專利名稱：一種dna光修復酶的活性檢測方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質的活性檢測技術領域，特別是涉及利用高效液相色譜方法檢測DNA光修復酶活性。
背景技術：
美國《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)指出，DNA光修復酶是一種分子量約55kD的蛋白質，其主要作用是修復生物體基因組DNA因紫外輻射作用形成的嘧啶二聚體。而在任何DNA光修復酶的純化制備過程中，活性檢測是必不可少的步驟。
在現有DNA光修復酶的活性檢測方法中，電泳檢測方法已是很成熟的一種，如美國《生物化學》(Biochemistry 1990，29，7715-7727)報道的電泳檢測方法，其基本過程是先合成一段約50bp的雙鏈DNA片段作為酶底物，該片段必須具備兩個條件第一，在片段全長中僅有一個核酸內切酶作用位點，這個位點一般位于片段中間位置而且包含兩個相鄰的胸腺嘧啶堿基，第二，相臨的胸腺嘧啶堿基形成嘧啶二聚體。該DNA底物經同位素標記、DNA光修復酶修復，核酸內切酶酶切，然后對產物進行電泳膠分析，根據射線計數檢測酶切的片段和未酶切的片段的量以測定DNA光修復酶的活性。這種方法對酶底物要求嚴格，底物合成困難；同位素標記也增加了環境污染的可能。
發明內容
本發明的目的是提出一種利用高效液相色譜法檢測DNA光修復酶的活性的方法，以克服現有技術對酶底物要求高、步驟繁雜、實驗操作難、污染環境的缺陷。
本發明的DNA光修復酶活性檢測方法，包括先制備含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物，然后將含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物與DNA光修復酶混合于反應緩沖液中用近紫外光照射，得到各不同照射時間的相應產物；其特征在于將DNA光修復酶與含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物經近紫外照射不同時間的相應產物經分子-排阻高效液相色譜分析，在線檢測底物單峰的260nm紫外吸收，根據底物所出的峰，計算峰面積的變化值，即胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，根據胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時間的比確定DNA光修復酶的活性。
本發明的DNA光修復酶活性檢測方法的原理是以含胸腺嘧啶二聚體的DNA作為底物，無論其胸腺嘧啶二聚體是否被解聚，其分子量是不變的，所以進行分子-排阻高效液相色譜檢測時，它們的分子-排阻效應是相同的，即在相同高效液相色譜條件下它們的出峰時間是相同的；胸腺嘧啶二聚體在260nm處沒有吸收峰，而解聚成胸腺嘧啶單體在260nm處有吸收峰，可利用高效液相色譜的操作和分析軟件計算底物吸收峰的峰面積，該峰面積的變化值反映了胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，故可根據胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時間的比來確定DNA光修復酶的活性。
與現有DNA光修復酶的活性檢測方法相比較，本發明的優點在于1、本發明利用高效液相色譜法檢測DNA光修復酶的活性，只需將DNA光修復酶與底物反應不同時間的產物用高效液相色譜一步分析即可，全程操作簡單，步驟少，避免了電泳檢測方法中要對底物進行各步操作并提純的麻煩。
2、在本方法中，合成酶修復底物簡單，所用的底物是單鏈的且只有10-20個堿基的DNA，而不像在現有方法中要求的約50bp的雙鏈DNA。
3、高效液相色譜法是非常精確和穩定的，可方便地利用其操作和分析軟件對變化前后的DNA底物進行定量，直接測定DNA光修復酶的活性，從而可避免同位素標記這種較為危險、繁雜、要求嚴格的操作。
圖1為16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物經紫外照射不同時間所得產物的紫外-可見掃描光譜。
圖2為光照聚合前的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標樣的高效液相色譜圖。
圖3為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標樣的高效液相色譜圖。
圖4為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復酶解聚1分鐘的反應產物的高效液相色譜圖。
圖5為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復酶解聚1小時的反應產物的高效液相色譜圖。
具體實施例方式實施例1大腸桿菌DNA光修復酶的活性檢測1.寡聚核苷酸底物的制備采用由上海生工生物工程有限公司合成的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物，用無菌雙蒸水將底物配成濃度為100μM的儲備液，儲存于-20℃。
將儲備液放置于玻璃核磁管中，用高純氬氣充氣鼓泡，使其達到飽和氬氣狀態，封緊管口；在水浴中用300瓦高壓汞燈以5厘米燈距對底物進行光照，分別光照0、30、60、180、300分鐘；將光照不同時間的底物做紫外-可見掃描光譜分析。
圖1給出了16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物經紫外照射不同時間所得產物的紫外-可見光掃描光譜圖，其橫坐標是波長，縱坐標是光吸收值，圖中掃描峰a、b、c、d、e分別表示16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物紫外光照0、30、60、180、300分鐘后產物的吸收峰。可以看出，按以上條件，16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨著高壓汞燈紫外照射時間的延長，272nm吸光值不斷下降，表明其經紫外照射，底物分子不斷發生胸腺嘧啶聚合，生成沒有紫外吸收的環丁烷胸腺嘧啶聚合體，隨著照射時間的延長，底物發生胸腺嘧啶堿基聚合程度增加。實驗過程中發現，紫外光照的結果并不是所有的胸腺嘧啶都形成二聚體，而是或多或少存在沒有聚合的胸腺嘧啶單體，而單體是有吸收峰的，在光照5個小時后，其吸收峰基本穩定，即胸腺嘧啶堿基聚合基本達到飽和狀態，高效液相色譜檢測結果表明該狀態下胸腺嘧啶的聚合程度是70％，下面的實驗就是以這種狀態的底物作為DNA光修復酶的底物，并稱作70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物。
2.70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物與DNA光修復酶的反應反應體系由0.05M NaCl、0.02M Tris-HCl、0.01M二硫蘇糖醇、5％甘油、0.001MEDTA組成的PH為7.4的反應緩沖液中，加入1-10μM的DNA光修復酶和1-5μM70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物。所使用的DNA光修復酶是90％純度的大腸桿菌DNA光修復酶。
將0.4毫升的反應體系，放置于2.5毫升核磁玻璃管中，高純氬氣充氣達飽和氬氣狀態，封緊管口，在近紫外燈(365nm波長為主)以5厘米燈距，分別照射不同時間；隨后沸水浴5分鐘，15000g離心10分鐘，上清用來做高效液相色譜分析。
3.高效液相色譜對反應產物的分析1)以沃特斯600泵、沃特斯2487雙波長紫外檢測器及Millennium32操作和分析軟件構成高效液相色譜體系。層析柱采用沃特斯公司生產的型號為WAT084601，ProteinPAK125的凝膠柱，該柱的分子截留范圍是2000-80000Da 7.8×300mm Column。分離條件洗脫液為0.02M醋酸銨(PH6.0)，流速為0.75ml/min；采用260nm單波長紫外檢測。
2)聚合前后16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標樣的高效液相色譜分析圖2給出了16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色譜圖譜，其橫坐標是時間，縱坐標是260nm光吸收值，樣品于9.2分鐘出峰，為峰f；
圖3給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色譜圖譜，其橫坐標是時間，縱坐標是260nm光吸收值，于9.2分鐘出峰，為峰g。
從上述高效液相色譜圖可以看出①光照聚合前后的底物的出峰時間是一致的，表明二者的分子量是一致的；②光照聚合前底物的260nm吸收峰面積明顯大于光照聚合后的底物，利用Millennium32分析軟件可計算出光照前后底物的峰面積之間比例，從而能計算出單體變成二聚體的轉化率，約為70％左右；③光照前后底物的出峰時間的一致性和峰高、峰面積的明顯差異，可以作為檢測DNA光修復酶作用活性的依據，即加入DNA光修復酶作用不同時間，樣品用同樣條件做高效液相色譜圖分析，觀察在9.2分鐘位置的峰高和峰面積的變化趨勢，該峰面積的變化值代表了胸腺嘧啶二聚體經DNA光修復酶解聚的程度，根據解聚程度和反應時間的比來確定DNA光修復酶的活性。
3)有了以上標樣的實驗基礎，便可以對DNA光修復解聚不同時間的底物進行分析，并可以根據圖譜變化趨勢來直觀判斷和檢測DNA光修復酶的活性。
解聚不同時間的DNA光修復酶反應產物的制備的具體操作同實施例1.2的“16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物與DNA光修復酶的反應”。將反應不同時間的產物做以下處理沸水浴滅酶，離心去除沉淀，取上清做高效液相色譜檢測。
圖4給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復酶解聚1分鐘反應產物的高效液相色譜圖，其橫坐標是時間，縱坐標是260nm光吸收值，同樣在9.2分鐘出現峰，為峰h。
圖5給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復酶解聚1小時反應產物的高效液相色譜圖，其橫坐標是時間，縱坐標是260nm光吸收值，同樣在9.2分鐘出現峰，為峰i。
4)結果分析因為峰f是未聚合的底物，故可以認為是完全解聚狀態。利用Millennium32分析軟件分別對峰f、g、h、i進行面積積分，并以峰f認為100％解聚，可得到峰g、h、i分別為30％、47％、85％解聚，從而可以看出DNA光修復酶作用前后和不同作用時間對底物解聚程度的影響，尤其是在DNA光修復酶作用1小時后，底物可達到85％的解聚程度。
可以看出，在DNA光修復酶的作用下，光照聚合后的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物能被明顯的解聚，即DNA光修復酶具有修復嘧啶二聚體活性。
權利要求
1.一種DNA光修復酶的活性檢測方法，包括先制備含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物，然后將含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物與DNA光修復酶混合于反應緩沖液中用近紫外光照射，得到各不同照射時間的相應產物；其特征在于將DNA光修復酶與含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物經近紫外照射不同時間的相應產物經分子-排阻高效液相色譜分析，在線檢測底物單峰的260nm紫外吸收，根據底物所出的峰，計算峰面積的變化值，即胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，根據胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時間的比確定DNA光修復酶的活性。
全文摘要
本發明DNA光修復酶的活性檢測方法，特征是將DNA光修復酶與含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物經近紫外照射不同時間的相應產物經分子－排阻高效液相色譜分析，在線檢測底物單峰的260nm紫外吸收，根據底物所出的峰，計算峰面積及其變化值，即胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，根據胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時間比確定DNA光修復酶的活性；該方法操作簡單，可方便地利用操作和分析軟件對變化前后的DNA底物進行定量，結果可信度高，克服了現有技術對酶底物要求高、步驟繁雜、實驗操作難、環境污染的缺陷，適合于DNA光修復酶的實驗室純化和其產業化制備過程中的活性檢測。
文檔編號G01N30/00GK1624151SQ200310106548
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月5日 優先權日2003年12月5日
發明者王玉珍, 沐萬孟, 俞書勤, 宋欽華, 章東方, 羅昭鋒 申請人:中國科學技術大學