專利名稱：對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物及其制備方法
技術領域：
本發明屬于有機雜環化合物合成技術領域，涉及對-異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物及其制備方法以及該螯合物作為均相時間分辨熒光免疫分析試劑用于免疫分析的應用。
背景技術：
時間分辨熒光免疫分析法以其靈敏度高、快速、自動化分析儀器的使用及技術的發展使這一分析法得到迅速的發展和廣泛的應用。該方法是以鑭系元素為標記物，用來標記抗體(或抗原)、寡核苷酸、生物大分子、靶細胞等，然后進行抗原抗體的免疫反應生成免疫復合物，或進行核酸雜交分析、檢測DNA序列等，其原理是鑭系離子如銪、釤、鋱、鏑等與具有紫外吸收的配基螯合，受某一波段的紫外光激發后，配基能將激發態能轉移給鑭系離子，發射強度高且壽命長的熒光光譜，不同的元素具有不同的熒光光譜且譜線窄。而且激發光(300-350nm)與所要測量的發射光譜(490-643nm)之間有很長的Stokes位移，發射的熒光壽命長(從微秒到毫秒級)，所以用其作標記物通過光譜分辨和時間分辨，待本底熒光(納秒級)淬滅后再進行標記物或標記物復合物的熒光測量，用作微量生物活性物的測量大大提高了靈敏度。
近年來，國內外文獻大量的報道了時間分辨熒光分析的研究進展并對1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷的衍生物作為核磁共振顯像造影劑和放射性藥物的潛在配體已進行了廣泛的研究。但是將其衍生物與鑭系元素螯合作為時間分辨熒光免疫分析試劑尚未見有研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種全新的對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物，它是鋼性穴狀化合物，可螯合銪、釤、鋱等鑭系元素形成鏊合物。
本發明的另一個目的在于公開了對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合劑的制備方法。
本發明的再一個目的在于公開了對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸鑭系元素螯合物用來標記抗體(或抗原)進行熒光免疫分析，遺傳學診斷，各種病原體診斷，癌基因、抑癌基因的檢出等，還可標記DNA做成探針進行基因診斷、酶分析、受體分析等等。
發明的技術方案如下 具有下述結構的對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+ 本發明所述螯合物的制備方法，其特征在于， (1)化合物III與化合物V進行成環縮合反應，制得化合物VI；
(2)將化合物VI水解制得化合物VII； (3)在有機溶劑中，將化合物VII與對氟硝基苯進行取代反應，制得化合物VIII；所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、吡啶、DMF、乙腈、氯仿等等。
(4)化合物VIII與溴乙酸反應，制得化合物IX。
(5)化合物IX與R螯合，得到螯合物X；其中R為銪、釤、鋱或鏑離子。
(6)化合物X還原制得化合物XI。
(7)化合物X與硫代光氣反應，得到化合物I。
本發明所述的對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物的制備方法其中化合物VII與對氟硝基苯的摩爾比為1∶0.2-0.5mol反應溫度50-80℃，反應時間6-8小時。
其中化合物VIII溴乙酸的摩爾比為1∶4-6，反應溫度30-60℃，反應時間4-8小時。
其中化合物IX還原所用還原劑為5-10％Pd/C，化合物IX與還原劑的摩爾比為1∶0.03-0.06mol，反應溫度15-30℃，反應時間3-5小時。
其中化合物X與硫代光氣的摩爾比為1∶3-5，反應溫度20-30℃，反應時間1-3小時。
本發明所述的1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸，其制備方法中對現有文獻方法做了一定的改進 參考文獻①EUR.J.MED.CHIM.THER.1984.19(5)42；②Inors.Chem.1991.302092；③CN 1225461C；具體如下 1)生成N，N′，N″-三對甲苯磺酰二乙烯三胺，反應溫度20-35℃，反應時間2-5小時，重結晶溶劑甲醇或乙醇。
2)生成的N，N′-二對甲苯磺酰羥乙基-N，N′-二對甲苯磺酰乙二胺，反應溫度-5-5℃，反應時間1-3小時，重結晶溶劑甲醇或乙醇。
3)N，N′，N″-三對甲苯磺酰二乙烯三胺可和甲醇鈉(乙醇鈉)或NaH成鹽。4)1，4，7，10，13-五對甲苯磺酰五氮雜環十五烷反應溫度100-120℃，反應時間3-5小時。
本發明的對-異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合劑的合成路線如下
本發明進一步公開了對-異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物作為在制備用于時間分辨熒光免疫分析方面的應用。特別是在標記抗體或抗原進行熒光免疫分析方面的應用。具有代表意義的螯合物為對-異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸銪。用此螯合劑標記抗體(或抗原)用于時間分辨熒光免疫分析，檢測激素，癌標志物，或用于標記寡核苷酸，進行基因診斷等等。
具體實施例方式 為了更充分的解釋本發明的實施，提供下述對-異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合劑制備實施實例。典型的是對-異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸銪螯合物制備方法，這些實施實例僅僅是解釋、而不是限制本發明的范圍。
下面是對異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸銪螯合物的合成路線
參考實施例 實施例1 N，N’-二對甲苯磺酰羥乙基-N，N’-二對甲苯磺酰乙二胺(化合物III) 77g(0.4mol)對甲苯磺酰氯在100ml吡啶中，劇烈攪拌下，滴加14.8g(0.1mol)N，N’-二(2-羥乙基)乙二胺在200ml吡啶中的溶液，滴畢室溫攪拌3小時。將溶液倒入250ml冰和250ml濃鹽酸中過濾，水洗，乙醇重結晶，得淡黃色晶體，mp99-100℃(70％)。
實施例2 N，N’，N”-三對甲苯磺酰二乙三胺(化合物IV) 10.3g(0.1mol)二乙烯三胺加106ml(0.4mol)氫氧化鈉溶液中，在劇烈攪拌下，0℃滴加57.1g(0.3mol)對甲苯磺酰氯在375ml的乙醚溶液，加畢，繼續攪拌1小時，過濾得粗品，用乙醇重結晶，mp200-202℃(60％) 實施例3 N，N’，N”-三對甲苯磺酰二乙三胺二鈉鹽(化合物V) 56.4g(0.1mol)化合物2加到13.6g(0.2mol)乙醇鈉在150ml無水乙醇溶液80℃加熱1小時，減壓除去溶劑，真空干燥得到產品。
制備實施例 實施例1 1，4，7，10，13-五對甲苯磺酰基五氮雜環十五烷(化合物VI) 先加入100ml DMF，然后通氮氣，100℃加熱，攪拌下緩慢同時滴加76.4g(0.1mol)化合物III在200ml DMF的溶液和61g(0.1mol)化合物V在200ml DMF的溶液，滴畢，棕色反應液在100-110℃反應3小時。冷卻，攪拌下，倒入水中，濾出沉淀，水洗，醇洗，用乙醇重結晶得白色晶體mp289-290℃(文獻290-291℃，278-280℃)(65％)。
實施例2 1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷(化合物VII) 2.0g(2.03mmol)化合物VI和10ml98％濃硫酸混合，通氮氣，在180℃加熱攪拌，水解反應4-5小時，得棕灰色液體。冰水冷卻下緩慢從滴液漏斗加入50ml乙醚，灰色沉淀很快過濾立即用乙醚洗，然后溶解在20ml水中，用過量NaOH片堿，調成pH 8左右，用CHCl3提取，除去溶劑得到白色結晶，乙醚重結晶，得到結晶mp90-91℃(文獻100-102℃)(80％)。
1HNMR，δ2.774(s，20H，CH2)；1.829(s，5H，NH)。
實施例3 1’-對硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷(化合物VIII) 43.82g(0.20mol)化合物VII溶解在500ml乙腈中，60℃攪拌加50ml水，然后該溶液滴加到對氟硝基苯(7.66g，0.054mol)的50ml乙腈溶液，60℃反應8小時，過濾，粗品溶于1升沸水中，得到的溶液用水稀釋1∶1上柱(
XAO1600)用水洗去未反應的原料，用甲醇洗脫，除去甲醇得產品。mp170-172℃，(收率73.1％)。
實施例4(與銪離子螯合) 1-對硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸(化合物IX) 29.64g(0.21mol)溴乙酸攪拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH調PH＝10，在50℃條件下反應6小時，冷卻，過濾，濾液用鹽酸調PH＝3，再用水1∶1稀釋后上柱(
XAO1600)，用水洗去未反應的原料，用甲醇洗，蒸干得到的產品與10.32g(0.04mol)EuCl3在pH為6的醋酸緩沖溶液中螯合得到相應的銪螯合物。
實施例5 1-對氨基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸(化合物X) 11.39g(0.02mol)化合物X的50ml水溶液中，加入5％Pd/C 0.7g室溫催化氫化，大約4小時，過濾，濾液濃縮得到粗品，不需純化，直接進行下步反應。
實施例6 1-對異硫氰基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸(化合物I) 對氨基苯基化合物(化合物X)4.13g(6mmol)溶于50ml水中，加NaHCO3至pH8.5，室溫滴加CSCl2(硫代光氣)1.07g(9mmol)的氯仿溶液20ml，滴畢，室溫攪拌2h。分去CHCl3層，水層用CHCl3提取后，合并有機層，減壓蒸去CHCl3，殘渣(含產品)用半制備高壓液相C18柱分離，收集相應的部分，減壓濃縮至干，即得到最終對異硫氰基銪螯合物。
1H NMR(D2O)δ＝7.15(d，2H)，6.7(d，2H)，3.6(s，4H)，3.4(s，4H)，3.3(s，2H)，3.27(s，8H)，3.1(s，4H)。
實施例7 1-對硝基苯基1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸(化合物IX) 表1鑭系元素 29.64g(0.21mol)溴乙酸攪拌下加到13.41g(0.04mol)化合物VIII在50ml水中的溶液，用2NNaOH調pH＝10，在50℃條件下反應6小時，冷卻，過濾，濾液用鹽酸調pH＝3，再用水1∶1稀釋后上柱(
XAO1600)，用水洗去未反應的原料，用甲醇洗，蒸干得產品與表1的鑭系元素在pH為6的醋酸緩沖液中螯合得到相應的鑭系元素螯合物。
權利要求
1、具有下述結構的對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物
其中R＝Eu3+，Sm3+，Tb3+，In3+I。
2、權利要求1所述螯合物的制備方法，其特征在于，
(1)化合物III與化合物V進行成環縮合反應，制得化合物VI；
(2)將化合物VI水解制得化合物VII；
(3)在有機溶劑中，將化合物VII與對氟硝基苯進行取代反應，制得化合物VIII；
(4)化合物VIII與溴乙酸反應，制得化合物IX；
(5)化合物IX與R螯合，得到螯合物X；
(6)化合物X還原制得化合物XI；
其中R為銪、釤、鋱或鏑離子；
(7)化合物X與硫代光氣反應，得到化合物I。
3、如權利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物VII與對氟硝基苯的摩爾比為1∶0.2-0.5mol；反應溫度50-80℃，反應時間6-8小時。
4、如權利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物VIII∶溴乙酸的摩爾比為1∶4-6mol，反應溫度30-60℃，反應時間4-8小時。
5、如權利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物IX還原所用還原劑為5-10％Pd/C，化合物IX與還原劑的摩爾比為1∶0.03-0.06mol，反應溫度15-30℃，反應時間3-5小時。
6、如權利要求2所述螯合物的制備方法，其中化合物X與硫代光氣的摩爾比為1∶3-5mol，反應溫度20-30℃，反應時間1-3小時。
7、權利要求1所述螯合物在制備用于時間分辨熒光免疫分析方面的應用。
8、權利要求1所述螯合物在標記抗體或抗原進行熒光免疫分析方面的應用。
9、如權利要求8所述螯合物，其特征在于所述螯合物為對異硫氰基苯基-1，4，7，10，13-五氮雜環十五烷四乙酸銪螯合物。
全文摘要
本發明涉及異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物及其制備方法，其中包括縮合、水解、取代反應，生成物與溴乙酸縮合，再和鑭系元素螯合得到對硝基苯基五氮雜環四乙酸，再經5％Pd/C還原，最后和硫代光氣反應，得到目標化合物I。本發明的對異硫氰基苯基五氮雜環四乙酸螯合物為未知化合物，形成的鋼性穴狀化合物和銪、銦、釤、鋱等鑭系元素螯合，經元素分析、紅外光譜、紫外光譜、核磁及質譜確定其結構，所制備的螯合物主要用做時間分辨熒光免疫分析。
文檔編號G01N33/52GK101348468SQ200710058139
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月16日 優先權日2007年7月16日
發明者施培基, 王榮先, 浩 王, 李美佳, 周曉靚, 傅榕賡, 鵬 尹, 黃海舟, 呂茜茜 申請人:中國醫學科學院放射醫學研究所