專利名稱：一種測定dna鏈上嘧啶二聚體含量的方法
技術領域：
本發明屬于基因突變的檢測方法技術領域，特別涉及DNA鏈上嘧啶二聚體含量的測定方法及突變的免疫檢測方法。
背景技術：
據《香料香精化妝品》(2005.625-28，32)報道，紫外線照射會引起DNA損傷，形成嘧啶二聚體(CPD)。嘧啶二聚體的形成會引起皮膚炎癥、皮膚衰老、甚至皮膚癌等多種病癥。嘧啶二聚體的含量反映了DNA受損程度，可以用來評價各種預防及治療手段的有效性等。定量測定嘧啶二聚體含量是研究紫外損傷的必要手段，因此，人們一直在探索有效的檢測方法。
目前測量CPD濃度的常用方法包括德國《分子和普通遺傳學》(Mol Gen Genet，1982，186.4475-7)提到的放射免疫法(RIA)、美國《分析生物化學》(Anal Biochem，2004，329.2263-8)使用的高效液相色譜法(HPLC)、荷蘭《環境科學》(J Environ Sci，2004，16.1173-6)使用的酶聯免疫法(ELISA)和美國《光化學和光生物學》(Photochem Photobiol，1996，64.2310-5)提到的氣質聯用法(GC-MS)。其中放射免疫法由于要用到同位素，已逐漸被淘汰。高效液相色譜法只能對長度一致的底物進行分析，無法用來檢測細胞內的嘧啶二聚體含量。氣質聯用法由于整個過程中樣品制備繁瑣，只能檢測比較單一的底物，對測試者的要求較高，而且需要兩臺高精密的儀器，因此也比較難以推廣使用。ELISA是相對簡便、實用性較廣的方法，近年發表的文章中多采用ELISA方法。但由于ELISA方法需要包被抗原和反復多次的洗板，還需要二抗標記和顯色等，步驟多，操作繁瑣，所需時間較長；同時由于操作步驟多，容易產生較大的操作誤差，從而引起定量不夠準確等缺點。因此開發快速定量檢測CPD的技術具有重要的實際意義。
發明內容
本發明的目的是提出一種利用免疫競爭原理來測定DNA鏈上嘧啶二聚體含量的方法，以克服現有方法操作繁瑣、樣品處理復雜、可檢測樣品范圍窄、甚至污染環境等缺點。
本發明測定DNA鏈上嘧啶二聚體含量的方法，其特征在于先合成一段只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的探針DNA，且其末端經過生物素修飾；經紫外照射使相鄰的兩個嘧啶堿基形成嘧啶二聚體后，將該探針DNA固定到芯片表面；再合成一段末端不帶修飾且只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的單鏈DNA，用紫外線照射使相鄰嘧啶堿基形成嘧啶二聚體之后，經反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離得到嘧啶二聚體的標準品；在0～80nM之間取包含邊界的五種以上不同濃度的嘧啶二聚體標準品分別與0.2～5μg/ml范圍內特定濃度的嘧啶二聚體抗體混合，通過表面等離子共振傳感器檢測混合液流過芯片表面時產生的響應值，將響應值對嘧啶二聚體濃度作圖，得到嘧啶二聚體的標準曲線；將待測樣品與建立標準曲線相同濃度的抗體混合，檢測混合液流過芯片產生的響應值，將其與標準曲線對照，即可得出樣品中嘧啶二聚體的濃度。
如果待測樣品中DNA鏈的長度超過500bp，則需將其打斷，形成500pb以下的短鏈，再進行測量。
本發明利用了免疫競爭的原理，將含有嘧啶二聚體的探針DNA耦聯到芯片表面，含有嘧啶二聚體的待測樣品與特異識別嘧啶二聚體的抗體混合，通過表面等離子共振傳感器檢測混合液流過芯片表面時產生的響應值。
由于一部分抗體優先與樣品中的CPD結合，所以抗體與樣品混合后，會導致結合到芯片表面的抗體量與單獨流過抗體時相比有所減少，根據抗體的減少量即可知道待測樣品中嘧啶二聚體的濃度。本發明與荷蘭《環境科學》(J Environ Sci，2004，16.1173-6)使用的酶聯免疫法相比，其優點有①檢測快速，整個過程在幾分鐘內即可完成；②定量準確，重現性好；③所用芯片可以重復使用，檢測成本低；④可檢測的樣品范圍廣。本發明方法可以廣泛地用于光修復酶活性的檢測、研究紫外線對DNA的損傷、DNA損傷修復，以及評價臭氧層破壞對人體健康的影響等諸多領域。
附圖1是實施例1所測得的嘧啶二聚體的標準曲線。
具體實施例方式
實施例1、嘧啶二聚體(CPD)濃度的測定1.制備CPD標準品嘧啶二聚體粗樣的制備采用由上海生工公司合成的一段只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的寡核苷酸鏈，鏈中只有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置，目的是保證每條鏈上只會形成一個嘧啶二聚體，便于對嘧啶二聚體進行準確定量。本實施例中使用的寡核苷酸鏈序列為5’-AGA GCA GTT GACACG-3’。將100μl含20％丙酮的150μM寡聚核苷酸水溶液樣品放置于不能透過小于290nm波長光的玻璃核磁管中，用純度＞99.999％的高純氬氣充氣鼓泡15分鐘，用封口膜封口。準備好的樣品用300瓦高壓汞燈照射，水浴溫度為25℃，燈距為5cm。將照射1小時后的樣品取出至1.5ml的離心管中，以13,000轉/分鐘的速度離心10分鐘，取上清用反相高壓液相色譜(RP-HPLC)檢測或純化，或放置于-20℃冰箱中備用。
CPD寡聚核苷酸的反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測和純化采用的條件為流動相A7％乙腈(ACN)，0.1M三乙胺乙酸酯(TEAA)，pH 7.0流動相B10％ACN，0.1M TEAA，pH 7.0泵型號Waters 600檢測器Waters 2487紫外線雙通道檢測器色譜柱Gemini C18 column(50×4.60mm，110，菲羅門)洗脫程序0-5min，7％ACN和100mM TEAA(pH7.0)5-35min為7-10％ACN和100mM TEAA(pH 7.0)流速0.75ml/min柱溫60℃檢測方式260nm紫外吸收上樣量20μl用微量注射器取20μl上述照射后樣品，注射至反相柱，進行RP-HPLC分析，收集10.8分鐘色譜峰的樣品，并用沃特斯公司的Millennium 32軟件進行分析和定量，得到CPD標準品。
2.將探針DNA耦聯到芯片表面1)將合成的一段只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的探針DNA的5’端加上生物素修飾(鏈中只有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置，目的是保證每條鏈上只會形成一個嘧啶二聚體)。
本實施例中使用的探針DNA序列為生物素-(CH2)6-AGA GCA GTT GAC ACG-3’；按上面的條件照射后保存于-20℃備用；2)在BIACORE3000儀器上安裝SA芯片，儀器操作及探針的耦聯均按BIACORE公司提供的方法；用1M NaCl/50mM NaOH沖洗芯片表面三次，每次一分鐘；將照射過的CPD探針用PBS緩沖液稀釋成1μM，按5μl/min流速上樣10分鐘，從而將CPD耦聯到芯片表面上。
所述探針DNA末端修飾，除了本實施例所用的生物素修飾外，還可以用氨基修飾，通過共價耦聯的方式將探針連接到芯片表面；也可以用巰基修飾，直接將探針DNA組裝到芯片表面上。
3.標準曲線的建立1)、樣品的準備 將購買于SIGMA公司的抗體(產品編號T1192)用含1mg/ml牛血清白蛋白的PBS稀釋1000倍，將稀釋的抗體分裝成每管150ul，將上面制備的CPD標準品用PBS稀釋成0、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160nM，各取150ul加入到抗體中；使混合液中抗體終濃度為1μg/ml，CPD的濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80nM。(注抗體濃度的變化會對本方法的檢測范圍產生影響，0.2ug/ml的低濃度抗體會對低濃度的CPD比較敏感，但線性范圍窄；5ug/ml的高濃度抗體可以測定較濃的樣品，線性范圍寬，但對低濃度的CPD不敏感。綜合考慮了靈敏度和線性檢測范圍，本實施例所用抗體濃度為1mg/ml)。
2)、測試將表面等離子共振傳感器BIACORE3000系統流速設為5μl/min，上樣上述抗體與CPD的混合樣15μl，采集結合最高點的信號；然后將流速設為30μl/min，用10mMNaOH進樣30秒進行再生，等待2min；再進行下一輪分析，每個濃度至少重復三次。
上面測試的結果用origin軟件作圖，橫坐標表示嘧啶二聚體的濃度，縱坐標表示測得的響應值，得到的標準曲線如附圖1所示圖中橫坐標表示嘧啶二聚體的濃度，縱坐標表示所測得的響應值。
4.樣品的測試將樣品與建立標準曲線相同濃度的抗體混合，將混合液流過芯片表面并檢測響應值，與標準曲線相比對，即可得到未知樣品中嘧啶二聚體的濃度。如果樣品是質粒或長鏈DNA，譬如檢測細胞內基因組DNA上CPD的含量，須將樣品打斷，可以用超聲或高速剪切的方法處理，形成500pb以下的短鏈，否則會影響測量結果的準確性。
權利要求
1.一種測定DNA鏈上嘧啶二聚體含量的方法，其特征在于先合成一段只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的探針DNA，且其末端經過生物素修飾；經紫外照射使相鄰的兩個嘧啶堿基形成嘧啶二聚體后，將該探針DNA固定到芯片表面；再合成一段末端不帶修飾且只含有兩個嘧啶堿基處于相鄰位置的單鏈DNA，用紫外線照射使相鄰嘧啶堿基形成嘧啶二聚體之后，經反相高效液相色譜分離得到嘧啶二聚體的標準品；在0～80nM之間取包含邊界的五種以上不同濃度的嘧啶二聚體標準品分別與0.2～5μg/ml范圍內特定濃度的嘧啶二聚體抗體混合，通過表面等離子共振傳感器檢測混合液流過芯片表面時產生的響應值，將響應值對嘧啶二聚體濃度作圖，得到嘧啶二聚體的標準曲線；將待測樣品與建立標準曲線相同濃度的抗體混合，檢測混合液流過芯片產生的響應值，將其與標準曲線對照，即可得出樣品中嘧啶二聚體的濃度。
2.如權利要求1所述測定DNA鏈上嘧啶二聚體含量的方法，其特征在于對于DNA鏈的長度超過500bp的待測樣品，將其打斷形成500pb以下的短鏈再進行測量。
全文摘要
本發明測定DNA鏈上嘧啶二聚體含量的方法，特征是將末端經生物素修飾的帶有一個嘧啶二聚體的探針DNA固定到芯片表面；制備嘧啶二聚體標準品；將0～80nM嘧啶二聚體標準品與0.2～5μg/ml嘧啶二聚體抗體混合，將表面等離子共振傳感器檢測混合液流過芯片表面的響應值對嘧啶二聚體濃度作圖得標準曲線；將待測樣品與建立標準曲線相同濃度的抗體混合，檢測混合液流過芯片表面的響應值，即可據標準曲線得出樣品中嘧啶二聚體的濃度。本發明檢測快速，定量準確，重現性好；芯片可以重復使用，檢測成本低；可檢測的樣品范圍廣；可用于光修復酶活性的檢測、研究紫外線對DNA的損傷、DNA損傷修復，及評價臭氧層破壞對人體健康的影響。
文檔編號G01N21/55GK1945332SQ20061009626
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月1日 優先權日2006年10月1日
發明者羅昭鋒, 沐萬孟, 王玉珍, 林琳, 郭曉鵬 申請人:中國科學技術大學