專利名稱：檢測豬日本腦炎抗體的重組e蛋白elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，屬于生物技術領域。用于豬日本腦炎抗體的抗體檢測，以此對抗體水平及疫情的分布與流行情況進行監測。
二
背景技術：
豬日本腦炎(Japanese encephalitis)是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的侵害中樞神經系統的，經蚊子傳播的急性人畜共患傳染病，它主要引起妊娠母豬發生流產和死胎，公豬發生睪丸炎，育肥豬持續高熱，新生仔豬腦炎，本病不但對養豬業造成了巨大的經濟損失，而且在世界許多國家廣泛存在，嚴重威脅著人類的健康。近年來，隨著全球氣候變暖，日本腦炎流行范圍有不斷擴大的趨勢。在動物中，豬對JEV感染最為普遍，血清學檢測豬抗體陽性率在90％以上。
豬日本腦炎自出現至今，關于本病診斷方法與的研究成果不斷涌現，但是傳統的檢測方法多為全病毒操作，存在感染人和散毒的危險。JEV通常只在倉鼠腎原代細胞上產生病變，而在許多常用的傳代細胞上不產生病變，這給病毒的增殖帶來了困難，而且全病毒抗原的制備過程繁瑣，缺少標準化，從而使其推廣和應用受到限制。
E蛋白是JEV病毒粒子表面最重要的結構蛋白，其表面的抗原決定簇與保護性免疫、血凝反應和血清特異性、膜融合、病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性有關。現有技術中本發明課題組已經以E基因為目標片段進行擴增，構建了重組質粒pET-E，將其在大腸桿菌BL21(DE3)中進行高效表達(相關內容已發表于中國人獸共患病雜志2003年第五期)。但是還沒有利用表達產物建立檢測豬日本腦炎的ELISA試劑盒及其檢測方法的技術。
三
發明內容
技術問題本發明的目的在于提供一種檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，用于豬日本腦炎的抗體檢測，該試劑盒具有高度的特異性、敏感性，可大量生產，大大降低了檢測成本，檢檢測成本低廉，適于推廣。對本病的抗體水平檢測、流行病學調查、類癥鑒別及采取有效防制措施方面提供重要方法。
技術方案1、檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，包括以下組分1)ELISA板條以在原核細胞中的高效表達的重組E蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有2塊經質量體積比為1％的BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封凍干保存于-20℃保存；2)洗滌液含0.05％Tween-20的20×pH7.4PBS溶液；3)血清稀釋液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100mL；4)顯色底物已加入H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液100mL；5)終止液2M H2SO4溶液100mL；6)豬日本腦炎病毒(JEV)陽性血清5mL；7)豬日本腦炎病毒(JEV)陰性學清5mL；8)辣根過氧化物酶標記的羊抗豬酶標二抗5mL。
2、上述重組E蛋白ELISA試劑盒用于檢測豬日本腦炎抗體，主要操作步驟如下1)加入血清樣品用血清稀釋液1％(M/V)BSA將被檢血清作1∶100倍稀釋后，按酶標板樣品添加模式于每孔中加入100μL，共加兩孔，于37℃下作用60min后棄去反應孔中的液體；將每個孔用約300μL的洗滌液充分清洗3次，每次持續3min，在每次洗滌后將反應孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，除去殘留的液體；2)加入羊抗豬酶標二抗每孔加入100μL酶標二抗，37℃作用45min，洗滌3次，每次3min；3)加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD溶液，37℃下作用15min；4)終止反應向每孔中加入100μL 2M H2SO4溶液終止反應；5)用酶標儀測定OD值在490nm波長下測定各孔吸光度OD值，隨后判定結果；6)結果判定已知陽性血清OD490/已知陰性血清OD490＞2.1且檢測樣品OD490＞0.4，即可判為陽性。
四有益效果
1特異性高本發明應用重組E蛋白作為包被抗原，在材料選擇上具有新意。豬在受到JEV感染后，最先產生的抗體是針對病毒的囊膜蛋白，且此抗體可在豬體內持續存在12個月以上。通過Western-blot試驗，證實重組囊膜蛋白(重組E蛋白)具有良好的反應原性，保證了檢測試劑盒的高度特異性。
2檢測試劑盒可大量生產目前，在檢測豬日本腦炎抗體方面，應用較為廣泛的是以全病毒作為抗原建立的間接血凝與血凝抑制方法和乳膠凝集方法，由于病毒需由細胞培養物中大量增殖，而真正意義上的純化病毒很難獲得。本發明使用的包被抗原為豬日本腦炎病毒(JEV)E基因的原核表達產物，其優點在于重組E蛋白易于穩定、大量獲得(用薄層掃描法測得重組E蛋白的含量占總表達產物的42％)，純化方法易于實現(應用His-bind親和層析柱純化)，重組E蛋白的包被濃度易于確定和控制，為檢測試劑盒的大量生產提供有力保證。
3檢測成本低廉，適于推廣本發明與現有方法相比，在保證特異性、敏感性的前提下，與LAT試劑盒的檢測符合率為94.2％，與HIA檢測的符合率為90.8％。本發明的檢測費用在10-15元左右，大大降低了檢測成本，有著良好的應用前景。
具體實施例方式
本發明所使用的包被抗原—重組E蛋白，為按照《中國人獸共患病雜志》2003年第五期發表論文“流行性乙型腦炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核細胞中的高效表達及其表達產物的抗原性分析”中的方法獲得的重組E蛋白。
以重組E蛋白為包被抗原的間接ELISA方法通過以下步驟實現1檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA反應條件的確定1.1方陣試驗采用棋盤法測定。取96孔ELISA板，將提純的E蛋白用pH9.6的CBS自左向右依次做1∶10、1∶20至1∶10240稀釋，每孔100μL，后于4℃過夜。次日取出后洗滌三次，每次持續3分鐘。后用1％BSA于37℃下封閉3h后洗滌同前。將陰、陽性血清也按同樣的稀釋倍數稀釋，自上而下分別加入以上的反應孔中，每孔100μL，于37℃放置60min，取出后洗滌同前。接著每孔中加入100μL稀釋至工作濃度的羊抗豬酶標二抗，于37℃作用60min，隨后洗滌同前。繼而向每孔中加入100μL OPD(已加入H2O2)，于37℃作用15min，最后加入100μL 2M H2SO4終止反應。在酶標儀上檢測OD值。取陽性血清OD值1.0、陰性血清OD值0.2(OPD為底物)所在孔的抗原濃度和血清稀釋液作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。確定最佳抗原工作濃度為25μg/ml，而血清最佳稀釋倍數為1∶100。
1.2抗原最佳包被時間的測定將按最佳抗原濃度包被好的ELISA反應板分別在37℃及4℃過夜。于次日取出包被好的反應板，用已知的陰、陽性血清按前面述及的相關步驟操作，其它條件相同。每份血清重復五孔，觀察OD490值變化及P/N變化情況。結果顯示不論是在37℃還是在4℃完成包被，對ELISA結果都不會有明顯影響。
1.3封閉液的選擇分別用2％脫脂乳、1％BSA、1.5％明膠和5％犢牛血清(FCS)作為封閉液，于室溫封閉2h，在其它條件及操作方法相同的情況下，對已知的陰、陽性血清進行ELISA檢測，每種封閉液稀釋的血清重復五孔，通過OD490值評價其封閉效果。通過試驗確定1％BSA作為封閉液。
1.4封閉條件的確定在其它條件相同的情況下，用選定的封閉液分別在37℃及室溫封閉1h、2h、3h、4h，后應用已知的陰、陽性血清進行檢測，對封閉時間及溫度進行確定。結果表明在37℃封閉1h就可以達到良好的效果。
1.5血清稀釋液的選擇分別以PBST、1％BSA、3％犢牛血清、6％犢牛血清作為稀釋液稀釋已知的陰、陽性血清，每一濃度稀釋液重復五孔，在其它條件相同的情況下，進行ELISA測定，計算各組P/N值，以該值最大且陰性血清OD值較低來選擇血清稀釋液。確定的血清稀釋液為1％BSA。
1.6血清作用時間的確定用選定的血清稀釋液將已知的陰、陽性血清做1∶100稀釋至最佳稀釋倍數后，分別于室溫及37℃下作用15min、30min、45min、60min，在其它條件及操作方法相同的情況下，進行ELISA檢測，取P/N最大且陰性血清本底較低的一組確定為最佳作用時間。最終確定血清作用時間為室溫及37℃，45min。
1.7酶標二抗作用時間的選擇將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬酶標二抗(晶美公司)用選定的血清稀釋液稀釋后于37℃及室溫下分別作用10min、15min、20min、25min、30min、60min，用已知的陰、陽性血清進行ELISA檢測，觀察OD值及P/N變化。確定羊抗豬酶標二抗作用時間為37℃，60min。
1.8底物及終止液的選擇在其他條件相同的情況下，于室溫下及37℃下分別用TMB(OD630)、OPD(OD490)作為底物，檢測已知的陰、陽性血清，分別加入2MH2SO4、2N HCL、0.12％HF作為終止液，于終止后30min內每隔10min在酶標儀上讀值，計算其P/N比值，選擇合適的底物。確定OPD為顯色底物，終止液為2M H2SO4。
1.9底物作用時間的選擇采用已知的陰、陽性血清，應用選定的底物，分別于室溫及37℃作用10min、15min、20min、25min、30min后，用確定的終止液終止反應，于終止后30min內在酶標儀上讀值，以確定底物作用的時間及作用溫度。最后確定底物OPD的作用時間為37℃，10min。
1.10判定標準的確定以200份經NTA檢測試劑盒檢測的血清，按照優化的條件進行ELISA檢測，檢測結果在計算機上用Excell軟件進行分析，確定cut-off值，以此作為依據確定判定標準。在490nm波長下測定各孔吸光度(OD值)，隨后判定結果P(OD490)/N(OD490)＞2.1且S(OD490)＞0.4，即可判為陽性。
(注S為檢測樣品；N為已知陰性血清)1.11重組E蛋白ELISA操作程序的確定按以上各項所確定的優化條件進行操作，即得到本方法的最佳操作程序取出已包被并封閉好的ELISA板條，用樣品稀釋液將被檢血清作1∶100稀釋，加入樣品孔中，37℃作用45min，棄去反應孔中的液體；將每個孔用約300μL的洗滌液充分清洗3次，在每次洗滌后將反應孔中的液體除去；最后一次除去洗滌液后，在吸水紙上拍打，除去殘留的液體；每孔加入100μL酶標二抗，37℃作用60min，洗滌3次。每孔中加入100μLOPD底物溶液，37℃避光作用10min；向每孔中加入100μL的2M H2SO4，終止反應。用酶標儀在490nm波長下測定各孔吸光度A值，讀值計算并判定結果。
實施例一、檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，包括以下組分1)ELISA板條以純化的重組E蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有2塊經1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封凍干保存于-20℃保存；2)洗滌液20倍濃度的pH7.4PBS溶液(含0.05％Tween-20)；3)血清稀釋液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100mL；4)顯色底物已加入H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液100mL；5)終止液2M H2SO4溶液100mL；6)JEV陽性血清5mL；7)JEV陰性學清5mL；8)羊抗豬酶標二抗5mL。
二、重組E蛋白ELISA試劑盒用于檢測豬日本腦炎抗體，主要操作方法如下1加入血清樣品如表1所示，用樣品稀釋液(1％BSA)將被檢血清作1∶100倍稀釋后，于每孔中加入100μL，共加兩孔。于37℃下作用60min后棄去反應孔中的液體；將每個孔用約300μL的洗滌液充分清洗3次，每次持續3min。在每次洗滌后將反應孔中的液體除去；最后一次除去洗滌液后，在吸水紙上拍打，除去殘留的液體。
2加入辣根過氧化物酶標記的羊抗豬酶標二抗(購自晶美生物技術有限公司)每孔加入100μL酶標二抗，37℃作用45min，洗滌3次。
3加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液，37℃下作用10min。
4終止反應向每孔中加入100μL終止液(2M H2SO4溶液)終止反應。
5用酶標儀測定OD值在490nm波長下測定各孔吸光度(OD值)；
6結果判定P(OD490)/N(OD490)＞2.1且S(OD490)＞0.4，即可判為陽性。
(注S為檢測樣品；N為已知陰性血清)表1 酶標板樣品添加模式
注P已知陽性血清；N已知陰性血清S1，S2，S3，S4，S5，S6等表示加各被檢樣品1、特異性試驗1.1交叉試驗 在同一條件下用本實驗室保存的JEV陰、陽性血清及豬細小病毒病陽性血清、豬圓環病毒病陽性血清、豬繁殖與呼吸障礙綜合征陽性血清、豬瘟陽性血清、豬布魯氏菌病陽性血清進行ELISA檢測，每份血清重復檢測4孔。通過OD值來判定陰陽性結果，以此來判定是否存在交叉反應。檢測結果顯示JEV陽性血清發生陽性結果，而其它均為陰性結果。
2、重復性試驗2.1批內重復 用同一批制備的重組E蛋白包被板條，取已知的陰陽性血清各一份，另外取三份待檢血清，在其它條件不變的情況下，應用本方法進行檢測，每份樣品重復四孔，根據OD值判定批內重復性。
2.2批間重復 取不同時間制備并純化的重組E蛋白(處理方法同前所述)，用pH9.6的CBS稀釋至最佳包被濃度，經包被、封閉(同前所述)后對已知的陰陽性血清及另外三份待檢血清進行檢測，每份血清檢測4孔，重復檢測五次。根據OD值判定不同時間制備的抗原建立的ELISA的可重復性。試驗結果顯示本發明具有良好的重復性。
3、包被抗原保存期的確定 純化的重組E蛋白以最佳工作濃度包被并經封閉后，用包裝袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知陰陽性血清按所建立的方法進行檢測。共檢測8次。結果顯示包被的重組E蛋白保存8個月仍可用于檢測。
4、重組E蛋白ELISA田間試驗的應用從江蘇、山東、浙江、安徽等地采集和收集血清樣品3226份，采用本發明方法檢測JEV抗體，結合樣品背景進行結果分析，并對其中的300份血清分別應用本發明方法及間接血凝與血凝抑制(HIA)和乳膠凝集試劑盒(LAT)進行檢測，檢測結果分別見表2、表3。結果顯示二者的檢出符合率為96.3％和97.6％。
表2重組E蛋白-ELISA的檢測應用
表3重組E蛋白—ELISA、LAT、HIA試劑盒檢測結果
注檢出符合率＝(共同陽性樣品數+共同陰性樣品數)÷總樣品數×100％
權利要求
1.檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，包括以下組分1)ELISA板條以重組E蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有2塊經質量體積比為1％的BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封凍干保存于-20℃保存；2)洗滌液20倍濃度的pH7.4PBS溶液；3)血清稀釋液1％BSA100mL；4)顯色底物已加入H2O2的OPD(鄰苯二胺)溶液100mL；5)終止液2M H2SO4溶液100mL；6)豬日本腦炎病毒(JEV)陽性血清5mL；7)豬日本腦炎病毒(JEV)陰性學清5mL；8)辣根過氧化物酶標記的羊抗豬酶標二抗5mL。
2.權利要求1所述用于檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，操作步驟如下1)加入血清樣品用血清稀釋液1％BSA將被檢血清作1∶100倍稀釋后，按酶標板樣品添加模式于每孔中加入100μL，共加兩孔，于37℃下作用60min后棄去反應孔中的液體；將每個孔用約300μL的洗滌液充分清洗3次，每次持續3min，在每次洗滌后將反應孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，除去殘留的液體；2)加入羊抗豬酶標二抗每孔加入100μL酶標二抗，37℃作用45min，洗滌3次；3)加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD溶液，37℃下作用15min；4)終止反應向每孔中加入100μL 2M H2SO4溶液終止液終止反應；5)用酶標儀測定OD值在490nm波長下測定各孔吸光度OD值；6)結果判定檢測樣品已知陽性血清OD490/已知陰性血清OD630＞2.1且代檢樣品OD490＞0.4，即可判為陽性。
全文摘要
本發明檢測豬日本腦炎抗體的重組E蛋白ELISA試劑盒，屬于生物技術領域。試劑盒包括以重組E蛋白作為包被抗原的ELISA板條，PBS溶液，血清稀釋液，顯色底物，終止液，JEV陽性血清，JEV陰性血清等。方法經特異性、敏感性、重復性等指標的檢驗后，將其用于血清樣品的檢測。本發明的優勢體現在有良好的特異性、可大量生產以及檢測成本低廉，大大降低了檢測成本，有著良好的應用前景。
文檔編號G01N21/25GK1766620SQ20051009477
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月13日 優先權日2005年10月13日
發明者陳溥言, 鄭其升, 曹瑞兵, 周斌, 楊耀武 申請人:南京農業大學