專利名稱：一種檢測Aβ的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學衛生領域，具體涉及一種檢測Aβ1-42抗體的方法及其試劑盒。
背景技術：
目前，我國已經進入老齡化社會，而阿爾茨海默病(AD)是老年人的常見病和多發病，其發病率高達2‰。AD是一種中樞神經系統原發性退行性病變，患者進行性智力和認知功能降低。老年斑(SP)和神經元纖維纏結(NFT)是AD的兩大病理改變。β淀粉樣蛋白(Aβ)是SP的主要成分，并參與NFT的形成。Aβ是一種含有39-43個氨基酸的多肽，由其淀粉樣前體蛋白(APP)裂解產生，AD患者SP主要成分為Aβ1-42。目前，臨床上對于AD尚缺乏實驗室輔助診斷依據。
近年來對于AD的診斷主要依賴于美國神經病學、語言障礙及卒中-阿爾茨海默病和相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)提供的可能或極可能AD標準，即參照精神狀態檢查簡表(MMSE量表)、阿爾茨海默病認知評估表(ADAS-cog)，依據其臨床癥狀與癡呆診斷標準的符合程度，緩慢進行性發展的特征，結合CT、MRI等輔助證據綜合分析其病癥，但尚缺乏輔助診斷的實驗室指標。自1993年證實正常人血清中含有Aβ1-42自身抗體以來，國外一些學者陸續建立了免疫沉淀、間接酶聯免疫、放射標記免疫等Aβ抗體的檢測方法。如Du Y[(1)Reduced levelsof amyloid beta-peptide antibody in Alzheimer disease.Neurology2001，57801-805；(2)Human anti-β-amyloid antibodies block β-amyloidfibril formation and prevent β-amyloid-induced neurotoxicity.Brain2003，126(9)1935-1939]采用的是間接酶聯免疫法；Sylvia Brettschneider(Decreased serum amyloid β1-42autoantibody levels in Alzheimer’sdisease，determined by a newly developed immuno-precipitation assay withradiolabeled amyloidβ1-42peptide.2005，57813-816)采用的是放射性同位素標記的免疫沉淀法對人血清中抗體的滴度進行了測定。目前，所有這些檢測方法缺乏統一的標準品，只能比較抗體滴度，不能做定量檢測，而且對儀器設備要求較高，方法煩瑣，不適合臨床普遍采用。本發明采用競爭酶聯免疫檢測法，對抗體可以作定量檢測，方法簡便，適合臨床普遍采用。
發明內容
1發明目的本發明的目的是建立一種簡單、實用并且有效的檢測Aβ1-42自身抗體的方法及其試劑盒，實現對AD患者及正常人體內Aβ抗體水平的臨床觀測。
2、技術方案(1)本發明提供的檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征是包括以下步驟1)利用Aβ1-42蛋白片段溶液包被固相支持物；2)將待檢測的生物學樣本加入經包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；3)清洗去除未結合的蛋白等雜物；4)加入Aβ1-42單克隆抗體溶液，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；5)清洗去除未結合的Aβ1-42單克隆抗體；6)加入經標記的針對步驟4)中Aβ1-42單克隆抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；7)清洗去除任何未結合的第二抗體；8)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結合復合物存在量的多少。
所說的生物學樣本是指來自受試者的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其他分泌物或排泄物以及組織或細胞提取物。
所說的固相支持物包括有機和無機多聚物。
所說的適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件，是指可以孵育抗原與含抗體的樣品的混合物的溫度及時間條件，其中溫度為2-37攝氏度，時間為30分鐘至48小時。
所說的第二抗體是用放射性同位素標記的，或者是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶進行標記。
(2)本發明提供的檢測Aβ1-42抗體的試劑盒，其組成為1)抗原包被板為96孔或48孔板，包被Aβ1-42蛋白片段溶液；2)競爭結合抗體為Aβ1-42單克隆抗體溶液；3)酶標記的第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)標記的針對2)中Aβ1-42單克隆抗體的第二抗體溶液；4)標準品I、含Aβ1-42抗體0.00ng/ml的溶液，II、含Aβ1-42抗體1.00ng/ml的溶液，III、含Aβ1-42抗體5.00ng/ml的溶液，IV、含Aβ1-42抗體25.0ng/ml的溶液，V、含Aβ1-42抗體125ng/ml的溶液，VI、含Aβ1-42抗體625ng/ml的溶液；5)底物重量百分比0.06％過氧化脲的0.01mol/L，PH4.5檸檬酸緩沖液；6)顯色液體積百分比0.06％四甲基聯苯胺(TMB)0.01mol/L，PH4.5檸檬酸緩沖液；7)終止液1mol/L，硫酸；8)洗滌液磷酸鹽緩沖液(PBS)，含體積百分比0.1％吐溫-20(TW-20)；此外還提供競爭法檢測Aβ1-42抗體試劑盒說明書。
所說的包被Aβ1-42蛋白片段溶液的過程為96孔或48孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段的溶液50-250ul，4℃或室溫包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的0.005-0.1mol/L，PH7.0-7.4的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的0.005-0.1mol/L，PH7.0-7.4的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板，鋁箔袋真空包裝2-8℃保存。
所說的標準品是用含重量百分比1％BSA的0.005-0.1mol/L，PH7.0-7.4的PBS將市售(Sigma)的Aβ1-42多價抗體稀釋為分別含Aβ1-42抗體0.00、1.00、5.00、25.0、125、625ng/ml的6種溶液。
本發明為臨床診斷阿爾茨海默病提供了實驗室依據，具有較高的準確性，方法簡便、實用，適合臨床普遍開展。
3、有益效果(1)、特異性為檢驗該測定方法的特異性，本發明在人血清中加入Aβ1-42蛋白片段包被的聚苯乙烯磁珠，將Aβ1-42抗體進行吸附分離，對吸附后的血清進行檢測。
(2)、靈敏度將兔抗Aβ1-42多價抗體作系列稀釋至0.01；0.20；1.00；5.00；25.0；125；625ng/ml進行測定，結果顯示，當濃度≥1.0ng/ml時，其濃度與OD值在半對數表上呈線性關系，見圖1競爭ELISA檢測Aβ1-42抗體工作曲線。
(3)、準確度我們用回收試驗來判斷該方法的準確度，在5份已知濃度的血清樣本中分別加入1ug/ul的兔抗Aβ1-42多價抗體，測定其濃度。當加入抗體終濃度為10.0ng/ml時，回收率平均為102.9％；加入抗體終濃度為100.0ng/ml時，回收率平均為97.7％，結果見表1。
表1、Aβ1-42抗體回收試驗結果
本實驗方法的最低可檢測濃度約為1.0ng/ml，馬血清和經免疫磁珠吸附后的人血清對本法干擾小，回收檢測符合率＞95％，說明其靈敏度、特異性和準確度基本滿足臨床檢測要求，方法簡便，適合臨床普遍開展。
四
圖1是競爭ELISA檢測Aβ1-42抗體工作曲線。
五具體實施例方式
本發明所述的生物學樣本是指來自受試者的血液、血清、血漿、尿樣、體液、和其他分泌物或排泄物以及組織或細胞提取物，包括細胞培養上清。
所述的第二抗體是IgG抗體，如羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
所述的固相支持物包括本領域周知的有機和無機多聚物，包括但不局限于聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等，并可使用本領域周知的多種方法包被固相支持物。
所述的適合形成抗原抗體免疫復合物的條件為本領域周知，是指在適當的溫度及時間條件下孵育含抗原、抗體的混合物，例如在2-37℃下，30分鐘至48小時。
經孵育形成抗原抗體免疫復合物后，用本領域常用的適當洗滌溶液洗滌檢測板數次，以清除未結合的抗原或抗體。所用清洗液一般為PH5-8，優選含體積百分比0.1％TW-20的PH7.2的PBS。
可采用多種本領域周知的方法定量檢測抗原抗體復合物的形成。本發明優選的實施方案中，使用HRP標記的第二抗體，所以選用以過氧化物溶液為底物，聯苯胺類物質為顯色液，在波長為450nm(參比波長630nm)處，酶標儀讀取吸光度值和被測物含量，被測物含量是根據樣本吸光度值由6點標準品吸光度值經四參數方程擬合的標準曲線自動計算得出的。
本發明也涉及用于這些方法檢測Aβ1-42抗體的檢測試劑盒。根據本發明檢測Aβ1-42抗體的試劑盒包括用Aβ1-42蛋白片段包被的固相支持物和使用該試劑盒的說明書，還包括如上文所述的競爭抗體、標記的第二抗體和6種不同濃度的標準品。標準品是用適當的不含Aβ1-42抗體的蛋白溶液或陰性血清將市售(Sigma)的Aβ1-42多價抗體稀釋而成。另外該試劑盒還包括上述底物、顯色液及終止液。
下列實施例詳細解釋本發明，但這并不限制本發明的范圍。
實施例一按下列步驟，我們對10例健康體檢人員(N1-10)及4例AD患者(A1-4)血清中Aβ1-42抗體水平進行了檢測，該實施例中的磷酸鹽緩沖液(PBS)的濃度是0.005mol/L，PH值是7.0。
1)包被96孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段1.0ng/ul的溶液50ul，4℃包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板；2)加樣本經包被的板條每孔中加入取自人體的待測血清，血清加入量50ul，同時用含重量百分比1％的BSA的PBS將兔抗Aβ1-42多價抗體作系列稀釋至0.00；1.00；5.00；25.0；125；625ng/ml制作標準曲線，4℃下靜置48小時；3)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干；4)競爭結合用用含重量百分比1％的BSA的PBS將Aβ1-42單克隆抗體稀釋至2.0ng/ul，在上述板條中加入稀釋后的Aβ1-42單克隆抗體，加入量50ul/孔，4℃下靜置48小時；5)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；6)加標記抗體加入用PBS稀釋至10ng/ul的市售HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，加入量50ul/孔，4℃下靜置48小時。
7)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；8)檢測加入底物25ul/孔，37℃下靜置15分鐘，再加入顯色液25ul/孔，37℃下靜置15分鐘后加終止液25ul/孔，最終在酶標儀上波長450nm(參比波長630nm)處讀取吸光度(OD)值和濃度值。
本實施例檢測結果見表2。
表2、部分正常人及AD患者血清Aβ1-42抗體水平(ng/ml)
實施例二按下列步驟，我們對以上10例健康體檢人員及4例AD患者血清中Aβ1-42抗體水平進行了重復檢測，該實施例中的磷酸鹽緩沖液的濃度是0.1mol/L，PH值是7.4。
1)包被48孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段100ng/ul的溶液250ul，室溫包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板；2)加樣本經包被的板條每孔中加入取自人體的待測血清，血清加入量250ul/孔，標準曲線制作參照實施例一，37℃下靜置30分鐘；3)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干；4)競爭結合用用含重量百分比1％的BSA的PBS將Aβ1-42單克隆抗體稀釋至200ng/ul，在上述板條中加入稀釋后的Aβ1-42單克隆抗體，加入量250ul/孔，37℃下靜置30分鐘；5)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；6)加標記抗體加入用PBS稀釋至200ng/ul的市售HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，加入量250ul/孔，37℃下靜置30分鐘。
7)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；8)檢測加入底物100ul/孔，37℃下靜置15分鐘，再加入顯色液100ul/孔，37℃下靜置15分鐘后加終止液50ul/孔，最終在酶標儀上波長450nm(參比波長630nm)處讀取吸光度(OD)值和濃度值。
本實施例檢測結果見表3。
表3、10例正常人及4例AD患者血清Aβ1-42抗體水平(ng/ml)
實施例三按下列步驟，我們對以上10例健康體檢人員及4例AD患者血清中Aβ1-42抗體水平進行了再次重復檢測，該實施例中的磷酸鹽緩沖液的濃度是0.01mol/L，PH值是7.2。
1)包被96孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段10ng/ul的溶液100ul，4℃包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板；2)加樣本經包被的板條每孔中加入取自人體的待測血清，血清加入量100ul/孔，標準曲線制作參照實施例一，室溫下靜置2小時；3)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干；4)競爭結合用用含重量百分比1％的BSA的PBS將Aβ1-42單克隆抗體稀釋至20ng/ul，在上述板條中加入稀釋后的Aβ1-42單克隆抗體，加入量100ul/孔，室溫下靜置2小時；5)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；6)加標記抗體加入用PBS稀釋至50ng/ul的市售HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，加入量100ul/孔，室溫下靜置2小時。
7)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；8)檢測加入底物50ul/孔，37℃下靜置15分鐘，再加入顯色液50ul/孔，37℃下靜置15分鐘后加終止液25ul/孔，最終在酶標儀上波長450nm(參比波長630nm)處讀取吸光度(OD)值和濃度值。
本實施例檢測結果見表4。
表4、10例正常人及4例AD患者血清Aβ1-42抗體水平(ng/ml)
實施例四按以下步驟，我們對96例健康體檢人員血清中Aβ1-42抗體水平進行了檢測，該實施例中的磷酸鹽緩沖液的濃度是0.01mol/L，PH值是7.2。
1)包被96孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段10ng/ul的溶液100ul，4℃包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板；2)加樣本經包被的板條每孔中加入取自人體的待測血清，血清加入量100ul/孔，標準曲線制作參照實施例一，37℃靜置30分鐘；3)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干；4)競爭結合用用含重量百分比1％的BSA的PBS將Aβ1-42單克隆抗體稀釋至20ng/ul，在上述板條中加入稀釋后的Aβ1-42單克隆抗體，加入量100ul/孔，37℃靜置30分鐘；5)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；6)加標記抗體加入用PBS稀釋至50ng/ul的市售HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，加入量100ul/孔，37℃靜置30分鐘。
7)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；9)檢測加入底物50ul/孔，37℃下靜置15分鐘，再加入顯色液50ul/孔，37℃下靜置15分鐘后加終止液25ul/孔，最終在酶標儀上波長450nm(參比波長630nm)處讀取吸光度(OD)值和濃度值。
本實施例檢測結果見表5。
表5、96例正常人血清Aβ1-42抗體水平(x±s)
實施例五按以下步驟，我們對37例AD患者血清中Aβ1-42抗體水平進行了檢測，該實施例中的磷酸鹽緩沖液的濃度是0.01mol/L，PH值是7.2。
1)包被48孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段10ng/ul的溶液100ul，4℃包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白(BSA)和重量百分比1％脫脂奶粉的PBS室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板；2)加樣本經包被的板條每孔中加入取自人體的待測血清，血清加入量100ul/孔，標準曲線制作參照實施例一，37℃靜置30分鐘；3)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌2次，拍干；4)競爭結合用用含重量百分比1％的BSA的PBS將Aβ1-42單克隆抗體稀釋至20ng/ul，在上述板條中加入稀釋后的Aβ1-42單克隆抗體，加入量100ul/孔，37℃靜置30分鐘；5)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；6)加標記抗體加入用PBS稀釋至50ng/ul的市售HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，加入量100ul/孔，37℃靜置30分鐘。
7)用含體積百分比0.1％TW-20的PBS洗滌3次，拍干；8)檢測加入底物50ul/孔，37℃下靜置15分鐘，再加入顯色液50ul/孔，37℃下靜置15分鐘后加終止液25ul/孔，最終在酶標儀上波長450nm(參比波長630nm)處讀取吸光度(OD)值和濃度值。
本實施例檢測結果見表6。
表6、37例AD患者血清Aβ1-42抗體水平(x±s)
權利要求
1.一種檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征是包括以下步驟1)利用Aβ1-42蛋白片段溶液包被固相支持物；2)將待檢測的生物學樣本加入經包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；3)清洗去除未結合的蛋白等雜物；4)加入Aβ1-42單克隆抗體溶液，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；5)清洗去除未結合的Aβ1-42單克隆抗體；6)加入經標記的針對步驟4)中Aβ1-42單克隆抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件下孵育；7)清洗去除任何未結合的第二抗體；8)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結合復合物存在量的多少。
2.根據權利要求1所述的檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征是所說的生物學樣本是指來自受試者的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其他分泌物或排泄物以及組織或細胞提取物。
3.根據權利要求1所述的檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征在于所說的固相支持物包括有機和無機多聚物。
4.根據權利要求1所述的檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征在于所說的適合形成抗原抗體免疫結合復合物的條件，是指可以孵育抗原與含抗體的樣品的混合物的溫度及時間條件，其中溫度為2-37℃，時間為30分鐘至48小時。
5.根據權利要求1所述的檢測Aβ1-42抗體的方法，其特征在于所說的第二抗體是用放射性同位素標記的，或者是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶進行標記。
6.一種檢測Aβ1-42抗體的試劑盒，其特征在于試劑盒組成為1)抗原包被板96孔或48孔板，包被Aβ1-42蛋白片段溶液；2)競爭結合抗體Aβ1-42單克隆抗體溶液；3)酶標記的第二抗體酶標記的針對Aβ1-42單克隆抗體的第二抗體溶液；4)標準品；5)底物；6)顯色液；7)終止液；8)洗滌液；
7.根據權利要求6所述的一種檢測Aβ1-42抗體的試劑盒，其特征在于所說的包被Aβ1-42蛋白片段溶液的過程為96孔或48孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板，孔間、板間和批間差CV＜10％，選用0.05mol/L，PH9.6碳酸鹽緩沖液為包被液，每孔加入含Aβ1-42蛋白片段的溶液50-250ul，4℃或室溫包被過夜，然后棄去包被溶液，包被板用洗滌液洗滌2次，拍干，加入含重量百分比1％牛血清白蛋白和重量百分比1％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液室溫封閉2小時，棄去封閉液，風干包被板，鋁箔袋真空包裝2-8℃保存。
8.根據權利要求6所述的一種檢測Aβ1-42抗體的試劑盒，其特征在于所說的標準品是用含重量百分比1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液將Aβ1-42多價抗體稀釋為分別含Aβ1-42抗體0.00、1.00、5.00、25.0、125、625ng/ml的6種溶液。
9.根據權利要求6所述的一種檢測Aβ1-42抗體的試劑盒，其特征在于所說的酶標記的第二抗體是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶進行標記，優選辣根過氧化物酶。所說的底物、顯色液、終止液及洗滌液為本領域周知的物質，優選底物為重量百分比0.06％過氧化脲的0.01mol/L，PH4.5檸檬酸緩沖液，顯色液為體積百分比0.06％四甲基聯苯胺的0.01mol/L，PH4.5檸檬酸緩沖液，終止液為1mol/L硫酸，洗滌液為含體積百分比0.1％吐溫-20的0.01mol/L，PH7.2的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種檢測Aβ
文檔編號G01N33/547GK1928564SQ20061009642
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月25日 優先權日2006年9月25日
發明者劉俊華 申請人:劉俊華