診斷腎病的方法和標志物的制作方法

專利名稱：：診斷腎病的方法和標志物的制作方法診斷腎病的方法和標志物本發明涉及腎病的診斷，特別是鑒別診斷。近年來，腎病患者的數目日益增多。因此，腎病對健康體系造成日益嚴重的問題。由于許多腎病是不可逆轉的，因此腎病的早期診斷和/或鑒別診斷是很重要的。早期診斷和精確適合于每種特定疾病的治療可降低需要透析的患者數目，并且還可以降低患者的高心血管風險。目前，精確診斷和/或鑒別診斷主要依賴腎臟活組織檢查。盡管活組織檢查成為當前腎臟診斷中的"黃金標準"，但是活組織檢查具有侵入性的缺點，因此僅在選定的患者進行。尿分析是診斷腎病的另一種方法。然而，目前僅常規測量幾種尿參數，例如肌酸酐(creatinin)、尿素、白蛋白、血細胞(例如白細胞和紅細胞)、細菌、糖、尿膽素原、膽紅素和pH值。這些分析的診斷價值是有限的，因為它們缺乏足夠的靈敏度和/或選擇性，尤其用于鑒別診斷時。已進行若干嘗試來分析尿中含有的蛋白質。V.Thongboonkerd等使甩二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)與基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質鐠以及其后的質量指紋鐠的組合來研究正常人的尿蛋白質。鑒定了由47種獨特蛋白質的總共67種蛋白質形式(V.Thongboonkerd等(2001).Proteomicanalysisofnormalhumanurinaryproteinsisolatedbyacetoneprecipitationorultracentrifugation.KidneyInternational,第62巻，1461-1469頁)。C.S.Spahr等使用胰蛋白酶消化尿樣中含有的蛋白質并借助液相層析串聯質4鑒定了來自124種蛋白質的751種肽(C.S.Spahr等(2001).Towardsdefiningtheurinaryproteomeusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry.I.Profilinganunfractionatedtrypticdigest.Proteomics第1巻,93-107頁)。這些研究僅涉及健康的個體。所述研究未曾提及尿多肽存在情況的變化是否可用于腎病的診斷或鑒別診斷這一問題。已經提出使用尿中是否存在多肽來診斷膜性腎小球腎炎(membranousglomerulonephritis,MGN)(vonNeuhoff等(2004).MassSpectrometryfortheDetectionofDifferentiallyExpressedProteins:AComparisonofSurface-EnhancedLaserDesorption/TonizationandCapillaryElectrophoresis/MassSpectrometry.RapidCommunicationsinMassSpectrometry,第18巻149-156)。然而，該研究中僅使用了8名患者的樣品，其主要涉及不同分析方法的比較。該標志物的實際診斷價值尚不明確。因此，需要用于腎病診斷、特別是鑒別診斷的快速且簡單的方法和手段。因此，本發明的一個目的是提供用于腎病診斷、特別是用于腎病鑒別診斷的方法和手段。本發明的一個具體目的是提供用于診斷和/或鑒別診斷IgA腎病(最常見的腎小球病)的方法和手段。根據本發明的一個方面，通過將尿樣中至少一種多肽標志物的存在狀況用于腎病診斷(優選鑒別診斷)來解決該問題，其中所述多肽標志物選自表l至22所示的多肽標志物。在本發明中已發現，借助于如表1至22所示的多肽標志物，分別可靠地診斷或鑒別診斷不同腎病是可能的。與本領域的現狀相比，本發明具有許多優勢。首先，可以在尿樣中測定本發明多肽標志物的存在。因此，不需要進行活組織檢查。這樣，本發明允許簡單且快速地診斷腎病，從而可以對患者定期篩查腎病的存在，以及在早期階段診斷腎病。另外，本發明的多肽標志物可用于不同腎病間的鑒別診斷。與僅使用單種或少數標志物相比，本發明中所鑒定的多種標志物使診斷的特異性和靈敏度均得以提高。同時，本發明提供了允許測量所述多肽標志物而無需使用特異性配體(如抗體或適配體)的方法。表中所示的多肽標志物已通過毛細管電泳質鐠(capillaryelectrophoresis國massspectrometry,CE畫MS)法進行鑒定，該方法將在以下進一步描述。另外，該方法詳細描述于vonNeuhoff等(2004)(MassSpectrometryforthe'DetectionofDifferentiallyExpressedProteins:AComparisonofSurface-EnhancedLaserDesorption/IonizationandCapillaryElectrophoresis/MassSpectrometry.RapidCommunicationsinMassSpectrometry,第18巻149-156)。從定義所述多肽標志物的參數開始，有可能通過本領域已知的方法來鑒定相應多肽的序列,然后合成或產生相應的多肽，例如借助于蛋白質合成或者在適當細胞中表達相應的基因。所述標志物通過其質量及其在毛細管電泳(CE)中的遷移時間(特別是質量及其根據實施例1得到的遷移時間)來定義。已知CE遷移時間可以改變，通常在5分鐘范圍內，更通常在3分鐘范圍內。然而，對于所應用的每種CE系統來說，所洗脫標志物的順序通常是相同的或者非常相似。可通過使用存在于幾乎任何尿樣中的多肽來對所述系統進行校準，例如使用表23或24中給出的多肽。另外，SEQIDNO:1至SEQIDNO:5中給出的多肽可用于校準。質量在測量間或不同質譜儀之間的變化相對較小，通常在正負0.05%的范圍內。在表1中，列出了優選用于區分健康個體和患有腎病(特別是患有腎小球腎炎或腎小球病)的個體的多肽標志物。在表2中，列出了優選用于區分FSGS和健康狀態的多肽標志物。在表3中，列出了可用于FSGS和MCD之間鑒別診斷的多肽標志物。在表4中，列出了優選用于FSGS和MGN鑒別診斷的多肽標志物。在表5中，列出了優選用于FSGS以及MCD或MGN之間鑒別診斷的多肽標志物。在表6中，列出了優選用于與健康狀態比較診斷MCD的多肽標志物。在表7中，列出了優選用于MCD和MGN之間鑒別診斷的多肽標志物。在表8中，列出了優選用于MCD以及FSGS或MGN之間鑒別診斷的多肽標志物。在表9中，列出了優選用于與健康狀態比較診斷MGN的多肽標志物。在表10中，列出了優選用于MGN以及FSGS或MCD之間鑒別診斷的多肽標志物。在表ll中，列出了優選用于與健康狀態比較診斷IgA腎病或MGN的多肽標志物。在表12中，列出了優選用于與健康狀態比較診斷IgA腎病的多肽標志物。在表13中，列出了優選用于IgA腎病與MGN之間鑒別診斷的多肽標志物。在表14中，列出了多肽及其各自在健康個體、FSGS患者、MCD患者和MGN患者中的頻率。在表15中，列出了已使用實施例1的支持向量機(supportvectormachine)用于健康個體和腎病患者之間鑒別診斷的多肽。在表16中，列出了已使用實施例1的隨機森林分析(randomforestanalysis)用于健康個體、FSGS患者、MCD患者和MGN患者之間鑒別診斷的多肽。在表17中，列出了已使用實施例1的支持向量機用于MCD和MGN患者之間鑒別診斷的多肽。在表18中，列出了已使用實施例1的支持向量機用于MCD和FSGS患者之間鑒別診斷的多肽。在表19中，列出了已使用實施例1的支持向量機用于MGN和FSGS患者之間鑒別診斷的多肽。在表20和21中，歹'J出了已在上文引用的vonNeuhoff等(2004)中鑒定的多肽。在表22中，列出了可用于診斷糖尿病和/或糖尿病腎病的多肽。在表23中，列出了優選作為內標用于對CE時間進行標準化的多肽。在表24中，列出了在使用實施例1的壓力法(pressuremethod)(0.3~1psi)時作為內標以對CE時間進行標準化的優選多肽。在表25中，列出了腎病患者的臨床數據，所述患者的樣本用于根據實施例1來鑒定多肽標志物。縮寫CsA,環孢菌素A;PS，潑尼松龍；+，頻繁復發；-，當前無免疫抑制；*，在臨床上不清楚是MCD還是FSGS。可以鑒定本發明使用的多肽標志物并可以在尿樣中測量其存在。可使用本領域已知的方法來采集尿樣。優選地，本發明中使用中段尿。本發明使用的多肽標志物可以是基因表達產物，如蛋白質、肽以及蛋白質或肽的片段或其它降解產物。它們可以通過翻譯后修飾進行修飾，例如通過糖基化、磷酸化、烷基化或二硫鍵進行修飾。已知與其來源蛋白質或肽相比，片段和降解產物可以具有不同的診斷價值和/或生理功能。例如，在不同的疾病中可以發現不同的蛋白水解降解產物或片段。如果對尿樣進行預處理以化學修飾尿中含有的多肽標志物并測量這些經化學修飾的多肽標志物，則也認為是在本發明的范圍內。本發明的多肽標志物的分子量為400~20000Da，特別地為700~14000Da，更特別地為800~11000Da。本發明的優選多肽標志物列于表1至22中，特別地在表1至21中，更特別地在表l至13中。用作內標的優選多肽列于表23至24中。還優選列于表l中而不列于表14和/或15和/或16和/或17和/或18和/或19和/或20和/或21和/或22中的多肽標志物。還優選列于表2中而不列于表14和/或15和/或16和/或18中的多肽標志物。還優選列于表3中而不列于表14和/或16和/或18中的多肽標志物。還優選列于表4中而不列于表14和/或16和/或19中的多肽標志物。還優選列于表5中而不列于表14和/或16和/或18和/或19中的多肽標志物。還優選列于表6中而不列于表14和/或16中的多肽標志物。還優選列于表7中而不列于表14和/或16和/或17中的多肽標志物。還優選列于表8中而不列于表14和/或16中的多肽標志物。還優選列于表9中而不列于表14和/或16和/或20和/或21的多肽標志物。還優選列于表10中而不列于表14和/或16中的多肽標志物。還優選列于表ll中而不列于表14和/或16中的多肽標志物。本發明的腎病涉及本領域技術人員已知的任何種類的腎疾病或腎功食fe異常，例如IgA腎病、MGN(membranousglomerulonephritis,膜性腎小球腎炎)、MCD(minimal-changedisease,微小病變)、FSGS(focal-segmentalglomerulosclerosis,局灶性節段性腎小球硬化)或糖尿病腎病。特別地，腎病涉及腎小球病，如IgA腎病、MGN、MCD或FSGS。更特別地，腎病涉及IgA腎病、MCD或FSGS。最特別地，腎病涉及IgA腎病。腎小球病是腎病的一個亞類。腎小球病包括不同病因的若干疾病。腎小球病的特征在于馬爾皮吉體、腎小球和鮑曼嚢的病理形態學變化。由于這些變化，在腎單位和小間隙的其它部分可以出現進一步的病理形態學變化。IgA腎病也叫作貝爾熱腎炎(Berger-Nephritis)。IgA腎病是最常見的腎小球病。它可以是Schoenlein-Henoch紫癜(也叫作過敏性紫癜)的特異性腎臟局限性形式，并伴有IgA血漿濃度的提高。組織病理學情況包括所有形式的腎小球損傷以及腎小球膜中的IgA沉積。在臨床上，IgA腎病表現為鏡下血尿(micro-hematouria)和肉眼血尿(macro-hematouria)。可以嘗試用ACE抑制劑和co-3脂肪酸進行治療.該疾病的發展在若干年的病程中發生，并包括轉變為進行性腎功能不全。MGN的特征在于基底膜變厚以及顆粒狀的上皮下IgG沉積。MGN在40~50歲年齡段開始頻繁發生。它常常由藥物所導致，所述藥物例如金、D-青霉胺或ACE抑制劑。可以嘗試用糖皮質激素或環磷酰胺治療MGN。MGN是腎病綜合征，其向進行性腎功能不全的轉變可能需要數年。MCD也叫作脂性腎病。MCD是兒童中腎病綜合征的最常見原因。該疾病的病因尚不知道。在組織學上，不能發現或僅發現非常離散的變化。MCD的治療可包括用糖皮質激素、環孢菌素A或環磷酰胺進行治療。在兒童中，該疾病在卯％病例中自發痊愈，在成人中，在50%病例中自發痤愈。可能轉變為FSGS。FSGS也叫作IgM腎病。FSGS通常以腎小球膜中IgM和C3的沉積為特征。在臨床上，它表現為腎病綜合征。治療FSGS可包括用糖皮質激素、環孢菌素A或環磷酰胺進行治療。預后是較差的，并包括轉變為進行性腎功能不全。糖尿病腎病也叫作糖尿病性腎小球硬化。糖尿病腎病是需要透析治療的最常見原因。總之，很明顯腎病包括可表現為非常相似的組織學情況的多種疾病。然而，每種疾病的病因、治療和預后可能差別4艮大。例如，IgA腎病需要不同于上述任何其它腎小球病的治療在IgA腎病中，可以嘗試用ACE抑制劑進行治療，這在MGN的病例中并不推薦。因此，快速且可靠的診斷對治療來說非常重要。在本發明中，診斷是指確定個體患者患相應疾病的概率。診斷還可包括證實初步診斷，特別是基于不同方法確定的初步診斷。另外，在一個優選的實施方案中，本發明的診斷特別地涉及"鑒別診斷"。術語"鑒別診斷"涉及區分兩種不同的疾病，即確定與患另一種疾病相比，個體患者患某種疾病的概率。更特別地，本發明的鑒別診斷涉及區分至少兩種選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病之中的腎病。在另一實施方案中，本發明涉及用于鑒別診斷腎病的方法，該方法包括a)測量尿樣中多肽標志物的存在與否，其中所述多肽標志物選自表1至22中所示的多肽標志物，以及b)將該標志物在患病患者中存在的概率與該標志物在對照患者中存在的概率進行比較，其中cl)如果該標志物在患病患者中存在的概率高于該標志物在對照患者中存在的概率，則該標志物的存在指示患該疾病而不是對照狀態的概率較高，或者c2)如果該標志物在患病患者中存在的概率低于該標志物在對照患者中存在的概率，則該標志物的缺乏指示患該疾病而不是對照狀態的概率較高。優選地，步驟b)的各個概率是如表中標明的。本發明的術語"測量，，涉及測定多肽或其它目的物質的存在情況。多肽標志物存在與否的判斷可取決于適當閾值的定義。所述閾值可以通過測量方法的靈敏度來定義，或者它可以隨意定義。本發明中所述的閾值為在注入實施例1的質譜儀中的樣品內為25fmol/nl。然而，當使用其它方法時該閾值可以是相同的。該閾值與典型質鐠儀的檢測閾值一致。該閾值對應于尿樣中約50-5000pmol/1多肽標志物的濃度。如果使用不同的閾值(例如，當使用另一檢測方法時)，相應的概率可以不同，但可由本領域技術人員容易地確定。本發明的"患病患者"患有腎病。特別地，所述疾病為IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病中至少一種。"對照患者"可以是健康的，或者患有不同于所述患病患者的疾病，即所述對照患者可代表健康狀態或者疾病或疾病組。特別地，所代表的疾病為IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病中至少一種。表1至14、16、20、21和22列出了健康的對照患者或者患有某種疾病的對照患者的尿樣中給定多肽標志物存在的概率(也標為"頻率")。區分因子表明存在該疾病的概率與給定對照狀態之間的差異。區分因子可以容易地從各自概率計算得出。區分因子越高，則給定標志物區分疾病與對照狀態的潛力越大。優選區分因子的絕對值為0.40或更高。本領域技術人員能夠自行針對所述多肽標志物建立類似的表格和/或改進該表中含有的數據，例如基于進一步的患者數據和/或根據所述多肽標志物存在的不同閾值進行改進。為了進行診斷，將所述多肽標志物在患病患者中存在的概率與該標志物在對照患者中的存在概率進行比較，其中各概率如表中所標示。如果該標志物在患病患者中的存在概率高于該標志物在對照患者中的存在概率，則所述樣品中該標志物的存在指示該樣品來源的患者患有該疾病而不是對照狀態的概率較高。如果該標志物在患病患者中的存在概率低于該標志物在對照患者中的存在概率，則所述樣品中該標志物的缺乏指示該樣品來源的患者患有該疾病而不是對照狀態的概率較高。例如，給定標志物可能有73%的概率存在于代表IgA腎病的對照中，而有0。/。的概率存在于代表健康狀態的對照中。如果樣品中存在該標志物，則與健康個體相比，所述個體被診斷為有73。/。的概率患IgA腎病。如果樣品中不存在該標志物，則所述個體將診斷為有73%的概率健康而不是患IgA腎病。這樣，可根據本領域技術人員熟知的統計學方法來確定診斷。本發明可僅使用所述多肽標志物之一或者使用多種所述多肽標志物來進行。優選地，測量多種多肽標志物的存在。優選地，測量本發明的至少3種標志物，更優選至少10種所述標志物，更優選至少20種，最優選至少50種所述標志物。本發明的優勢在于它提供了大量合適的標志物。測量多種標志物可以提高診斷的靈敏度和選擇性。因此，如果與其他標志物結合，則在疾病與對照之間顯示低區分因子的標志物也可用于診斷。如果使用多種多肽標志物，則得到包含關于每種被測標志物存在情況的信息的"模式"。然后，可以將該模式與在患病或對照患者中所述多肽標志物存在概率的模式進行比較。每個表代表了在某些患病和對照患者中發現給定多肽標志物的概率的模式。因此，在一個優選的實施方案中，本發明涉及用于腎病鑒別診斷的方法，該方法包括a)建立尿樣中多種多肽標志物存在與否的模式，其中至少一種多肽標志物選自表1至22中所示的多肽標志物，以及b)比較在患病患者中發現該模式的概率與在對照患者中發現該模式的概率，其中cl)如果在患病患者中發現該模式的概率高于在對照患者中發現該模式的概率，則發現該模式指示患有該疾病而不是對照狀態的概率較高，或者c2)如果在患病患者中發現該模式的概率低于在對照患者中發現該模式的概率，則發現該模式指示患有該疾病而不是對照狀態的概率較低。優選地，步驟b)的至少一種多肽標志物的各個概率如表中所示。可根據本領域已知的統計方法將所發現的模式與在患病或對照患者中發現該模式的概率進行比較。優選地，使用自動化方法，例如CART分析、隨機森林分析和支持向量機(SVM，參見例如Xiong.M.，等(2001).Biomarkeridenti打cationbyfeaturewrappers.GenomeResearch第11巻，1878-1887頁)。還可以同時對若干不同模式與發現它們的概率進行比較。因此，所測模式通常與在至少兩種不同的條件下發現該模式的概率進行比較。圖3中顯示根據該方法診斷和鑒別診斷腎病的實例。如果必要的話，在測量多肽標志物前可以對尿樣進行預處理。特別地，可以根據本領域已知的方法從所述樣品中純化脂質、核酸或多肽，所述方法包括過濾、離心或萃取法(如氯仿/苯酚萃取)。可通過本領域已知的任何方法來測量多肽標志物的存在情況。優選的方法包括氣相離子光鐠測定法，如激光解吸/電離質鐠法、表面增強激光解吸/電離飛行時間質鐠法(SELDI-TOFMS)和CE-MS。這些光鐠測定法允許測量所述多肽標志物而不需要配體(如抗體或適配體)。尿樣通常高度復雜，即它們包含許多多肽。在高復雜性的情況下，光鐠分析變得很困難。為了降低樣品的復雜性，可以通過任何適當的方法分離所述樣品中含有的多肽，例如通過電泳分離、基于親和力的分離或者基于離子交換層析的分離來實現。具體的實例包括凝膠電泳、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、毛細管電泳、金屬親和層沖斤、固定化金屬親和層析(IMAC)、基于凝集素的親和層析、液相層析、高壓液相層析(HPLC)以及反相HPLC、陽離子交換層析和選擇性結合表面(如SELDI-TOF中使用的表面，見下文)。2D-PAGE普遍用于多肽分離，并可以與質鐠分析法(MS)組合以鑒定個體多肽。用2D-PAGE可以分辨超過1000個蛋白質點。然而，每個單獨的點必須分別通過MS/MS分析來進行鑒定。當前，SELDI(表面增強激光解吸/電離)飛行時間質鐠應用在許多生物醫學科學領域中。在SELDI系統中，蛋白質芯片陣列(ProteinChipArrays)是最重要的組件。它們是窄的金屬條，在其表面上帶有一排8個或16個點。以靜置滴(standingdrop)或者以多至500pl的體積將待分析樣品直接施加到所述點上，這通過使用稱為"生物處理器"的樣品支架作為支持單位來實現。它們在孵育和洗滌步驟期間置于所述陣列上，之后再次除去。不同類型的陣列屬于兩個主要系列層析陣列(提供疏水的、親水的、陽離子交換的、陰離子交換的或固定化金屬離子的親和表面)和預活化的陣列(帶有化學基團從而允許蛋白質共價偶聯)。優選地，使用具有陽離子交換表面的芯片。因為蛋白質芯片陣列不僅支持樣品而且還特異性地與生物分子相互作用，所以分析物的組成取決于所使用的陣列類型和所使用的洗滌條件。這解釋了為什么SELDI法可以定義為傳統MALDI(基質輔助激光解吸/電離)技術的進一步發展。在SELDI法中，僅測量真正結合芯片表面的多肽。在結合樣品蛋白質后，將能量吸收基質施加到每個點。所述基質迅速結晶，可立即開始分析。將蛋白質芯片陣列置于蛋白質芯片讀取儀中進行分析。所述讀取儀是一種TOF(飛行時間)質鐠儀，其中蛋白質借助于激光束而解吸和電離。由于結晶蛋白質均勻分布在所述點表面上，因此電離激光束總是命中分析物中分子的代表性平均值，這允許進行定量計算。在電離后，通過電場使蛋白質加速以沿飛行管飛行，然后到達檢測器。在激光擊中陣列表面和分子到達飛行管末端的檢測器之間的飛行時間使該系統能夠準確測定所述樣品中存在的蛋白質種類的質量(有關該方法的更加詳細的信息，參見以下綜述MerchantM和WeinbergerSR(2000).Recentadvancementsinsurface-enhancedlaserdesorption/ionization-timeofflightmassspectrometry.Electrophoresis第212巻,1164-1177頁)。然而，最優選的方法是毛細管電泳(CE)與質鐠(MS)偶聯的CE-MS。CE-MS已在別處詳細描述(參見例如德國專利申請DE10021737,以及Kaiser，T.，等,CapillaryElectrophoresiscoupledmassspectrometrytoestablishpolypeptidepatternsindialysisfluids.JChromatogrA，第1013巻，157-171頁(2003))。CE是本領域技術人員已知的。筒言之，將樣品上樣到電泳毛細管上，施加高至50kV(通常高至30kV)的電壓。典型的毛細管是熔融石英毛細管，即包括作為機械支撐并改善機械韌性的外鞘(例如由熱塑性材料制得的鞘)的玻璃毛細管。通常，所述毛細管是未經處理的，即在其內面上具有羥基。然而，毛細管還可以在內側涂有覆層。例如，可使用疏水覆層以改善區分能力。除了電壓以外，還可以施加壓力，其通常為0lpsi。壓力還可以在運行期間施加或提高。為了改善區分能力，當上樣樣品時還可以應用堆積方案在加樣樣品前，加入堿，然后加入樣品，然后加入酸。其原理是在酸和堿之間捕獲分析物離子。如果施加電壓，帶正電的分析物離子向堿移動。在那里，它們帶上負電并沿相反方向向酸移動，在那里它們帶上正電。這種層疊自身重復直到酸和堿中和。然后，從濃縮良好的樣品開始進行分離。所述樣品包含在多肽在其中可溶的適當緩沖液中，例如磷酸緩沖液中。對于CE-MS偶聯來說，優選使用揮發性溶劑并在幾乎無鹽的條件下進行，以避免污染MS。實例包括乙腈、異丙醇、甲醇等。溶劑還可以與水和弱酸(例如0.1%甲酸)組合，后者用于使分析物質子化。樣品中的多肽根據大小和電荷進行分離，它們決定了在毛細管中的運行時間。CE的特征在于高分離能力以及短分析時間。對于隨后的MS分析來說，收集自CE的級分可以作為分開的批次進行分析，或者優選地，CE系統可以通過適當的界面與質譜儀聯用，以允許連續流動分析。或者，可使用來自CE的流來產生連續的"分離軌道"，它可以另外進行分析。在質譜儀中，根據質量/電荷(m/z)比來分析從所述樣品產生的離子。使用質譜分析法，有可能以±0.01%的精確度對10fmol(即0.1ng的10kDa多肽)進行常規分析。在實驗上，對甚至少于O.lfmol也有可能進行分析。可以使用任何類型的質鐠儀。在質鐠儀中，產生離子的裝置與適當的分析儀偶聯。例如，電噴霧電離(ESI)界面最常用于從液體樣品中產生離子，而MALDI最常用于從分別進行處理的樣品中產生離子。有不同種類的分析儀可供使用，例如離子阱分析儀或飛行時間(TOF)分析儀。盡管ESI通常與離子阱組合，而MALDI通常與TOF組合，ESI和MALDI均可以與基本上所有類型的質鐠儀組合。本發明優選的CE-MS方法包括通過ESI與TOF分析儀在線聯用的毛細管電泳。CE-MS技術允許在短時間內在小體積中高靈敏度地同時測量幾百種多肽標志物的存在。一旦測量了所述多肽標志物的存在情況，則得到所測量多肽標志物的模式，并可以通過任何上述方法與疾病模式進行比較。然而，在許多情況下，測量僅一種或有限數目的標志物就足以進行診斷。多肽序列可根據本領域技術人員公知的方法進行測定(參見例如CS.Spahr等(2001).Towardsdefiningtheurinaryproteomeusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry.I.Profilinganunfractionatedtrypticdigest.Proteomics第1巻,93-107頁)。取決于多肽標志物的類型，有可能通過另外的方法測量其存在與否。例如，如果多肽具有生物活性，則可以通過細胞測定或酶測定來確定其存在情況。還可以通過使用與目的多肽結合的配體來確定多肽的存在。本發明的結合包括共價結合和非共價結合。本發明的配體可以是任何肽、多肽、核酸或結合目的多肽的其他物質。熟知的是，如果獲得或純化自人或者動物體，則多肽可能是修飾的，例如通過糖基化進行了修飾。本發明的適當配體也可以通過這樣的位點結合多肽。優選的配體包括抗體、核酸、肽或多肽以及適配體，例如核酸或肽適配體。對于許多多肽來說，合適的配體是市售的。另外，產生適當配體的方法是本領域熟知的。例如，商業供應商也提供合適抗體或適配體的鑒定和產生。本文使用的術語"抗體"包括多克隆抗體和單克隆抗體及其片段，如能夠結合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。優選地，配體應與待測量多肽特異性結合。本發明的"特異性結合"是指配體不會與研究樣品中存在的另一多肽或物質顯著結合("交叉反應")。優選地，所述特異性結合的蛋白質或同工型的結合親合力應高于任何其它相關多肽至少3倍、更優選至少10倍，甚至更優選至少50倍。非特異性結合是可以容忍的，特別是如果所研究的肽或多肽仍可以毫無疑義地進行區別和測量(例如根據其在Western印跡上的大小或者通過其在樣品中相對較高的豐度)時。測量目的多肽存在情況的方法可包括以下步驟(a)將多肽與特異性結合的配體接觸，(b)(任選地)除去未結合配體，(c)測量所結合配體的存在情況或量。可通過本領域已知的任何方法來測量配體的結合。首先，可以直接測量配體的結合，例如通過NMR或表面等離子共振。第二，配體還作為目的肽或多肽的酶活性的底物，可以測量酶促反應的產物(例如，可以通過測量所切割底物的量來測量蛋白酶的存在情況，例如通過Western印跡)。第三，配體可以與允許檢測和測量該配體的標記共價或非共價偶聯。可通過直接或間接的方法進行標記。直接標記包括將標記直接(共價或非共價地)偶聯至配體。間接標記包括將第二配體與第一配體(共價或非共價地)結合。第二配體應該與第一配體特異性結合。所述第二配體可以與適當的標記偶聯和/或是與第二配體結合的第三配體的靶標(受體)。第二、第三甚至更高級別的配體常用于提高信號。合適的第二和更高級別配體可包括抗體、第二抗體和公知的鏈霉抗生物素蛋白-生物素系統(VectorLaboratories,Inc.)。還可以用本領域已知的一種或多種標簽給所述配體或底物"加標簽"。然后，這樣的標簽可以是更高級別配體的靶標。合適的標簽包括生物素、地高辛(digoxygenin)、His標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶、FLAG、GFP、myc標簽、甲型流感病毒血細胞凝集素(HA)、麥芽糖結合蛋白等。在肽或多肽的情形中，標簽優選在N端和/或C端。合適的標簽是可通過適當的檢測法進行檢測的任何標簽。典型的標簽包括金顆粒、膠乳珠、吖啶酯(acridanester)、魯米諾、釕、酶活性標記、放射性標記、磁性標記(例如"磁珠"，包括順磁的和超順磁的標記)以及熒光標記。酶活性標記包括例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、|3-半乳糖苷酶、螢光素酶及其衍生物。檢測的適當底物包括二氨基聯苯胺(DAB)、3,3，-5，5'-四甲基聯苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基四氮唑藍和5-溴-4-氯_3-丐|咮-磷酸，可從RocheDiagnostics以制成的貯液形式獲得)、CDP-StarTM(AmershamBiosciences)、ECFTM(AmershamBiosciences)。適當的酶-底物組合可導致有色的反應產物、熒光或化學發光，它們可以根據本領域已知的方法來測量。典型的熒光標記包括熒光蛋白(如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、Texas紅、熒光素、Alexa染料(例如Alexa568)和量子點。典型的放射性標記包括"S、125I、32P、"P等。因此，本發明的適當測量方法還包括沉淀(尤其是免疫沉淀)、電化學發光(電產生的化學發光)、RIA(放射免疫測定)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、夾層酶免疫測試、電化學發光夾層免疫測定(electrochemiluminescencesandwichimmunoassays，ECLIA)、解離放大鑭系熒光免疫領'J定(dissociation-enhancedlanthanidefluoroimmunoassay,DELFIA)、閃爍迫近效'J定(scintillationproximityassay，SPA)、比濁法(turbidimetry)、濁度測定法(nephdometry)、膠乳放大的比濁法或濁度測定法，或者固相免疫測試。本領域已知的其他方法(如凝膠電泳、2D凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western印跡)可單獨使用或者與上述標記方法或其它檢測方法一起使用。配體也可以存在于陣列上。所述陣列包含可針對目的肽、多肽或核酸的至少一種另外的配體。所述另外的配體還可針對在本發明中無特定意義的肽、多肽或核酸。優選地，所述陣列上包含本發明的至少5種、更優選至少10種、更優選至少20種多肽標志物的配體。根據本發明，術語"陣列"是指固相或凝膠狀的載體，在所述載體上以一維、二維或三維排列附著或結合了至少兩種化合物。這樣的陣列(包括"基因芯片"、"蛋白質芯片"、抗體陣列等)是本領域技術人員公知的，并且通常在玻璃的顯微鏡載玻片上產生，尤其是有涂層的玻璃載玻片，如具有聚陽離子、硝酸纖維素或生物素涂層的載玻片、蓋玻片和膜(例如，基于硝酸纖維素或尼龍的膜)。所述陣列可以包括結合配體或者各表達至少一種配體的至少兩種細胞。還考慮使用"懸浮陣列"作為本發明的陣列(NolanJP,SklarLA.(2002).Suspensionarraytechnology:evolutionoftheflat-arrayparadigm.TrendsBiotechnol.20(1)巻，9-12頁)也在考慮中。在這樣的懸浮陣列中，載體(例如微珠或微球)存在于懸液中。所述陣列由帶有不同配體的不同(可能是標記的)微珠或微球組成。本發明還涉及產生上述陣列的方法，其中除了其它配體以外，至少一種配體還結合在所述栽體材料上。產生這樣的陣列(例如，基于固相化學和光不穩定保護基的陣列)的方法是〉知的(US5,744,305)。這樣的陣列還可以接觸物質或物質文庫并測試相互作用，例如結合或構象改變。因此，包含本發明的多肽標志物的陣列可用于鑒定特異性結合所述肽或多肽的配體。為了確定多肽的序列，應將其純化至可實現的最高水平。然而，不需要完全分離所述多肽。例如，使多肽可作為聚丙烯酰胺凝膠中的考馬斯染色條帶進行檢測就足夠了。然后，可以切出相應的凝膠條并用于接下來的鑒定步驟。在對多肽進行純化后，可以用胰蛋白酶對其進行酶促消化，并且使用任何適當的方法(例如質鐠法)測定所得片段的分子量。使用質i普法時，每種多肽顯示片段的特征性"指紋"，這允許通過數據庫檢索對其進行鑒定。如果待鑒定多肽不存在于數據庫中，或者如果研究者出于任何原因想要更進一步的表征，還可以根據本領域已知的方法對所述多肽片段進行測序。CE-MS使測定多肽序列變得特別容易。每種標志物的毛細管電泳洗脫時間列于表中。因此，可以以相對高的純度收集包含所述多肽的級分。如果單個級分包含的材料不足，可以合并多于一個實驗的級分。一些多肽標志物的序列列于SEQID:l至5中。它們的質量通過CE-MS來測量，其各自的序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>圖1將來自CE-MS粗分析的信息(A)描繪為三維輪廓曲線(左側)。這里顯示了來自健康志愿者尿的輪廊曲線，Y軸為質荷比，X軸為以分鐘計的保留時間，將信號強度用顏色進行編碼。然后，計算信噪比并除去噪擾，這樣僅剩下實際的信號(B)。軟件基于同位素分布和共軛質量(conjugatedmass)來計算實際質量(C)。這得到多達1500種多肽的通過其質量和保留時間來定義的表格。舉例來說，右下方顯示在所述樣品中發現的17種多肽。CE-t，CE時間(遷移時間)；int.,強度5m.p.c，質荷比；cal.m.,計算質量。圖2顯示了健康受試者(NC)和患有局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)、微小病變(MCD)和膜性腎小球腎炎(MGN)的患者的多肽(實際質量)輪廓曲線。每個曲線的質量上限(即沿X軸的最大值)標在每個曲線的左上方。如所示，健康受試者與腎病組之間的輪廓曲線具有顯著差異。圖3診斷和鑒別診斷腎病的流程圖(舉例)。Samp.，樣品；MS-dat.，MS-lt據；Disea.，疾病；Y，是；N，否；n.d.,無疾病；d.n.，糖尿病腎病，FSGS，FSGS;MGN,MGN;MCD,MCD;IgA，IgA腎病，diff.，鑒別診斷。通過以下實施例進一步說明本發明。實施例1參與者在當地的倫理委員會批準后，取得所有參與者的知情同意。我們使用CE-MS檢查57名具有正常腎功能的健康個體，以建立正常尿蛋白模式。另外，我們研究了活組織檢查證實為患有微小病變(n=16;MCD)、膜性腎小球腎炎(11=18;MGN)和局灶性節段性腎小球硬化(n=10;FSGS)的44名患者(表l)。CE-MS分析在早晨第一次排尿后，從所有參與者收集隨機尿樣。樣品制備在別處詳細描述(WittkeS,FliserD,HaubitzM等DeterminationofpeptidesandproteinsinhumanurinewithCE-MS畫suitabletoolfortheestablishmentofnewdiagnosticmarkers./C7^附"togrA1013:173-181,2003)。如前述建立CE-MS分析(KaiserT，HermannA，KielsteinJT等CapillaryElectrophoresiscoupledmassspectrometrytoestablishpolypeptidepatternsindialysisfluids./C7in畫togrA1013:157-171,2003)，4吏用與MarinerTOF質鐠^R(ABI腺用的BeckmanCoulterPAC/E系統。CE毛細管來自Beckman，ID/OD75/360pm，長度為卯cm。所使用流動相包含水中30%的甲醇和0.5%甲酸。同樣的液體用于以2pl/分鐘來應用的鞘流。使用壓力進行樣品注入lpsi20秒。在這些條件下，可注入約100nl樣品。對于樣品層疊，應用以下方案注入1MNH37秒，注入樣品，注入2M甲酸5秒。在+30kV下使用以下壓力順序運行隨后的CE畫MS:0psi40分鐘，0.1psi2分鐘，0.2psi2分鐘，0.3psi2分鐘，0.4psi2分鐘，0.5psi80分鐘。對于IgA腎病的診斷，4吏用以下壓力順序0.3psi40分鐘，0.4psi2分鐘，0.6psi2分鐘，0.8psi2^^鐘，1psi80分鐘。在每次運行后，用0.1MNaOH洗滌CE毛細管5分鐘，然后用水洗滌5分鐘并且用運行緩沖液洗滌5分鐘。統計學分析為了區分健康個體和患有腎病的不同組患者，我們使用隨機森林法以及相應的S-Plus程序版本6/2002BreimanL:隨機森林。(http:〃oz.berkeley.edu/users/breiman/randomforest2001.pdf)。在該方法中，從所有候選PP中隨機選擇固定大小的一系列PP亞組。對于每個亞組來i兌，如分類和回歸樹(ClassificationandRegressionTree,CART)分析中所述產生分類樹(SteinbergD，CollaP:CART-ClassificationandRegressiontrees.SanDiego,CA,SalfordSystems1997)，得到分類規則。森林預測是一系列分類規則的非加權分類結果。由于大量的亞組選擇，因此不產生過擬合。由于"泄露(outofbag，oob)"估計法所致，估計的推廣誤差(generalisationerror)是無偏的每個分類樹形成于學習樣品病例的自助法樣本，有效性基于那些自助法樣本中未選擇的病例來進行估計。另外，還使用支持向量機進行組之間的區分。該工具具有在高維參數空間中區分數據的優勢。其快速且穩定的算法在評估臨床標志物(DieterleF,Muller畫HagedornS,LiebichHM,GauglitzG:Urinarynucleosidesaspotentialtumormarkersevaluatedbylearningvectorquantization.M^/28:265-279,2003)以及不同的生物分沖斤領域如DNA陣列(BrownMP,GrundyWN，LinD等Knowledge-basedanalysisofmicroarraygeneexpressiondatabyusingsupportvectormachines.iVocA^/爿oirf5WUSA97:262-267,2000)中顯示出良好性能。用CE-MS分析的正常尿多Jlb漠式圖1中顯示典型樣品的圖示(輪廓曲線)(原始數據)。在一個個體樣品中，檢測分子量為800直至30,000道爾頓的卯0~2500種PP。在CE所使用的條件下，較高分子量的多肽易于沉淀。因此，通常檢測不到較大的蛋白質，盡管可以觀察到某些蛋白質(例如，白蛋白)。表23中顯示選作內標以保證樣品可比性的以高概率存在多肽的列表。為了分析富含蛋白質的樣品(如來自疑似IgA腎病患者的樣品)，施加較高的壓力并優選表24的多肽作為內標。在針對單獨樣品的同樣CE-MS運行M下，重復分析同樣的樣品^現出任何顯著差異。圖1中總結了針對一個實例的后續電子數據處理。每次運行得到示于圖1上部的原始光鐠，由每3秒產生的單個光鐠組成(放大圖1)。在第一次數據分析中鑒定CE-MS峰(圖1A)。然后，使用同位素分布和共輒峰來確定每個峰的電荷(圖1B)。由此，將共輒峰概括在一個單峰中并計算實際質量，如圖1C所示。首先，用已知質量的外標對樣品加標。這允許隨后定義所i^樣中以高概率存在的PP的內標。這樣，CE時間可以對內標進行歸一化。通過將該技術應用于一般的尿樣，可檢測大概1000種PP并通過兩個參數(質量和CE遷移時間)進行描^/鑒定。檢查得自健康受試者的尿建立了由所檢測PP的實際質量和CE時間來定義的峰(所謂峰列表)以及針對每個個體的輪廓曲線。將所述個體峰列表存儲在MS-Access數據庫中，并計算單個樣品中出現每種PP的概率。173種PP存在于超過卯。/。的所檢查對照樣品中。另外，156種PP存在于超過75%的樣品中，而另外的361種PP可見于超過50%的來自健康個體的樣品中。這690種PP可見于得自健康受試者的所有樣品中的50%以上，并用于建立"正常的PP模式"。使用CE-MS來分析自腎病患者的尿將來自各自運行的44名患者的數據分成3個疾病組并進行分才斤。隨后將來自這些數據庫的代表典型PP模式的數值進行比較。在組內部發現來自每個患者組的尿樣的蛋白質模式具有顯著的同源性。圖2中顯示來自MCD、FSGS和MGN患者的尿PP模式的典型實例。每種疾病具有典型的蛋白質輪廓曲線，其顯示超過500種PP。隨后，將來自這3組的數據與在健康受試者中獲得的數據進行比較。表16顯示在超過95%的健康受試者的尿中發現的124種PP，并顯示出與MCD、FSGS和MGN患者的差異。應用了使用CE-MS數據進行的區分健康個體與腎病患者的統計學分析。選擇在任一疾病組中超過50%概率的800種PP用于隨機森林分析。區分健康受試者和腎病患者的正確分類率為96.5%，如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在交叉!Hi之后，可獲得81.3%的靈敏度和94.3%的特異性。在學習樣品中實現對所述疾病組的區分。然而，很可能由于fsgs患者較少所致，當應用交叉驗證時它們不能夠區分mcd。因此，將fsgs和mcd合為一組。為了區分健康受試者、mcd/fsgs和mgn，通過cart從列表選擇4種pp以建立具有5個終端節點的分類樹(表15)。學習樣品中的正確分類率為94.1%.。在交叉^iit之后，它降低為84.3%(健康對照93.8%,mcd/fsgs:71.4%,以及mgn:92.9%)。或者，使用支持向量機針對同樣的數據進行統計學分析；表16顯示該分析中使用的pp。使用這些pp時，在完整的交叉驗證后正確分類為98.0%。表17描述了用于區分mcd和mgn的pp。此時，在完整的交叉驗證后正確分類為94.1%。另外，可以將mcd和fsgs的患者以及mgn和fsgs的患者分開，(經交叉驗證的)分類率分別為92.3%和89.3%(表18和19)。這些結果可以認為是使用支持向量機分類有限數目的患者的第一步。隨著患者數據的增加，該分類將進一步改善并變得更加穩定。所述結果還表明，對于穩定的分類來說，可用變量(多肽)的數目取決于病例(患者)的數目，因此患者的增加將允許將更多的pp用于分類。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表14:<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>權利要求1.尿樣中至少一種多肽標志物的存在情況用于診斷腎病的用途，其中所述多肽標志物選自如表1至22所示的多肽標志物。2.根據權利要求l的用途，其中所述腎病選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病。3.根據權利要求l的用途，其中所述腎病是IgA腎病。4.根據權利要求1的用途，其中診斷涉及對選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病之中的至少兩種疾病進行鑒別診斷。5.根據權利要求l的用途，其中所述多肽標志物選自如表l至13所示的多肽標志物。6.根據權利要求3的用途，其中所述多肽標志物選自如表ll至13所示的多肽標志物。7.用于診斷腎病的方法，該方法包括a)測量尿樣中多肽標志物的存在與否，其中所述多肽標志物選自如表1至22所示的多肽標志物，以及b)將該標志物在患病患者中存在的概率與該標志物在對照患者中存在的概率進行比較，其中cl)如果該標志物在患病患者中存在的概率高于該標志物在對照患者中存在的概率，則該標志物的存在指示患有該疾病而不是對照狀態的概率較高，或者c2)如果該標志物在患病患者中存在的概率低于該標志物在對照患者中存在的概率，則該標志物的缺乏指示患有該疾病而不是對照狀態的概率較高。8.根據權利要求7的方法，其中步驟b)的各個概率如表中所示。9.根據權利要求7的方法，其中所述對照代表健康狀態。10.根據權利要求7的方法，其中所述對照代表腎病，特別地選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病。11.根據權利要求7的方法，其中所述多肽標志物選自如表11至13所示的多肽標志物。12.根據權利要求7的方法，其中所述方法包括檢測多種所述多肽標志物，優選至少3種、更優選至少10種、最優選至少50種所述多肽標志物。13.根據權利要求7的方法，其中使用ELISA、定量Western印跡、放射免疫測定、表面等離子共振、陣列、凝膠電泳、毛細管電泳、氣相離子光鐠法或質i普法來檢測所述標志物的存在情況。14.根據權利要求7的方法，其中在測量前通過毛細管電泳對所述樣品中的多肽標志物進行分離。15.根據權利要求14的方法，其中使用質譜分析法來檢測所述標志物的存在情況。16.毛細管電泳-質鐠法用于在體外對腎病進旨斷、尤其是進行鑒別診斷的用途。17.根據權利要求16的用途，其中所述腎病選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病。18.毛細管電泳-質鐠法用于對選自IgA腎病、MGN、MCD、FSGS和糖尿病腎病之中的至少兩種腎病進行鑒別診斷的用途。全文摘要本發明涉及用于診斷腎病的方法，尤其是鑒別診斷的方法。本發明中的目標腎病是IgA腎病、膜性腎小球腎炎(MGN)、微小病變(MCD)、局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)和糖尿病腎病。文檔編號G01N33/68GK101361001SQ200680051401公開日2009年2月4日申請日期2006年1月20日優先權日2006年1月20日發明者哈拉爾德·米沙克,托爾斯滕·凱澤,斯特凡·維特克,邁克爾·沃爾登申請人:馬賽奎斯診斷和治療有限公司