聯后填充在固相萃取柱中，用于純化含有T-2毒素的待測樣品。
[0008]本發明所述的T-2毒素免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進行:
（l)偶聯:取純化后的T-2毒素單克隆抗體與溶脹后的CNBr-S印harose 4B凝膠共同放置于偶聯緩沖液中，室溫下震蕩偶聯；
(2)封閉:在偶聯凝膠產物中加入其5~10倍體積的封閉緩沖液，室溫下震蕩反應2h；
(3)洗滌:分別用5~10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCL緩沖液交替洗滌3次，然后用5~10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑；
(4)裝柱:將得到的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩沖液后自然沉降，得到T-2毒素免疫親和柱，4度保存待用。
[0009]所述固相載體可以為纖維素、葡聚糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等，優選為Sepharose 4B。
[0010]所述的τ-2毒素單克隆抗體與CNBr-S^harose 4B干粉的質量比為1:80 ;所述的偶聯緩沖液為0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的緩沖液為1.0mmol /T, HCL0
[0011]所述的封閉緩沖液為0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，用以封閉未偶聯的活化位點。
[0012]所述的醋酸鹽緩沖液為0.1 mol/L、pH4.0的醋酸鹽緩沖液；所述Tris-HCL緩沖液為 0.1 mol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCL 緩沖液。
[0013]本發明制備的τ-2毒素免疫親和柱可以用于谷物及谷物制品檢測τ-2毒素殘留的前處理方法。具有以下顯著特點:1)減少了操作人員接觸到Τ-2毒素的幾率；2)通過特異性的抗體與Τ-2毒素結合，一次凈化能夠去除絕大部分的干擾物；3)所制備的免疫親和柱最大結合容量為240ng T-2 ；4)所制備的免疫親和柱重復使用三次，回收率不低于90%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明檢測T-2毒素免疫親和柱的柱容量測定圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明，而不用來限制本發明的范圍。
[0016]實施例1 T-2毒素免疫親和柱的制備
(1)偶聯
取10 mg經過辛酸-硫酸銨法純化后的針對T-2毒素的單克隆抗體在0.1 mol/LNaHCO3溶液中透析過夜，將濃度調整至2 mg/mL ；
稱取 CNBr-Sepharose 4B 干膠 800 mg,在 10 mL 1.0 mmol /T, HCL 中充分溶脹；用 10倍以上濕膠體積的0.1 mol/L NaHCO3溶液洗漆3次,5000 rpm離心I min ；
將濕膠與抗體充分混勻，室溫下攪拌過夜；
用50 mL 0.1 mol/L NaHC03溶液洗滌，收集洗滌液，紫外鑒定，計算偶聯率。偶聯率的計算公式為:
【權利要求】
1.一種T-2毒素免疫親和柱的制備，其特征在于，是由固相載體和預期偶聯的Τ-2毒素單克隆抗體組成，具體步驟為: Cl)偶聯:取純化后的Τ-2毒素單克隆抗體與溶脹后的CNBr-S印harose 4B凝膠共同放置于偶聯緩沖液中，室溫下震蕩偶聯； (2)封閉:在偶聯凝膠產物中加入其5?10倍體積的封閉緩沖液，室溫下震蕩反應2h； (3)洗滌:分別用5?10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCL緩沖液交替洗滌3次，然后用5?10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑； (4)裝柱:將得到的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩沖液后自然沉降，得到T-2毒素免疫親和柱，4度保存待用。
2.根據權利要求1所述的T-2毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的固相載體為 CNBr-Sepharose 4B。
3.根據權利要求1所述的T-2毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的T-2毒素單克隆抗體與CNBr-S印harose 4B干粉的質量比為1:80 ;所述的偶聯緩沖液為0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的緩沖液為1.0 mmol/L HCl。
4.根據權利要求1所述的T-2毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的封閉緩沖液為0.1 mo I/L Tris-HCL (pH 8.0)，以封閉未偶聯的活化位點。
5.根據權利要求1所述的T-2毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于其中步驟(3)中所述的醋酸鹽緩沖液為0.1 mol/L、pH4.0的醋酸鹽緩沖液；所述Tris-HCL緩沖液為0.1mol/L、pH8.0 的 Tris-HCL 緩沖液。
6.T-2毒素免疫親和柱可用于谷物及谷物制品檢測T-2毒素殘留的前處理方法。
【文檔編號】B01J20/281GK103801111SQ201210443317
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月8日 優先權日:2012年11月8日
【發明者】杜道林, 洪霞, 杜霞 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司