專利名稱：一種合成喹乙醇人工抗原的方法
技術領域：
本發明涉及以小分子化合物作為半抗原合成人工抗原的方法。具體而言，本發明涉及一種新的合成喹乙醇(Olaquindox)人工抗原的方法。更具體地說，本發明所述方法使用固體光氣作為偶聯劑(或稱連接臂)，偶聯喹乙醇與載體蛋白從而合成喹乙醇的人工抗原。
背景技術：
喹乙醇(Olaquindox)，又名快育靈、倍育諾(Bayonox)、奧拉金、喹酰胺醇、Fedan。分子式C-(12)H-(13)N-3甲酸甲酯-3-O-4。由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物與乙醇胺縮合而成的淡黃色結晶性粉末，微溶于水。
喹乙醇抗菌效力好，促進生長發育，增加瘦肉率，價格便宜。因此曾經被作為抗菌促生長作用的飼料添加劑大量使用。
然而，喹乙醇在被大量使用后，人們也發現了許多問題，如雞等禽類對喹乙醇敏感。人們對使用喹乙醇添加劑的雞進行病理解剖時，發現雞的臟器有藥物致損的現象。喹乙醇在動物體內的殘留時間長，蓄積毒性大，不僅能使動物中毒或死亡，而且殘留在肉中對人體也有較大危害。由于喹乙醇是由2-甲酸甲酯-3-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物與乙醇胺縮合而成的，有人認為喹乙醇在動物體內代謝后會生成甲基喹噁啉-1、4-二氧化物，這種物質能抑制脫氧核糖核酸的合成，對染色體畸變有影響，是一種致癌物。
鑒于喹乙醇的毒性和存在的潛在危害，因而人們重新對喹乙醇的安全性進行評價，對喹乙醇的使用也做出了新的規定。美國沒有批準使用；歐盟也從1999年開起始全面禁止使用喹乙醇；我國對喹乙醇使用的限制也更加嚴格。我國農業部頒布的《動物性食品獸藥最高殘留限量》中也列入了喹乙醇。國家進出口檢驗檢疫局制定了肉中喹乙醇殘留量的檢驗方法《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準——出口肉中喹乙飼料添加劑質量監督檢測實施細則》也把雞飼料、飲水及魚飼料中的喹乙醇作為違禁藥物進行監督檢驗。
現有的喹乙醇檢測方法多為色譜法，但是這些方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響較大；再者這些方法需要復雜的儀器，且過程繁瑣，不適應現場大量樣本的篩查。基于抗原抗體免疫反應的免疫學檢測技術為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。該技術研究的關鍵是半抗原分子的設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。
因為喹乙醇是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯得到具有免疫原性的人工抗原。喹乙醇人工抗原和特異性抗體以及在此基礎上建立免疫分析方法尚未見報道。并且本發明首次用固體光氣作為連接劑用于制備喹乙醇的人工抗原。
發明內容
本發明的目的在于提供喹乙醇(Olaquindox)人工抗原及合成方法。
一方面，本發明提供了一種合成喹乙醇人工抗原的方法。
喹乙醇是有機小分子半抗原，必須與大分子載體偶聯后才成為完全抗原。
本發明使用固體光氣(BTC)(學名雙-三氯甲基碳酸酯)作為偶聯試劑。固體光氣以前主要用作有機化合物合成過程中的偶聯劑，本發明將其作為合成免疫原的偶聯劑。固體光氣與以往合成免疫原中常用的偶聯劑相比，其作為固體，因而使用方便，能準確稱量，從而可以避免偶聯劑過量使用產生的副反應，并且固體光氣與光氣相比，毒性低，容易儲存。
本發明所述的合成喹乙醇人工抗原的方法包括(a)稱取喹乙醇溶于吡啶和DMF混合(1∶1)溶液中，稱取固體光氣(BTC)溶于二氯甲烷中，在冰浴條件下先將少許BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反應幾分鐘后將剩余的BTC溶液全部加入，轉入室溫攪拌反應1小時，得到混合溶液A。
稱取載體蛋白溶于弱堿性的硼酸鈉緩沖液中，向其中加入1ml DMF得到載體蛋白溶液B。
(b)將溶液A逐滴加于載體蛋白溶液B中，緩慢滴加，半小時內加完，室溫下反應4小時得喹乙醇-載體蛋白偶聯物。
在一個優選實施方案中，所述合成喹乙醇人工抗原的方法的具體操作為稱取26.3mg喹乙醇溶于3ml的吡啶和DMF混合(1∶1)溶液中，稱取固體光氣(BTC)9.9mg溶于1ml二氯甲烷中，在冰浴條件下先將少許BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反應幾分鐘后將剩余的BTC溶液全部加入，轉入室溫攪拌反應1小時，得到混合溶液A。
稱取50mg載體蛋白溶于0.1mol/LpH 8.4的5ml硼酸鈉緩沖液中，向其中加入1ml DMF得到載體蛋白溶液B。
將溶液A逐滴加于載體蛋白溶液B中，緩慢滴加，半小時內加完，室溫下反應4小時得喹乙醇-載體蛋白偶聯物。
本發明的一個優選實施方案中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，BSA與喹乙醇之間的偶聯比為1∶10。
另一個優選實施方案中，所述載體蛋白為匙孔戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，KLH與喹乙醇之間的偶聯比為1∶20。
另一方面，本發明提供了一種制備抗喹乙醇多克隆抗體的方法，該方法包括下列步驟1)將本發明制備的喹乙醇-載體蛋白偶聯物純化；
2)將純化后的喹乙醇-載體蛋白偶聯物與與等量弗氏完全佐劑混合后制成乳化疫苗，進行動物初次免疫，再次免疫時以弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，兩次免疫的間隔時間為三周，從第三次免疫開始，每次免疫后10天，取血進行抗體效價監測，最后一次免疫后7天取血，室溫凝固2h后4℃過夜，8000r/min離心10分鐘，分離出全抗血清，對全抗血清進行分離純化后即得本發明所述的多克隆抗體。
在一個優選實施方案中，所述的偶聯物純化具體操作為過SephadexG-25M凝膠層析純化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析純化偶聯物，液用0.01M PBS(pH 7.4)進行洗脫。
一個具體實施方案中，動物免疫時使用的動物是兔。
一個具體實施方案中，所述全抗血清分離純化為用50％飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33％飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經透析后再用SephadexG-25M層析除去硫酸銨，即得本發明所述的多克隆抗體。
另一方面，本方面提供了一種抗喹乙醇的多克隆抗體，該多克隆抗體是一種以喹乙醇為半抗原制得的多克隆抗體，也可以說本發明的多克隆抗體是一種以半抗原-載體蛋白偶聯物免疫動物，取學分離出全血清，分離純化得到的多克隆抗體。
本發明的多克隆抗體采用pH為7.3的磷酸緩沖液時，SDS-PAGE電泳檢測純度為98％以上。
另一方面，本發明提供了本發明所述多克隆抗體在檢測喹乙醇中的用途。
本發明通過間接ELISA和間接競爭ELISA試驗，對本發明制得的多克隆抗體進行了效價和特異性測定，試驗結果表明，本發明的抗體效價在6000以上，并且具有良好的抗喹乙醇特異性。因此，本發明所述多克隆抗體可用于檢測喹乙醇的殘留，或者用于制備檢測喹乙醇殘留的試劑。
圖1喹乙醇紫外掃描圖。
圖2牛血清白蛋白紫外掃描圖。
圖3喹乙醇人工抗原紫外掃描圖。
提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。
實施例實施例1 免疫原的合成及免疫血清的制備1.1試劑與儀器喹乙醇(湖北中牧安達藥業有限公司生產)，固體光氣(BTC)(購自北京耀北生物技術有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密歐化學試劑開發中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產，購自百靈威化學試劑公司)，正三丁胺(Tributylamine，美國新澤西州ACROSORGANICS公司生產，購自百靈威化學試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)，二氯甲烷(北京世紀紅星化工有限責任公司生產)雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置(3057型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數控計滴器，恒流泵，自動部分收集器，層析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學儀器有限公司)，臺式離心機(Minispin最大轉速13400rpm最大離心力12100rcf，2ml×12)，1.2喹乙醇人工抗原的合成稱取26.3mg喹乙醇溶于3ml的吡啶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合(1∶1)溶液中，稱取固體光氣(BTC)9.9mg溶于1ml二氯甲烷中。
將上述喹乙醇和固體光氣兩溶液混合。具體方法為在冰浴條件下先將少許BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反應幾分鐘后將剩余的BTC溶液全部加入，轉入室溫攪拌反應1小時，得到混合溶液A。
稱取50mg載體蛋白BSA或KLH分別溶于0.1mol/L pH 8.4的5ml硼酸鈉緩沖液中，向其中加入1ml DMF得到載體蛋白溶液B。
將溶液A逐滴加于載體蛋白溶液B中，緩慢滴加，半小時內加完，室溫下反應4小時。
然后，將偶聯物過SephadexG-25M凝膠層析純化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯物，洗脫液用pH 7.40.01M PBS。
通過紫外線掃描鑒定偶聯物。具體操作為將喹乙醇溶于PBS(0.01M pH 7.4)，濃度為15μg/ml；BSA溶于PBS(0.01M pH 7.4)，濃度為1.03mg/ml；將純化后的偶聯物同樣用PBS(0.01M pH 7.4)作適當稀釋，使其濃度與BSA濃度接近。將這三種溶液在200nm-400nm之間進行紫外掃描，得出各物質的紫外掃描波譜，如圖1-3所示。從圖1-3中可以看出喹乙醇與載體蛋白BSA偶聯成功。
免疫及特異性抗體的制備將上述喹乙醇-BSA偶聯物用生理鹽水稀釋成1mg/ml溶液備用。
選取6只體重2～2.5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按1mg/Kg體重的量進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固2h后4℃過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50％飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33％飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經透析后用SephadexG-25M層析，即得多克隆抗體。
實施例2免疫檢測方法的建立2.1ELISA方法確定最佳包被濃度將1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml系列濃度的卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶聯物按每孔100μl包被酶標板，4℃包被24h，洗滌5次，拍干，按每孔200μl封閉液4℃下封閉12h，洗滌3次，拍干。加入1∶500稀釋的抗血清100μl，室溫作用2h，洗滌三次，立即加入100μl酶標羊抗兔抗體，室溫作用30min，洗滌三次，加100μl底物液，室溫避光作用15min，50μl終止液終止反應，酶標儀檢測A值(450nm)。同時設置空白對照孔(不加抗血清，只加其稀釋液)和平行重復孔，取OD值為1.0左右時的包被濃度為最佳濃度。試驗數據列于表3。
表1 不同包被濃度的OD值
由表3的數據中可以確定，最佳包被濃度為1μg/ml。
2.2間接ELISA檢測抗體效價以1μg/ml濃度包被酶標板，從400倍開始倍比稀釋抗血清，按2.1的ELISA步驟操作。以兩倍于陰性血清OD值的抗血清OD值對應的抗血清稀釋度為抗血清效價。抗血清效價檢測結果見表4。
表2 抗血清效價檢測結果
從表4的數據可以確定本發明制備的抗血清的效價在6000以上。
2.3間接競爭ELISA檢測抗體特異性ELISA操作方法同2.1。不同的是每孔加入50μl不同濃度的游離喹乙醇與卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶聯物競爭抗體，隨后加入抗血清，得出不同的OD值。根據2.1的結果，所用抗血清最佳濃度為1∶500。喹乙醇系列濃度和試驗孔的排列順序見表3，同時設置平行重復孔和空白對照孔。以0抑制孔的OD值為最大值B0，其它抑制濃度孔OD值為B，B/B0＝50％時對應的喹乙醇濃度為此抗體的IC50值。抗體的特異性檢測結果的數據列于表3。然后，用所得數據繪制出喹乙醇抑制曲線(圖2)。
表3 抗血清特異性檢測結果
由表3中數據可知，喹乙醇抗血清IC50值在5ng/ml左右，表明本發明制備的抗血清是具有良好的特異性的抗喹乙醇多克隆抗體。
權利要求
1.一種多克隆抗體，其特征是以小分子化合物喹乙醇為半抗原與載體蛋白偶聯獲得的免疫原免疫動物，取血，分離血清，純化制得。
2.一種合成喹乙醇人工抗原的方法，該方法包括下列步驟(a)稱取喹乙醇溶于吡啶和DMF混合(1∶1)溶液中，稱取固體光氣(BTC)溶于二氯甲烷中，在冰浴條件下先將少許BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反應幾分鐘后將剩余的BTC溶液全部加入，轉入室溫攪拌反應1小時，得到混合溶液A。稱取載體蛋白溶于弱堿性的硼酸鈉緩沖液中，向其中加入1ml DMF得到載體蛋白溶液B。(b)將溶液A逐滴加于載體蛋白溶液B中，緩慢滴加，半小時內加完，室溫下反應4小時得喹乙醇-載體蛋白偶聯物。
3.權利要求2所述的方法，其中所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。
4.權利要求3所述的方法，其中所述的載體蛋白為牛血清白蛋白，其與喹乙醇之間的偶聯比為1∶10。
5.權利要求3所述的方法，其中所述的載體蛋白為KLH，其與喹乙醇之間的偶聯比為1∶20。
6.一種制備權利要求1所述的多克隆抗體的方法，該方法包括下列步驟a)將權利要求2制備的喹乙醇-載體蛋白偶聯物純化；b)將純化后的喹乙醇-載體蛋白偶聯物與與等量弗氏完全佐劑混合乳化，進行動物初次免疫，再次免疫時以弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，兩次免疫的間隔時間為三周，從第三次免疫開始，每次免疫后10天，取血進行抗體效價監測，最后一次免疫后7天取血，室溫凝固2h后4℃過夜，8000r/min離心10分鐘，分離出全抗血清，進行純化得到所述的多克隆抗體。
7.權利要求6所述的方法，其中所述的偶聯物純化的步驟為過SephadexG-25M凝膠層析層析，柱床體積為25ml，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床體積平衡，調節流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析純化偶聯物，用0.01M PBS(pH 7.4)進行洗脫。
8.權利要求6所述的方法，其中所述的抗體純化為用50％飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33％飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經透析后再用SephadexG-25M層析除去硫酸銨，即得本發明所述的多克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種新的合成喹乙醇(Olaquindox)人工抗原的方法。該方法是將喹乙醇溶解于堿性有機溶劑(DMF、無水吡啶或三丁胺)中，然后用有機溶劑溶解的固體光氣(BTC)與喹乙醇的有機溶劑溶液混合，在適宜的條件下反應適當的時間，將活化的喹乙醇與載體溶液混合，合成喹乙醇的免疫原和包被原。所用的固體光氣比傳統的光氣不揮發，毒性低。本發明屬國際首創。該抗原用于動物免疫，獲得的抗體能用于喹乙醇的快速檢測。
文檔編號G01N33/15GK1887908SQ20061010389
公開日2007年1月3日 申請日期2006年8月8日 優先權日2006年8月8日
發明者楊曙明, 于洪俠 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所