專利名稱：用于快速檢測金黃色葡萄球菌的試劑及其方法
技術領域：
本發明涉及食品微生物安全監測領域，具體地說，涉及用于快速檢測金黃色葡萄球菌的 試劑及其檢測方法。
背景技術：
食品是人類賴以生存的物質基礎，食品安全是關系人類健康和社會發展的重大問題。近 年來，國內外食品安全的惡性事件不斷發生，其中食源性致病菌是食品安全事故的重要原因。 食源性致病菌是指以食物為載體，導致人類發生疾病的一大類細菌。全世界每年約有220萬 人因食源性致病菌而喪生，而且食源性疾病常常是發展中國家導致人非正常死亡的主要原因。 因此，食源性致病菌的控制已成為國內外普遍關心的問題。
金黃色葡萄球菌(及印&/0""附m/re朋，以下簡稱"金葡菌")為常見的革蘭氏陽性球菌， 分布極為廣泛，可以附著于塵埃、物體表面、皮膚、粘膜等等，容易通過空氣和接觸傳播， 并且有較強的抗逆性。金葡菌致病力強，由它產生的耐熱腸毒素引起的食物中毒時有發生， 其危害僅次于沙門氏菌和副溶血弧菌。同時金葡菌也是引起人類感染最常見的病原菌之一， 而且近年臨床分離的金葡菌幾乎都為難以抑制的耐藥株，因此金葡菌感染已與肝炎、愛滋病 一起并稱為世界上三大難治傳染性頑癥。所以對食品、藥品和衛生用品中金葡菌的檢驗以及 臨床金葡菌的準確診斷是保證人類健康的必要手段；大部分國家對食品、醫療用品等的金葡 菌指標都有嚴格規定。
有效控制金葡菌需要準確及時的檢測手段。目前國標法檢測金葡菌需要接種Baird — Parker平板，培養后挑取可疑菌落接種血平板，對溶血的菌落再進行包括革蘭氏染色、鏡檢 以及凝固酶試驗等的確認試驗。此方法檢驗總時間大約需要52h或以上，而且確認試驗通常 需要大量的時間、精力和費用，特別是檢測大通量和雜菌污染較為嚴重的樣品時，此缺點更 為突出。
顯色培養基是對傳統檢測手段的一個突破，它利用顯色底物檢測目標微生物的特征性 酶，使目標微生物菌落顯出特定的顏色，而干擾菌被抑制，或不產生特征性酶而不顯色，因 而能被區別。當顯色培養基上生長菌落之后只要通過簡單的菌落顏色形態觀察或簡單試驗就 可以進行鑒別。
顯色培養基與傳統培養基相比有巨大的優勢。首先它具有較高的靈敏度，在培養之前不需要增菌；而且由于其特異性較高，假陽性機率比傳統的培養基低，因而能大大減少確認試 驗的量，節省大量人力、財力和時間；而且檢測者不需要太多的專業知識，只要有基本的微 生物操作技術和辨色能力就可進行檢測。第二，在挑取傳統培養基上的疑似菌落進行確認試 驗過程中，可能受到雜菌菌落的形態和數量、檢測者經驗和因費用不足確認試驗數量被限制， 疑似菌落不能被全檢等等不穩定因素的影響，使檢測結果存在假陰性的風險。顯色培養基對 生長的菌落都已完成特征性酶的測試，能大大減少以上因素造成誤差的機會，提高檢測的準 確率。第三，傳統培養基一般采用選擇性培養后再進行平板檢測，只能進行定性的檢測。而 使用顯色培養基能夠直接通過計數平板上陽性菌落而對樣品中金葡菌的數量進行定量檢測。 金葡菌的定量檢測對食品在生產、保存和運輸過程的安全性評估和其含有金葡菌耐熱腸毒素 的風險評估都有重要意義。
目前法國CHROMager公司、BioMerieux公司、美國3M公司已開發出金葡菌顯色培養 基，但這些進口顯色培養基價格昂貴，購買不便，導致檢測成本高，國內一般基層單位和企 業很少采用。
發明內容
本發明的目的在于針對傳統方法的不足，提供一種特異性高、檢測周期短、檢測成本低、 可操作性強，適用于檢測大通量樣品的金黃色葡萄球菌的試劑及其檢測方法。 為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案 用于快速檢測金黃色葡萄球菌的試劑，所述試劑包括
1) PEN培養基
所述PEN培養基由PEN基礎培養基和PEN增補劑組成；
所述PEN基礎培養基由以下組分組成牛肉浸粉l 5g/L、胰蛋白胨5 10g/L、大豆 蛋白胨5 10g/L、丙酮酸鈉3 7g/L、氯化鈉3 10g/L、瓊脂15g/L;
所述PEN增補劑由以下組分組成多黏菌素B 15 30mg、奈啶酮酸5 15mg、 50wt% 卵黃-生理鹽水溶液10 20mL，凍干血漿25 40g，無菌去離子水25 40mL;
2) TCF顯色片
所述TCF顯色片是將直徑略小于培養皿的無菌濾紙片置于煮沸稍冷卻后的TCF顯色 液中，均勻染色后在無菌條件下晾干而得；所述TCF顯色液由以下組分組成0.115%氯 化鈣溶液0.115%氯化鈣溶液15 30mL、TrisBase2 8g、NaC10.5 15g、甲苯氨藍0.5 5g、 DNAl 6g、 95%乙醇200 400mL、去離子水400 600mL。本發明快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，檢測步驟如下-
A. 制備PEN培養基平板
每lOOOmL去離子水中加入PEN基礎培養基，混勻滅菌后冷卻至45 50°C時，加入 PEN增補劑混勻，倒平板，備用；
B. 準備檢樣液
取待檢樣品和無菌生理鹽水搖勻，制備到含待檢樣品體積百分比8 — 12%的檢樣液， 或制備到含待檢樣品質量百分比8_12%的檢樣液；
C. 接種培養
將0.05 0.2mL檢樣液涂布到歩驟A所述的培養基平板上，35±2°。培養18 22h;
D. 熱處理
將步驟C培養后培養基上出現菌落的平板置于62土2。C培養箱l 1.5h;
E. TCF顯色片顯色
打開培養基平板蓋子，把TCF顯色片貼于培養基表面，避免氣泡產生，蓋上蓋子， 35土2。C培養10 15min后揭下TCF顯色片置于另一潔凈的培養基平板內，35土2。C再培 養30 60min后觀察顯色片的顏色變化。
優選地，所述步驟C接種培養前包括增菌歩驟將5ml檢樣液接種于50ml含 7.5wt%NaCl的肉湯中，35士2'C培養6 24h后得到增菌液；將0.05mL增菌液涂布到歩驟 A所述的培養基平板上，35士2。C培養18 22h。
本發明針對現有技術中的不足，從生物化學的角度出發，利用細菌特異性酶對其進行 快速檢測，在金黃色葡萄球菌特異性生化反應的基礎上，篩選出其特異性酶——熱穩定 DNA酶，然后通過金黃色葡萄球菌選擇培養基培養金黃色葡萄球菌，并增強其熱穩定DNA 酶的產生；用TCF顯色片，對熱穩定DNA酶進行檢測，通過TCF的顯色對菌落進行鑒 定，建立特異性顯色生化檢測方法。
本發明用于大通量樣品的金黃色葡萄球菌的準確快速診斷和監控，特異性高、檢測周 期短、檢測成本低、可操作性強，可大大節省檢測成本和時間，可以廣泛推廣應用到食品 衛生、環境監測等領域，具有廣泛的使用前景。
具體實施例方式
以下通過具體實施例來說明本發明。 實施例1:本發明快速檢測金黃色葡萄球菌試劑特異性的驗證包括以下步驟
A. 制備PEN培養基平板 每1000mL去離子水中加入PEN基礎培養基(牛肉浸粉lg、胰蛋白胨7.5g、大豆蛋白
胨7.5g、丙酮酸鈉3g、氯化鈉3g和瓊脂15g)，攪拌均勻后12rC滅菌15min備用。
制備平板前加熱溶解，待冷卻至45 5(TC時，加入PEN增補劑(多黏菌素B15mg、 奈啶酮酸10mg、 50wt。/。雞蛋的蛋黃-生理鹽水溶液10mL，凍干血漿25g，無菌去離子水 25mL)混勻，倒平板，備用。
B. 制備TCF顯色片
配制TCF顯色液0.115%氯化鈣溶液15mL、 TrisBase 2g、 NaCl 15g、甲苯氨藍0.5g、 DNA1.5g、 95%乙醇200mL和去離子水600mL，混勻煮沸，稍冷卻后將直徑稍小于培養 皿的無菌濾紙片置于煮沸后的TCF顯色液中，均勻染色后在無菌條件下晾干，備用；
C. 接種培養
把金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、普通變形桿菌(CMCC49027)、蠟樣芽孢桿菌 (CMCC63303)、綠膿桿菌(ATCC卯27)、糞鏈球菌(ATCC29212)、地衣芽孢桿菌 (ATCC14580)、大腸桿菌(ATCC25922)、白色葡萄球菌(8032)、粘質沙雷氏菌(ATCC
14041)和巨大芽孢桿菌(ATCC14581)接種到NA(營養瓊脂培養基)上，37。C活化培養
24h，再將以上菌種分別劃線接種于PEN上，37。C培養22h。
D. 熱處理，顯色
將步驟C培養后培養基上出現菌落的平板置于62'C培養箱lh;打開培養基平板蓋子， 把TCF顯色片貼于培養基表面，避免氣泡產生，蓋上蓋子，37。C培養15min后揭下TCF 顯色片置于另一潔凈的培養基平板內，37'C再培養30min。
E. 結果與分析
TCF顯色片中出現粉紅色的暈圈即表明樣品中存在金黃色葡萄球菌。 從表l可以看出，金黃色葡萄球菌在PEN上生長良好，并在TCF顯色片上明顯顯色； 綠膿桿菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、白色葡萄球菌、粘質沙雷氏菌和巨大芽孢桿菌能在PEN 上生長，但不擴散生長，不能在TCF顯色片上顯色，而普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌和 地衣芽孢桿菌既不能在PEN上不生長，也不在TCF顯色片上顯色，因此只有金黃色葡萄 球菌在TCF顯色片上顯色。表明本發明快速檢測金黃色葡萄球菌試劑具有較高的特異性。
表l測試菌在PEN上生長和TCF上的顯色情況
7測試菌PEN上生長TCF上顯色測試菌PEN上生長 TCF上顯色
金黃色葡萄球菌+ +地衣芽孢桿菌- -
普通變形桿菌- -大腸桿菌+ -
蠟樣芽孢桿菌- -白色葡萄球菌+ 隱
綠膿桿菌+ -粘質沙雷氏菌+ 國
糞鏈球菌巨大芽孢桿菌+ -
注+:陽性；-:陰性。
實施例2:本發明快速檢測金黃色葡萄球菌試劑最低檢出限驗證
包括以下步驟
A. 制備PEN培養基平板
每lOOOmL去離子水中加入PEN基礎培養基(牛肉浸粉5g、胰蛋白胨6g、大豆蛋白 胨9g、丙酮酸鈉7g、氯化鈉10g和瓊脂15g),攪拌均勻后12rC滅菌15min備用。
制備平板前加熱溶解，待冷卻至45 50'C時，加入PEN增補劑(多黏菌素B30mg、 奈啶酮酸15mg、 50wt。/。雞蛋的蛋黃-生理鹽水溶液20mL，凍干血漿40g，無菌去離子水 40mL)混勻，倒平板，備用。
B. 制備TCF顯色片
配制TCF顯色液0.115%氯化鈣溶液20mL、 TrisBase 8g、 NaCl lg、甲苯氨藍5g、 DNA6g、 95%乙醇300mL和去離子水500mL，混勻煮沸，稍冷卻后將直徑稍小于培養皿 的無菌濾紙片置于煮沸后的TCF顯色液中，均勻染色后在無菌條件下晾干，備用；
C. 準備檢樣液，接種培養
用生理鹽水稀釋金黃色葡萄球菌ATCC 6538菌液到不同濃度，將0.2mL稀釋菌液涂 布到PEN平板上；37。C培養20h。
D. 熱處理，顯色，方法同實施例1步驟D。
E. 結果與分析
TCF顯色片中出現粉紅色的暈圈即表明樣品中存在金黃色葡萄球菌。 表2結果表明PEN-TCF的最低檢出限均為8.3 CFU/mL(檢測0.2 mL菌液)。
表2PEN-TCF最低檢出限
金葡菌菌液濃度 8.3xl03 8.3x102 8.3xl01 8.3 8.3xl(T1 8Jxl(T2
8(CFU/mL)
PEN-TCF + + + + _ -
注.-表中"+"表示檢出金黃色葡萄球菌，"-"表示未檢出。
實施例3:本發明快速檢測金黃色葡萄球菌試劑與國外同類產品顯色培養基A和B對人工污 染食品的檢測效果比較 包括以下步驟
A. 制備PEN培養基平板 每1000mL去離子水中加入PEN基礎培養基(牛肉浸粉2.5g、胰蛋白胨7g、大豆蛋白
胨5g、丙酮酸鈉5g、氯化鈉7g和瓊脂15g)，攪拌均勻后2rC滅菌15min備用。
制備平板前加熱溶解，待冷卻至45 50"C時，加入PEN增補劑(多黏菌素B20mg、 奈啶酮酸5mg、 50wt。/。雞蛋的蛋黃-生理鹽水溶液15mL，凍干血漿30g，無菌去離子水 30mL)混勻，倒平板，備用
B. 制備TCF顯色片
配制TCF顯色液0.115%氯化鈣溶液30mL、 TrisBase 5g、 NaCl 8g、甲苯氨藍2.5g、 DNA 3g、 95%乙醇400mL和去離子水400mL，混勻煮沸，稍冷卻后將直徑稍小于培養 皿的無菌濾紙片置于煮沸后的TCF顯色液中，均勻染色后在無菌條件下晾干，備用；
C. 制備菌液
分別挑取金黃色葡萄球菌菌株ATCC6538和CMCC26003的新鮮菌苔制成菌懸液，以 生理鹽水稀釋至7.5xl04CFU/mL，等體積混合后作為污染菌液。
D. 樣品處理
用巧克力蛋糕、冷凍餃子、涼拌菜、豆腐和油豆腐作為檢測樣品，購回后馬上無菌 條件下切碎成約0.2cm3的碎片。以2mL步驟C菌液污染25g樣品并攪拌混勻，室溫(約 18'C)放置10分鐘，備用。
E. 準備檢樣液
取步驟D中25g樣品與225ml無菌生理鹽水，搖勻成檢樣液。
F. 接種培養
取0.2mL檢樣液涂布到PEN和顯色培養基A和B平板上(A購自科瑪嘉公司，B購自 3M公司)，37'C培養24h;每種樣品每種培養基均做2個重復。取2 mL步驟C菌液加入
9248 mL生理鹽水中混勻，吸取0.2mL涂布NA， 37'C培養24h,作為陽性對照，設置 兩個重復。
G. 熱處理，顯色，方法同實施例1步驟D。
H. 計數
TCF顯色片中出現粉紅色的暈圈即表明樣品中存在金黃色葡萄球菌。參照顯色培養 基A和B的說明書計數。
I. 確認試驗
隨機挑取每個顯色培養基上的20個陽性菌落進行革蘭氏染色和鏡檢，若不是G+球菌 則判斷為假陽性；若是，則轉接肉湯培養后進行血漿凝固酶試驗，若為陰性，則判斷為假 陽性；若為陽性，則判斷為金黃色葡萄球菌。 J.結果與分析
在檢測人工污染食品的比對中，顯色培養基A對金黃色葡萄球菌的回收率最好，PEN 次之，顯色培養基B較差，見表3。顯色培養基B和PEN特異性較好，而顯色培養基A 顯色底物所針對的酶特異性稍低，見表4。
表3不同培養基檢測人工污染食品的回收率
培養基 巧克力蛋糕餃子涼拌菜豆腐油豆腐平均回收率(％)
PEN 13095901029673.4
顯色培養基A 12813214010710287.7
顯色培養基B 847380807656.5
注表中為3種培養基檢出的陽性菌落數平均值(CFU/皿)，陽性對照=139CFU/皿
表4不同培養基檢測人工污染食品的特異性比較
培養基巧克力蛋糕餃子涼拌菜豆腐油豆腐
PEN00000
顯色培養基A0020
顯色培養基B00000
注表中列出的是確認試驗中分離到的假陽性菌落數。
權利要求
1. 用于快速檢測金黃色葡萄球菌的試劑，其特征在于所述試劑包括1)PEN培養基所述PEN培養基由PEN基礎培養基和PEN增補劑組成；所述PEN基礎培養基由以下組分組成牛肉浸粉1～5g/L、胰蛋白胨5～10g/L、大豆蛋白胨5～10g/L、丙酮酸鈉3～7g/L、氯化鈉3～10g/L、瓊脂15g/L；所述PEN增補劑由以下組分組成多黏菌素B15～30mg、奈啶酮酸5～15mg、50wt％卵黃-生理鹽水溶液10～20mL，凍干血漿25～40g，無菌去離子水25～40mL；2)TCF顯色片所述TCF顯色片是將直徑略小于培養皿的無菌濾紙片置于煮沸稍冷卻后的TCF顯色液中，均勻染色后在無菌條件下晾干而得；所述TCF顯色液由以下組分組成0.115％氯化鈣溶液15～30mL、TrisBase 2～8g、NaCl 0.5～15g、甲苯氨藍0.5～5g、DNA 1～6g、95％乙醇200～400mL、去離子水400～600mL。
2. —種用于快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于使用權利要求1所述的試劑，包 括以下步驟A. 制備PEN培養基平板每lOOOmL去離子水中加入PEN基礎培養基，混勻滅菌后冷卻至45 50°C時，加入 PEN增補劑混勻，倒平板，備用；B. 準備檢樣液取待檢樣品和無菌生理鹽水搖勻，制備到含待檢樣品體積百分比8 — 12%的檢樣液， 或制備到含待檢樣品質量百分比8_12%的檢樣液；C. 接種培養將0.05~0.2mL檢樣液涂布到步驟A所述的培養基平板上，35土2'C培養18 22h;D. 熱處理將步驟C培養后培養基上出現菌落的平板置于62士2'C培養箱l~1.5h;E. TCF顯色片顯色打開培養基平板蓋子，把TCF顯色片貼于培養基表面，避免氣泡產生，蓋上蓋子，35 土2。C培養10~15min后揭下TCF顯色片置于另一潔凈的培養基平板內，35土2'C再培養 30 60min后觀察顯色片的顏色變化，若出現粉紅色的暈圈即表明待檢樣品中存在金黃色 葡萄球菌。
3. 根據權利要求2所述的快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于所述步驟C接種培養前包括增菌步驟將檢樣液接種于含7.5wt%NaCl的肉湯中，37'C培養6 24h后得 到增菌液。
4.根據權利要求3所述的快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于所述步驟C為將 Q.05mL增菌液涂布到步驟A所述的培養基平板上，35士2'C培養18 22h。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測金黃色葡萄球菌的試劑及其方法，屬于食品微生物安全監測領域。該發明試劑包括PEN選擇性培養基和檢測金黃色葡萄球菌DNA酶的TCF顯色片。檢測時，用生理鹽水制備檢樣液，并將0.05～0.2mL檢樣液均勻涂布于PEN培養基中培養，出現菌落后經過熱處理和TCF顯色片顯色，根據TCF顯色片上的顏色變化來判斷樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。該發明檢測方法成本低廉，操作簡便，靈敏度高，準確率高，周期短，可操作性強，可以廣泛推廣應用到食品衛生、環境監測等領域。
文檔編號G01N21/78GK101497915SQ20091000791
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月26日 優先權日2008年12月30日
發明者吳清平, 吳許文, 張菊梅, 郭偉鵬, 黃汝添 申請人:廣東省微生物研究所