用于結直腸癌的生物標志物組合的制作方法

專利名稱：用于結直腸癌的生物標志物組合的制作方法
技術領域：
本發明總體涉及與實體瘤相關的外周血替代性(surrogate)生物標志物譜及其使用方法，用于結直腸癌的篩選、預防、診斷、治療、監測和預后。
背景技術：
對于癌癥的早期檢測和管控來說，篩選和監測測定是非常重要的。癌癥篩選和監 測測試，如在醫療環境中采集的血液測試，可以用于大規模篩選臨床上健康(或“無癥狀”) 的個體，以便用于對對象進行診斷、預測測試或疾病監測。對于該類應用，基于血液的終端(remote)樣品的優點在于方便對象提供樣品，因 此測試人群的依從性高得多。在結直腸癌的情況下，只篩選出少于20%的處于風險中的對 象，這主要是因不舒服和侵入性的篩選方法(如結腸鏡檢查術)所引起的心理障礙所致。因此，本領域需要能夠早期檢測和治療實體瘤(如結直腸癌)并且具有成本合算、 快速并且侵入性極小(優選無侵入性)等附加有益效果的方法。附加的效用使得能夠進行 癌癥預后、監測對象的癌癥治療和檢測癌癥復發以及發現用于治療癌癥(如實體瘤)的新 型治療性干預。

發明內容
本發明的前提是如下的發現在出現明顯的疾病之前的很長時間內就能鑒別出血 清或其它體液中疾病相關的生物標志物。可以將患有結直腸癌的患者血清足跡中是否存在 這些生物標志物用作早期診斷工具，并且為這些患者設計治療策略并施用以預防、延緩、改 善或逆轉結直腸腫瘤細胞的形成。本發明中的一種或幾種疾病相關的生物標志物可以用于 診斷患有結直腸癌的對象，或者有利地，用于診斷無結直腸癌癥狀的那些對象。因此，本發明涉及生物標志物譜以及分析多種外周血替代性生物標志物的方法， 所述生物標志物與實體瘤(特別是與結直腸癌有關的實體瘤)有關。這些生物標志物可用 于實體瘤的遺傳測試，包括對實體瘤的遺傳易感因素、實體瘤的早期檢測、實體瘤的診斷、 癌性組織分型檢測及其其它使用方法。本發明公開的方法、試劑盒和生物標志物譜設計用于篩選結直腸癌，優選敏感性 等于或高于70%并且特異性等于或高于95%。所公開的方法還能夠定量實體瘤相關的靶 基因和/或基因產品的相對和絕對量。總之，本發明的方法和生物標志物譜可用于獲得樣品中與實體瘤相關的多種不同 基因表達的定量信息，所述樣品可以包括外周血并可僅含有單個細胞。在一種實施方式中，癌癥包括結直腸癌。可以用電泳法或免疫化學法測量生物標 志物的水平，其中所述免疫化學檢測可以通過放射免疫測定、免疫熒光測定或通過酶聯免 疫吸附測定實現。優選地，通過實時PCR測量生物標志物的水平。來源于對象的樣品可以包括例如，全血、血清、血漿、血細胞、內皮細胞、組織活 檢、淋巴液、腹水、間質液、骨髓、腦脊液(CSF)、唾液、粘液、痰液、汗液或尿液。
因此，本發明提供在對象中診斷或鑒定為結直腸癌的方法，其包括測量對象樣品 中的一種或多種CLRMARKER或其代謝物的有效量；將所述量與參考值相比較，其中所述一 種或多種CLRMARKER的量相對于參考值的增加或減少表明對象患有結直腸癌。參考值可以 包括指標值(index value)、來源于一種或多種結直腸癌風險預測算法或計算指數的值、來 源于未患結直腸癌的對象的值或來源于診斷患有或鑒定為患有結直腸癌的對象的值。在一 些實施方式中，對象包括之前診斷患有結直腸癌者、之前未診斷患有結直腸癌者或無結直 腸癌癥狀者。本發明還提供監測對象結直腸癌進展的方法，其包括在第一時間段測量來自對 象的第一樣品中的一種或多種CLRMARKER的有效量；在第二時間段測量來自對象的第二樣 品中的一種或多 種CLRMAEKER的有效量；將步驟(a)中檢測的一種或多種CLMARKER的量與 步驟(b)中檢測的量或與參考值相比較。在一種實施方式中，監測包括評價發展結直腸癌 的風險的變化。對象可以包括之前進行過結直腸癌治療者、之前未進行過結直腸癌治療者、 或之前未診斷患有或未鑒定為患有結直腸癌者。在某些實施方式中，第一樣品取自進行結 直腸癌治療前的對象，第二樣品取自結直腸癌治療后的對象。在其它實施方式中，監測還包 括為對象選擇治療方案和/或監測結直腸癌治療方案的有效性，所述治療方案可以包括外 科手術、結直腸癌調節劑或它們的組合。在一些實施方式中，參考值可以包括指標值、來源 于一種或多種結直腸癌風險預測算法或計算指數的值、來源于未患結直腸癌的對象的值、 或來源于診斷患有或鑒定為患有結直腸癌的對象的值。另一方面，本發明提供治療診斷患有或鑒定為患有結直腸癌的對象的方法，其包 括在第一時間段測量來自對象的第一樣品中存在的一種或多種CLRMARKER或其代謝物的 有效量；用一種或多種結直腸癌調節劑治療對象直至所述一種或多種CLRMARKER或其代謝 物的量回復至在發展結直腸癌風險低的一個或多個患者中所測量的參考值，或回復至在由 于用一種或多種結直腸癌調節劑治療而表現出結直腸癌風險因素改善的一個或多個對象 中所測量的參考值。一種或多種結直腸癌調節劑可以包括烷化劑、抗生素劑、抗代謝劑、激素藥劑、植 物源藥劑、類視黃醇藥劑、酪氨酸激酶抑制劑、生物制劑、基因治療劑、組蛋白去乙酰化酶抑 制劑、其它抗癌藥劑或它們的組合。由于用一種或多種結直腸癌調節劑治療而引起結直腸 癌風險因素的改善可以包括息肉形成減少、息肉尺寸減小、息肉數目減少，以及潰瘍性結 腸炎、炎癥性腸病和/或克羅恩病癥狀的減輕或它們的組合。本發明還提供試劑盒，其包含檢測一種或多種CLRMARKER的CLRMARKER檢測試劑、 來源于具有正常對照水平的對象的樣品、以及任選地用于說明如何使用本發明方法中的試 劑的說明書。在一種實施方式中，所述檢測試劑還包括一種或多種抗體或抗體片段、一種 或多種適體、一種或多種寡核苷酸或它們的組合。除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域普 通技術人員通常所理解的含義相同。盡管與本文所述的那些相似或等同的方法或材料可以 用于本發明的實踐，但是下文中說明了適合的方法和材料。本文所提到的所有出版物、專利 申請、專利和其它參考文獻全部清楚地以引用方式并入。在矛盾的情況下，本說明書(包括 定義)占主導。此外，本文所述的材料、方法和實施例僅為示例而不旨在限制。本發明的其它特征和優勢將因下面的具體實施方式
和權利要求而顯而易見。
附圖簡述下列發明詳述是以舉例方式進行，但不旨在將本發明限制在所述的具體實施方式
中，可以結合以參考形式引入本文的附圖進行理解，其中

圖1A-1E提供了根據對應于對照(CON)、炎癥性腸病(IBD)、晚期息肉/腺瘤(POL) 和癌(CAR)的樣品類別所示出的多幅基因分布圖。 圖2示出了 CON組與POL組和CAR組之間相比較，CLRMARKERESM1的單基因ROC曲 線的類別區分能力。圖3示出了 CON組與POL組之間相比較，CLRMARKER ESMl的單基因ROC曲線的類 別區分能力。圖4示出了 CON組與CAR組之間相比較，CLRMARKER CK20的單基因ROC曲線的類 別區分能力。圖5示出了 CON組和IBD組與POL組和CAR組之間相比較，CLRMARKER ESMl的單 基因ROC曲線的類別區分能力。圖6示出了 CON組與POL組和CAR組中，曲線下多基因分類器面積的類別區分能 力和“留一法(leave one out) ”交叉驗證模型中的基因數。圖7示出了實施例中所述的4種LOOCV迭代法對CON組與POL組和CAR組的靈敏 度和特異性的示意圖。圖8示出了 CON組與POL組中，曲線下多基因分類器面積的類別區分能力和“留一 法”交叉驗證模型中的基因數。圖9示出了實施例中所述的4種LOOCV迭代法對CON組與POL組的靈敏度和特異 性的示意圖。圖10示出了 CON組與CAR組中，曲線下多基因分類器面積的類別區分能力和“留 一法”交叉驗證模型中的基因數。圖11示出了實施例中所述的4種LOOCV迭代法對CON組與CAR組的靈敏度和特 異性的示意圖。圖12示出了 CON組和IBD組與POL組和CAR組中，曲線下多基因分類器面積的類 別區分能力和“留一法”交叉驗證模型中的基因數。圖13示出了實施例中所述的4種LOOCV迭代法對CON組和IBD組與POL組和CAR 組的靈敏度和特異性的示意圖。圖14示出了 CON組與IBD組中，曲線下多基因分類器面積的類別區分能力和“留 一法”交叉驗證模型中的基因數。圖15示出了實施例中所述的4種LOOCV迭代法對CON組與IBD組的靈敏度和特 異性的示意圖。發明詳述因此，本發明提供了實體瘤的生物標志物，當一種或多種，優選兩種或更多種生物 標志物組合使用時，這種生物標志物組合可用于檢測結直腸癌。如本文所用，除非文中明確指明，否則“一個”、“一種”和“所述”、“該”包括單個或 復數個指示物。因此，例如，當提到“活性劑”或“藥理活性藥劑”時，其包括一種活性劑以 及兩種或多種不同活性劑的組合，當提到的“載體”時，其包括兩種或多種載體的混合物以
6及一種載體，等等。在本發明文中的“生物標志物”是具體生物特性的分子指示劑；可用于檢測結直腸 癌的生化特征或方面。“生物標志物”包括但不限于蛋白質、核酸和代謝物，以及它們的多態 性、突變體、變異體、修飾物、亞單位、片段、蛋白-配體復合物，和降解產物、蛋白-配體復合 物、元件(elements)、相關代謝物、電解質、元素(elements)和其它分析物或衍生自樣品的 測量物。生物標志物還可以包括突變的蛋白質或突變的核酸。生物標志物還可指健康狀況 的非分析物生理標志物，包括結直腸癌的其它臨床特征或風險因素，例如，但不限于年齡、 種族以及家族癌癥史。本文所用的“分析物”可以指待測量的任何物質。“結腸癌”是指在結腸組織(大腸最長的部分)形成的癌和/或瘤。大多數結腸癌 是腺癌(起源于產生和釋放粘液和其它液體的細胞中的癌癥)。“直腸癌”是指在直腸組織 (肛門前大腸最后幾英寸的部分)形成的癌和/或瘤。在本發明文中的“結直腸癌”是指在 結腸或直腸中出現的癌。“測量”或“測量指標”是指對臨床或對象源樣品中給定物質是否存在及其數量或 量(其可為“有效量”)進行評估，包括此類物質的定性或定量濃度水平，或者評價對象臨床 參數的數值或分類。本發明文中的“樣品”是從對象處分離出的生物樣品，其可以包括例如，但不限 于，全血、血清、血漿、血細胞、內皮細胞、組織活檢、淋巴液、腹水、間質液(也稱為“細胞外 液”，包括在細胞間隙中發現的液體)、骨髓、腦脊液(CSF)、唾液、粘液、痰液、汗液、尿液或任 何其它分泌物、排泄物或其它體液。本發明文中的“對象”優選哺乳動物。哺乳動物可以是人、非人的靈長類動物、小 鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但不限于這些實例。非人的哺乳動物可以有利地用作代表結直腸 癌動物模型的對象。對象可以為雄性或雌性。對象可以是之前診斷或鑒定為患有結直腸癌 者，并且任選地，但不必須是已經進行結直腸癌治療者。對象還可以是未患結直腸癌者。對 象還可以是診斷或鑒定為患有結直腸癌但是由于接受一種或多種結直腸癌治療而表現出 疾病改善(例如，腫瘤尺寸降低)者。作為另外一種選擇，對象還可以是之前未被診斷或鑒 定為患有結直腸癌者。例如，對象可以是表現出一種或多種結直腸癌風險因素者，或未表現 出結直腸癌風險因素的對象或無結直腸癌癥狀的對象。對象還可以是患有結直腸癌或具有 發展結直腸癌風險者。表1中總結了在患有結直腸癌或易患結直腸癌的對象中水平發生變化、改變或變 動的蛋白質、肽、核酸、多態性和代謝物，并且特別地，它們在本文中統稱為“結直腸癌相關 蛋白”、“CLRMARKER多肽”或“CLRMARKER蛋白”。編碼多肽的相應核酸稱為“結直腸癌相關 核酸”、“結直腸癌相關基因”、“CLRMARKER核酸”或“CLRMARKER基因”。除非另外指明，否則 “CLRMARKER”、“結直腸癌相關蛋白”、“結直腸癌相關核酸”的含義是指本文所公開的任何序 列。也可以測量CLRMARKER蛋白或核酸的相應代謝物，本文稱為“CLRMARKER代謝物”。本發 明文中的CLRMARKER “代謝物”可以包括全長多肽的一部分。術語“部分”不表示具體的長 度。CLRMARKER代謝物的長度可以小于500個氨基酸，例如長度小于或等于400、350、300、 250、200、150、100、75、50、35、26、25、15或10個氨基酸。根據數學方法合并一種或多種，優 選兩種或更多種上述CLRMARKER種類的測量值而產生的計算指數稱為“CLRMARKER指數”。 蛋白質、核酸、多態性、突變蛋白質和突變核酸、代謝物、和其它分析物、以及常規生理學測量指標和由任一上述實體構建的指數都包括在“CLRMARKER”的廣義范圍內。在患有結直腸癌或表現出結直腸癌特征性癥狀(如結腸和直腸內存在生長或息 肉)的對象中已鑒別出51種生物標志物的存在性或濃度水平發生改變或變動。結直腸癌的 風險因素包括但不限于存在可能癌變的結腸和直腸內生長或息肉、高脂食物、結直腸癌家 族史或個人病史、以及潰瘍性結腸炎、炎癥性腸病或克羅恩病。特別地，由于外科手術(如 切除)和結直腸癌調節劑(如抗癌化療)所引起風險因素的減小可以包括例如，息肉形成 減少、息肉尺寸減小、息肉數目減少，以及潰瘍性結腸炎、炎癥性腸病和/或克羅恩病癥狀 的減少或減輕，或它們的組合。可以用多種方式評價本發明的表現以及由此的絕對和相對臨床有用性。在多種表 現評價中，本發明旨在提供癌癥特別是結直腸癌的臨床診斷準確性。生物標志物本發明的生物標志物和方法使得本領域的技術人員能夠鑒別、診斷或者評估那些 未表現出癌癥或實體瘤的任何癥狀但盡管如此卻可能具有發展癌癥或實體瘤風險的對象， 或具有癌癥病況特征性癥狀的對象。表1提供的信息包括根據本發明用于實體瘤的候選外周血替代性生物標志物的 非詳盡列表。本領域的技術人員將認識到本文所列的生物標志物涵蓋所有形式和變體，包 括但不限于多態性、同工型、突變體、衍生物、前體(包括核酸和前蛋白)、剪切產物、受體 (包括可溶的和跨膜受體)、配體、蛋白質_配體復合物和翻譯后修飾變體(如交聯或糖基 化)、片段和降解產物以及包含有任何生物標志物作為完全組裝結構的組成性亞單位的任 何多單位核酸、蛋白質和糖蛋白結構。血液樣品中所有生物標志物的表達均已通過實驗驗 證。表1 CLRMARKER
權利要求
一種診斷或鑒定對象中的結直腸癌的方法，其包括a.測量來自對象的樣品中的一種或多種CLRMARKER或其代謝物的有效量；和b.將所述量與參考值比較，其中所述一種或多種CLRMARKER的量相對于所述參考值的增加或減少指示所述對象患有結直腸癌。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述參考值包括指標值、來源于一種或多種結直 腸癌風險預測算法或計算指數的值、來源于未患結直腸癌的對象的值、或來源于診斷患有 或鑒定為患有結直腸癌的患者的值。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述對象包括之前已診斷患有結直腸癌者、之前 未診斷患有結直腸癌者、或無結直腸癌癥狀者。
4.一種監測對象中結直腸癌進展的方法，包括a.在第一時間段測量來自對象的第一樣品中一種或多種CLRMARKER的有效量；b.在第二時間段測量來自對象的第二樣品中一種或多種CLRMARKER的有效量；和c.將步驟(a)中檢測的所述一種或多種CLRMARKER的量與步驟(b)中檢測的所述量或 與參考值進行比較。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述監測包括評價發展結直腸癌風險的變化。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述對象包括之前已進行過結直腸癌治療者、之 前未進行過結直腸癌治療者、或之前未診斷或鑒定為患有結直腸癌者。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述第一樣品取自進行結直腸癌治療前的對象。
8.根據權利要求4所述的方法，其中所述第二樣品取自進行結直腸癌治療后的對象。
9.根據權利要求4所述的方法，其中所述監測還包括為對象選擇治療方案和/或監測 結直腸癌治療方案的有效性。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述結直腸癌的治療包括外科手術、結直腸癌調 節劑或它們的組合。
11.根據權利要求4所述的方法，其中所述參考值包括指標值、來源于一種或多種結直 腸癌風險預測算法或計算指數的值、來源于未患結直腸癌的對象的值、或來源于診斷患有 或鑒定為患有結直腸癌的對象的值。
12.—種治療診斷患有或鑒定為患有結直腸癌的對象的方法，其包括a.在第一時間段測量來自對象的第一樣品中存在的一種或多種CLRMARKER或其代謝 物的有效量。b.用一種或多種結直腸癌調節劑治療所述對象直到所述一種或多種CLRMARKER或其 代謝物的量回復至在發展結直腸癌風險低的一個或多個對象中測量的參考值，或回復至在 由于使用一種或多種結直腸癌調節劑治療而表現出結直腸癌風險因素改善的一個或多個 對象中測量的參考值。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述一種或多種結直腸癌調節劑包括烷化劑、 抗生素劑、抗代謝劑、激素藥劑、植物源藥劑、類視黃醇藥劑、酪氨酸激酶抑制劑、生物制劑、 基因治療劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、其它抗癌藥劑或它們的組合。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述由于用一種或多種結直腸癌調節劑治療而 引起結直腸癌風險因素的改善包括息肉形成減少、息肉尺寸減小、息肉數目減少，以及潰瘍 性結腸炎、炎癥性腸病和/或克羅恩病癥狀的減輕，或它們的組合。
15.試劑盒，其包括檢測一種或多種CLRMARKER的CLRMARKER檢測試劑、來源于具有 正常對照水平的對象的樣品、和任選地在權利要求1、4和12任一項所述方法中使用所述試 劑的說明書。
16.根據權利要求15所述的試劑盒，其中所述檢測試劑還包括一種或多種抗體或其片 段、一種或多種適體、一種或多種寡核苷酸、或它們的組合。
全文摘要
本發明涉及用于檢測預定生物標志物的方法和試劑盒，所述預定生物標志物用于癌癥尤其是結直腸癌的早期診斷和管控。
文檔編號G01N33/574GK101971033SQ200880100577
公開日2011年2月9日 申請日期2008年6月4日 優先權日2007年6月4日
發明者勞拉·恰爾羅尼, 斯塔弗羅斯·特里安諾斯, 柯齊奧·魯格, 西爾萬·蒙尼爾-伯努瓦 申請人:戴諾普雷克斯公司