專利名稱：7-氯-n,n,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3,5-二氫-4h-噠嗪并[4,5-b]吲哚-1-乙酰胺作為外 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4， 5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物在個體內檢測與正常狀況和病理狀況相關的PBR(外周苯并二氮雜革受體(peripheral benzodiazepine receptor))水平的用途。本發明還涉及為了上述目的檢測PBR水平的方法。
背景技術：
在正常的生理條件下，PBR，也已知為易位體蛋白18kDa(TSP0) (Papadopoulos， B. et al. (2006)Trends Pharmacol. Sci. 27 :402-409)，以低水平表達在腦中、主要在小膠質細胞中，并且高度表達在大量的周緣組織(peripheral tissue)中，例如腎上腺、松果腺、唾液腺、生殖腺、腎、肺、心和骨骼肌(Chen, M-K. and Guilarte，Τ. (2008)Pharmacology and Therapeutics 118 :1-17 ；Venneti, S. et al. (2006)Progress in Neurobiol. 80 308-322)。參照PBR配體[3H] PKl 1195的亞細胞定位研究已經顯示出PBR位于外部線粒體膜中(Anholt, R. R. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 :576-583 ；Antkiewicz-Michaluk, L. et al. (1988)Mol. Pharmacol. 34 :272-278)。然而，免疫組織化學研究還顯示了 PBR表達在血細胞(缺乏線粒體)中(Olson, J. Μ. et al. (1988) Eur. J. Pharmacol. 152 :47-53)，并且可以集中至質膜(0，Beirne, G. et al. (1990)Eur. J. Biochem. 188 :131-138 ；Woods, Μ. J. et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51 :1283-1292) PBR的核定位或圍核定位也已經在乳腺癌 (Hardwick, Μ. et al. (1999)Cancer Res. 59 :831-842)、人神經膠質瘤細胞(Brown, R. C. et al. (2000)Cancer Lett. 156 :125-132)、肝腫瘤細胞(Corsi,L. et al. (2005)Life Sci. 76 2523-2533)和神經膠質細胞(Kuhlmann, A. C. and Guilarte, Τ. R. (2000) J. Neurochem. 74 1694-1704)中觀察到。PBR水平的顯著增加在細胞損傷、炎癥或增殖后觀察到，并且與眾多急性或慢性病才目# (Chen, M-K. and Guilarte, Τ. (2008)Pharmacology and Therapeutics 118
1-17 ；Venneti, S. et al. (2006)Progress in Neurobiology 80 :308-322)。這些包括腦損傷，例如中風和缺血-再灌注損傷(Gerhard,A. et al. (2000)Neuroreport 11 :2957-2960 ； Gerhard, A. et al. (2005)Neuroimage 24 :404-412)、夕卜傷性腦損傷(Raghavendra, R. et al. (2000)Exp. Neurol. 161 :102-114)；腦感染，例如腦炎(Banati，R. B. et al. (1999) Neurology 53 :2199-2203 ；Cagin, A. et al. (2001)Brain 124 :2014-2027)；神經疾病， 例如多發性硬化(Banati，R. B. et al. (2000)Brain 123:2321-2337)，阿爾茨海默病和癡呆(Cagnin, A. et al. (2001) Lancet 358 :461-467 ；Versi jpt, J. J. et al. (2003) Eur. Neurol. 50 :39-47)，帕金森病(Ouchi, Y. et al. (2005)Ann. Neurol. 57 :168-175 ； Gerhard, A. et al. (2006)Neurobiol. Dis. 21 :404-412)，肌萎縮側索硬化(Turner, Μ. R. et al. (2004)Neurobiol. Dis. 15 :601-609)，皮質基底變性(cortico-basal degeneration)2/17 頁
(Gerhard A. et al. (2004)Mov. Disord. 19 :1221-1226 ；Henkel, K. et al. (2004)Mov. Disord. 19 :817-821)，亨廷頓病(Messmer, K. and Reynolds, G. P. (1998)Neurosci. Lett. 241 :53-56 ；Pavese,N. et al. (2006)Neurology 66 :1638-1643)和癲癇(Sauvageau, A. et al. (2002)Metab. Brain Dis. 17 :3-11)。在 CNS 病理中的 PBR 水平的增加主要在小膠質細胞中觀察至IJ (Chen, M-K. and Guilarte, Τ. (2008)Pharmacology and Therapeutics 118 :1-17 ；Venneti,S.et al. (2006)Progress in Neurobiology 80:308—322)。PBR 的大量增加也在癌癥(Cornu, P. et al. (1992) Acta. Neurichir. 119 146-152 ；Hardwick, Μ. et al. (1999)Cancer Res. 59 :831-842 ；Maaser, K. et al. (2002) Cancer Res. 8 :3205-3209)、肺部炎癥(Audi, S. H. et al. (2002)Lung. 180 :241-250 ； Hardwick, M. J. et al. (2005)Mol. Imaging. 4 :432-438) >月Jl . (Mazzone, A. et al. (2000)J. Am. Coll. Cardiol. 36 :746-750),腎缺血(Zhang, K. et al. (2006) J. Am. Coll. Surg. 203 :353-364)、風濕病(纖維肌痛)(Faggioli, P. et al. (2004) Rheumatology(Oxford)43 :1224-1225)、坐骨神經再生(Mills, C. D. et al. (2005)Mol. Cell. Neurosci. 30 :228-237)、牛皮癬關節炎(Guisti, L. et al. (2004)Clin. Biochem. 37 61-66)和動脈粥樣硬化(Fujimura, Y. et al. (2008) Atherosclerosis, 201 :108-111 ； Laitinen, I. et al. (2008)Eur. J. Nuc. Med. Mol. Imaging 36 :73-80)中觀察到。相反的是，PBR水平的降低在精神分裂癥患者的腦中(Kurumaji，A. et al. (1997) J. Neural. Transm. 104 :1361-1370 ；ffodarz,N.et al. (1998)Psychiatry Res. 14 :363-369) 和在類風濕性關節炎(Bribes, Ε. et al. (2002)Eur. J. Pharmacol. 452 :111-122)和骨關節炎(Bazzichi, L. et al. (2003)Clin. Biochem. 36 :57-60)中被觀察到。因此，在腦和其他組織中體內成像PBR水平的能力可以用作疾病發展的重要生物標志物，從而確定和評估治療性治療的功效和評估體內PBR受體占有率。參照PET PBR配體，["(]冊11195，已經被廣泛地用于在眾多神經病理狀況下體內 j^ft PBR 7ΚΨ (Chen,M-K and Guilarte, Τ. (2008) Pharmacology and Therapeutics 118 1-17 ；Venneti, S. et al. (2006)Progress in Neurobiology 80:308—322)。然而，[11C] PK11195顯示較低地腦吸收、高的非特異性結合和糟糕的信噪比。這些性質限制了 [11C] PKl 1195在CNS中用于PBR水平的PET成像和占有率研究(occupancy study)的敏感性。 研發了改善的PBR PET配體，其具有比["C]PK11195更高的特異性結合和更高的敏感性，因此提供了在腦和其他組織中成像PBR水平的重要進步。在文獻W099/06406和W000/44384記載和要求保護的化合物中，噠嗪并[4，5_b] 吲哚衍生物，7-氯-N, N, 5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5_b]吲哚-1-乙酰胺，被鑒定為特別適用作PBR的PET(或SPECT)配體。該化合物在體外和體內對 PBR 的親合性高(Ferzaz, B. et al. (2002) J. Pharm. Exp. Therap. 301 :1067-1078)。發明概述本發明涉及放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代_3_苯基_3，5_ 二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物檢測與正常狀況相關的PBR水平和與病理狀況相關的PBR水平的用途。本發明還涉及使用放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代_3_苯基-3， 5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺檢測與正常狀況相關的PBR水平和與病理狀
5況相關的PBR水平的方法。本發明還涉及用于檢測PBR水平的診斷試劑盒。定義出于便利原因并幫助閱讀，化合物7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代_3_苯基_3， 5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺在本申請的一些章節中被重命名為“A”。對于本發明而言，下列詞語應當被相應地理解。-生物標志物(biomarker)可以被客觀測量的特征(即具有可接受的精確性和重現性)，并可以用作正常生理或病理過程的指示，用來評估醫藥治療的作用。生物標志物可以為能在組織或生物學流體中被檢測到的生物學、解剖學、生理學、生物化學或分子的參數。-炎癥對組織損傷或破壞的響應。在外周(periphery)中，急性炎癥由以多形核細胞(中性白細胞)為特征的白細胞浸潤組成，慢性炎癥由單核細胞(巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞)組成。在腦中，炎癥結合了廣泛的細胞響應(包括激活小膠質細胞和星形膠質細胞)，以及細胞因子和趨化因子、補體蛋白、急性期蛋白、氧化性損傷和相關的分子過程的參與。這些事件可能具有對神經元功能的有害作用，導致了神經元損傷以及進一步的神經膠質激活和最終的神經變性。在響應腦部炎癥時，膠質細胞(大多數為小膠質細胞)被激活，并過表達PBR。PBR在腦中的水平因此為神經炎癥的指征，并可以被認為是用于本發明的神經炎癥的生物標志物。-病理狀況這些狀況可以包括神經疾病影響中樞神經系統功能的任何損傷、病癥或疾病。這些可以包括急性腦損傷，如中風、缺血-再灌注損傷和外傷性腦損傷；腦感染， 如腦炎；神經疾病，如多發性硬化，阿爾茨海默病，帕金森病，肌萎縮側索硬化，癡呆，皮質基底變性，亨廷頓病和癲癇；病理狀況還可以包括精神疾病，如精神分裂癥；外周炎性過程， 如肺部炎癥，動脈粥樣硬化，心肌缺血，腎缺血，風濕病(纖維肌痛)，銀屑病性關節炎，類風濕性關節炎和骨關節炎；增殖性疾病，如癌癥。-受體占有率(Rec印toroccupancy)結合至生物化學靶標或受體的量的量度。 藥物的受體占有率的水平可以通過比較僅使用放射性標記的PET配體以及當在給藥未標記藥物后給予PET配體時得到的時間-活性測量結果而測量。PET配體必須結合至與未標記藥物一樣的受體。在未標記藥物的濃度增加時，放射性標記的PET配體結合至受體的量降低。這種降低的程度定義為未標記藥物的受體占有率。-PET成像正電子放射斷層掃描術為一種產生體內功能性過程的三維圖像或圖譜的成像技術。該系統檢測直接通過發射正電子的放射性核素(示蹤物(tracer))發射的成對的伽馬射線，該放射性核素在生物活性分子上引入至體內。示蹤物的濃度在體內三維空間的成像然后通過電腦分析重建。用于PET的材料為閃爍劑如鍺酸鉍、氧原硅酸镥 (lutetium oxy-orthosilicate)或原娃酸軋(gadolinium orthosilicate),因為它們具有高的Y-射線阻止能力和信號轉化速度。Micro PET為針對小型動物成像的PET的應用。-SPECT成像單光子發射計算機斷層掃描術為另一種產生體內功能性過程的三維圖像或圖譜的成像技術。該系統通過發射單個光子的放射性核素(示蹤物)并將將該放射性核素在生物活性分子上引入至體內的而直接檢測伽馬射線。示蹤物的濃度在體內三維空間的成像然后也通過電腦分析重建。
-放射性標記形式一個或多個原子被能夠檢測到的同位素置換的任何分子。 最經常用于PET成像的發射正電子的放射性同位素有碳-11 (或"C，t1/2 = 20分鐘)， 氮-13 (或13N, t1/2 = 10分鐘)，氧-15 (或150，t1/2 = 2分鐘)。還可以考慮如下的分子，其中加入了額外原子從而用其他發射正電子的放射性同位素標記該衍生物以用于PET成像， 如氟-18 (或 18F, t1/2 = 110 分鐘)，還有鎵-68 (68Ga, t1/2 = 68 分鐘)，銅-64 (64Cu, t1/2 = 12. 7 小時)，溴-76(或 76Br，t1/2 = 16. 1 小時)和碘-124 (或 1241，t1/2 = 4. 2 天)。最后還可以考慮如下的分子，其中加入了其他額外的原子從而用發射單個光子的放射性同位素標記該衍生物以用于SPECT成像，如碘-123(或1231，t1/2 = 13. 1小時)或锝_99m(或99mTc, t1/2 = 6. 0 小時)。合成放射性標記配體以及用同位素取代原子可以通過本領域技術人員已知的多種技術實施。例如，對于用碳-11取代碳原子而言，我們可以使用多種衍生物如[11C]甲基碘或[11C]甲基三氟甲磺酸酯(Welch Μ. J. et al. (2003) In Handbook of Radiopharmaceu ticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New York-Ch ichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub. ,1-848)。在 A 的情況下，多個甲基可以被碳-11標記，例如N，N- 二甲基乙酰胺或N-甲基吲哚官能團。在用氟-18標記的情況下，放射性同位素可通過親核脂族或芳族(包括雜芳 M ) (Dolle F. et al. (2005) Curr. Pharm. Design 11 :3221-3235))取代或親電取代直接連接至核結構(A)或者通過添加間隔基團進行連接，這兩種技術都是本領域技術人員已知的(Kilbourn MR. (1990)In Fluorine-18 Labeling of Radiopharmaceuticals， Nuclear Science Series (Kilbourn MR Ed. ), National Academy Press，Washington, D. C. ,1-149 ；Lasne Μ. -C. et al. (2002) Topics in Current Chemistry 222 :201-258 ； Cai Let al. (2008) Eur. J. Org. Chem. 17 :2853-2873 ；Dolle F. et al. (2008) In Fluorine and Health :Molecular Imaging，Biomedical Materials and Pharmaceuticals， Tressaud A，Haufe G (Eds). Elsevier Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-New York-Oxford-Paris-San Diego-San Francisco-Singapore-Sydney-Tokyo,3-65)0 特別感興趣的是使用烷基、烯基或炔基連接基用于添加氟-18原子(Damont A. et al. (2008) J. Label. Compds Radiopharm. 51 :286-292 ；Dolle F. et al. (2006)Bioorg. Med. Chem. 14 1115-1125 ；Dolle F.et al. (2007)J. Label. Compds Radiopharm. 50 :716-723)。在用其他鹵素(如溴-76、碘-123或碘-124)標記的情況下，放射性同位素也可以直接通過親核或親電取代連接至核結構(A)或者通過添加間隔基團進行連接，這兩種技術都是本領域技術人員已知的(MaziSre B. et al. (2001)Curr. Pharm. Des. 7 :1931-1943 ；Coenen H. H. et al. (2006)In Radioiodination reactions for pharmaceuticals-Compendium for effective synthesis strategies, Coenen H. H., Mertens J. , Maziere B. (Eds), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg,1-101)。在用金屬放射性同位素(例如鎵-68、銅-64或锝_99m)標記的情況下，本領域技術人員認為優選使用的方法是使用基于以下的雙官能螯合劑，例如開鏈多氨基羧酸(open-chain polyaminocarboxylates)乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)，多氨基羧酸大環(polyaminocarboxylic macrocycle) 1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)，巰基乙酰基二-甘油和三-甘油(MAG2，MAG3)，二-(S-苯甲酰基-硫代乙醇酰基)二氨基丙酸酯((SBT)2DAP)和胼基煙酸(HYNIC)，促進放射性金屬陽離子在一個官能團處的絡合作用以及共價連接至在另一官能團處的核分子(Brimner U.K.et al. (1995)Radiotracer production-Radiometals and their chelates In Principle of Nuclear Medecine, Wagner H.N. (Ed) · Saunders !Philadelphia,220-228 ; Weiner R. E. et al. (2003)Chemistry of gallium and indium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New York-Chichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub.,363-400 ；Anderson C. J. et al. (2003)Chemistry of copper radionucleides and radiopharmaceutical products In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemi stry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New York-Chichester-Brisba ne-Toronto, Wiley-Interscience Pub. ,401-422 ；Mahmood A. et al. (2003)Technetium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New York-Chichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub.,323-362)。直接加入氟-18原子(或溴-76、碘-123或碘-124)可以例如在3_苯基和/或噠嗪并W，5-b]吲哚芳香環上以及在任何其他化學上可接近的位置上進行(如乙酰胺官能團)。間接加入這些放射性鹵素(例如通過使用間隔基團)，或者加入上述的金屬放射性同位素(鎵-68、銅-64或锝-99m，通過使用螯合劑)也可以在N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺(A)核的化學上可接近的位置處進行 (參見上述參考)。-給藥放射性標記的生物標志物的優選給藥是通過靜脈內途徑給予。本發明的第一實施方案是使用7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物用于在個體內檢測與病理狀況相關的PBR(外周苯并二氮雜罩受體)水平和炎癥，其中所述化合物為放射性標記的，其中該放射性標記選自碳-11、放射性鹵素和放射性金屬。優選地，所述化合物用碳-11進行放射性標記，更優選地，用碳-11在位于吲哚核5位的甲基碳上進行放射性標記。在另一實施方案中，7-氯-N，N, 5-三甲基-4-氧代_3_苯基-3，5_ 二氫_4H_噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性金屬進行放射性標記，優選在3-苯基環的對位、在噠嗪并[4，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或沒有間隔基，參見下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N- 二甲基乙酰胺官能團或位于吲哚核5位的甲基)。在另一實施方案中，7-氯-N，N, 5-三甲基-4-氧代_3_苯基-3，5_ 二氫_4H_噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性鹵素進行放射性標記，優選用放射性鹵素氟-18進行放射性標記，優選在3-苯基環的對位、在噠嗪并W，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或沒有間隔基，參見下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能團或位于吲哚核5位的甲基)。在一些實施方案中，檢測PBR水平和炎癥通過PET成像(正電子放射斷層掃描術) 或通過SPECT成像(單光子發射計算機斷層掃描術)進行。在本發明的一些實施方案中，放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基_4_氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物用于檢測與病理狀況相關的PBR水平變化或炎癥，其中所述病理狀況選自腦損傷，如中風、缺血-再灌注損傷和外傷性腦損傷；腦感染，如腦炎；神經疾病，如多發性硬化，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)，帕金森病，肌萎縮側索硬化，癡呆，皮質基底變性，亨廷頓病(Huntington' s disease)和癲癇；精神疾病，如精神分裂癥；外周炎性過程，如肺部炎癥，動脈粥樣硬化，心肌缺血，腎缺血，風濕病(纖維肌痛)，銀屑病性關節炎(psoriasic arthritis)，類風濕性關節炎和骨關節炎；增殖性疾病(proliferative diseases)，如癌癥。在本發明的一些實施方案中，放射性標記形式的7-氯-N，N，5_三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用作PBR水平和炎癥的生物標志物，其中炎癥為神經炎癥(neuroinflammation)。在本發明的一些實施方案中，放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基_4_氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用于評估治療性治療的功效。本發明還涉及使用放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基_4_氧代_3_苯基_3， 5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用于檢測與病理狀況相關的PBR和炎癥的方法。在一些實施方案中，該放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺含有選自碳-11、放射性鹵素和放射性金屬的放射性標記。在一些實施方案中，放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-I-乙酰胺為用碳-11標記的。在一些實施方案中，放射性標記形式的7-氯-N，N, 5-三甲基_4_氧代_3_苯基_3， 5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]叼丨哚-1-乙酰胺在位于吲哚核5位的甲基碳上進行放射性標記。在一些實施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基_4_氧代_3_苯基-3，5_ 二氫_4H_噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性金屬進行放射性標記，優選在3-苯基環的對位、在噠嗪并[4，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或沒有間隔基，參見下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N- 二甲基乙酰胺官能團或位于吲哚核5位的甲基)。在一些實施方案中，7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代_3_苯基-3，5_ 二氫_4H_噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性鹵素進行放射性標記，優選用放射性鹵素氟-18進行放射性標記，優選在3-苯基環的對位、在噠嗪并W，5-b]吲哚的7-位代替氯原子(有或沒有間隔基，參見下文)，或者在任何N-甲基位置(N，N-二甲基乙酰胺官能團或位于吲哚核5位的甲基)。在本發明的一些實施方案中，病理狀況選自腦損傷，如中風，缺血-再灌注損傷， 外傷性腦損傷；腦感染，如腦炎；神經疾病，如多發性硬化，阿爾茨海默病，帕金森病，肌萎縮側索硬化，癡呆，皮質基底變性，亨廷頓病和癲癇；精神疾病，如精神分裂癥；外周炎性過程，如肺部炎癥，動脈粥樣硬化，心肌缺血，腎缺血，風濕病(纖維肌痛)，銀屑病性關節炎， 類風濕性關節炎和骨關節炎；增殖性疾病，如癌癥。根據本發明的另一實施方案為檢測與病理狀況相關的PBR和炎癥的方法，其中炎癥為神經炎癥。根據本發明的另一實施方案為檢測與病理狀況相關的PBR和炎癥的方法，該方法為了占有率研究而進行。
另一實施方案為檢測與病理狀況相關的PBR和炎癥的方法，所述方法包括下列步驟a)給予放射性標記形式的7-氯-N，N，5_三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺；b)使用PET(或SPECT)技術獲得在腦或其他外周組織的關注區域中的圖像；c)通過定量在該關注區域中與放射性標記形式的7-氯-N，N，5_三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺相關的PET信號而定量該關注區域中的PBR水平；d)比較在步驟c)中得到的PET(SPECT)信號與在對照關注區域中得到的信號；e)確定與病理狀況相關的炎癥的存在。本發明還涉及診斷試劑盒，其用來檢測與正常狀況相關的PBR水平和與病理狀況相關的PBR水平的變化，該診斷試劑盒包括放射性標記形式的7-氯-N，N, 5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-I-乙酰胺。下列實施例進一步解釋了本發明，并不意在限制本發明。出于便利性原因和方便閱讀，化合物7-氯-N, N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3,5- 二氫-4H-噠嗪并[4, 5-b]吲哚-1-乙酰胺已經在圖和結果中被重命名為“A”。
圖1 [11C]-A和[11C]PKl 1195在受損的和完整的大鼠紋狀體中的時間-活性-曲線。數據表達為每立方厘米注射劑量的百分比，為注射后時間(分鐘)的函數。 圖2 :["C]-A和["C]PK11195在受損的與完整的對側大鼠紋狀體中吸收的比值。圖3 [11C]-A在受損的(ipsi)和完整的大鼠紋狀體(contro)中的時間-活性-曲線。箭頭指示在注射["C]-A后20分鐘在受損的(ipsi+PK)和完整的對側(contro+PK)大鼠紋狀體中添加過量的lmg/kg的K11195。數據表達為每立方厘米注射劑量的百分比，為注射后時間(分鐘)的函數。圖4 [11C] -A在受損的(ipsi A)和完整的大鼠紋狀體(contro A)中的時間-活性-曲線。箭頭指示在注射["C]-A后20分鐘在受損的(ipsi+A+A)和完整的對側 (contro+A+A)大鼠紋狀體中添加過量的lmg/kg的A。數據表達為每立方厘米注射劑量的百分比，為注射后時間(分鐘)的函數。圖5 在大鼠受損7-8天后的腦切片QO μ m)中的[11C=-A(ISnM)放射自顯影。非特異性結合使用過量的未標記Ηα 195(23μΜ)或Α(22μΜ)來評估。PBR對中樞苯并二氮雜革結合位點的特異性使用過量的未標記氟馬西尼(27 μ Μ)來評估。數據表達為每任意面積單位(per arbitrary area)的dpm。*表示相對于在受損紋狀體中的[11C]-A (18nM)結合有顯著差異。圖6:在11-12個月APP/S1和野生型PSl轉基因小鼠的整個腦(排除小腦)中的 ["C]-A和["(]冊11195時間-活性-曲線。數據表達為每立方厘米注射劑量的百分比，為注射后時間(分鐘)的函數。圖7 從20-23月大的APP/PS1和野生型PSl轉基因小鼠的腦切片中的 [11CJ-A(ISnM)放射自顯影。非特異性結合使用過量的未標記Hil 1195 (23 μ M)或Α(22μΜ) 來評估。PBR對中樞苯并二氮雜草結合位點的特異性使用過量的未標記氟馬西尼(27 μ Μ)來評估。數據表達為每任意面積單位的dpm。圖8 在非人靈長類的4個不同腦區域(右紋狀體和左紋狀體，前額皮質，小腦)中的["C]-A時間-活性-曲線，和在研究的不同時間點處經120分鐘的所選冠狀腦切片的相應PET圖像集(summation images)基線(A，B)和在右紋狀體受損M小時后(C，D)。組 (E，F)顯示了在左紋狀體中受損48小時后和在右紋狀體中受損后7個月的["C]-A時間活性曲線。數據表達為每IOOmL注射劑量的百分比(％ ID/100mL)，為注射后時間(分鐘)的函數。圖9 在4個不同腦區域(右紋狀體和左紋狀體，前額皮質，小腦)中的["C]_A時間-活性-曲線，和在研究的四個不同時間點處經120分鐘的所選冠狀腦切片的相應PET 圖像集基線(A，B)，在左紋狀體受損后48小時(C，D)，在左紋狀體受損后9天(E，F)，在左紋狀體受損后16天，和在右紋狀體受損后48小時(G，H)。箭頭指示給予過量未標記 PK11195(lmg/kg)的時間。數據表達為每IOOmL注射劑量的百分比(％ ID/100mL)，為注射后時間(分鐘)的函數。圖10 在血漿和腦中分析["C]_A代謝產物。圖11 選擇的碳-11標記形式和氟-18標記的形式的A。方法放射合成配體用碳-11標記[11C] PKl 1195 ((R) _N_ [11C]甲基-N- (1-甲基丙基)(2-氯苯基)異喹啉 _3_ 甲酰胺，R-對映異構體)。["C]PK11195的制備基于經微調節的公布方法(Camsorme C. et al. (1984) J. Label. Comp. Radiopharm 21 :985-991 ；Cremer J. E. et al. (1992) Int. J. Rad. App 1. Instrum. B. 19 :159-66 ；Boutin, H. et al. (2007)Glia 55 :1459-68 ；Boutin, H. et al. (2007)J.Nucl. Med. 48 :573-581),并包括下列步驟(1)在 _10°C將[11C]甲基碘捕獲 (trapping)在 DMF/DMS0 (2/1 (ν ν), 300 μ L)中，該 DMF/DMS0 含有 1. 5 至 2. Omg 用于標記的前體和15-20mg的粉末狀氫氧化物(過量)；(2)在110°C加熱3分鐘；(3)用0. 5mL的 HPLC流動相吸收混合物，和(4)使用半制備型HPLC純化。質量控制特別是放射性化學物質以及化學物質純度確定在等分的最終制備批次上進行。在N-甲基吲哚官能團處的[11C]-A標記:7-氯-N，N-二甲基-5-[11C]甲基_4_氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺)。[11C]-A的制備包括下列步驟(1)在-10°C將[11C]甲基三氟甲磺酸酯捕獲在DMF(300yL)中，該DMF含有0.2至 0. 3mg的用于標記的前體和^ig粉末狀碳酸鉀(過量)；(2)在120°C加熱3分鐘；(3)用 0. 5mL的HPLC流動相吸收該混合物，和(4)使用半制備型HPLC純化。質量控制特別是放射性化學物質以及化學物質純度確定在等分的最終制備批次上進行。["C]-A(在N，N-二甲基乙酰胺官能團處標記7-氯-N_["C]甲基_N，5_ 二甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5_b] 口引哚-I-乙酰胺)。制備[11Cj-A還包括下列步驟(1)在-10°C將[11C]甲基碘捕獲在DMF和DMSO (100/200 μ L) ^ 1/2 (ν ν) 混合物中，該混合物含有0. 5至1. Omg的用于標記的前體和5 μ L的IM四丁基氫氧化銨的甲醇溶液；⑵在120°C加熱3分鐘；(3)用0. 5mL的HPLC流動相吸收該混合物，和⑷使用半制備型HPLC純化。質量控制特別是放射性化學物質以及化學物質純度確定在等分的最終制備批次上進行。用氟-18標記所有的A的氟-18-標記的衍生物的制備包括至少下列步驟⑴使用[18F]氟化物源于中等溫度至高溫在含有1至IOmg用于標記的合適前體的所選溶劑(300至900 μ L) 中進行氟化，和( 使用例如半制備型HPLC純化。如上所述，質量控制特別是放射性化學物質以及化學物質純度確定在等分的最終制備批次上進行。對在該反應中使用的[18F]氟化物陰離子源的性質沒有特別限制，在該類型反應中常規使用的任何來源[18F]氟化物陰離子都可以在這里等同地使用，條件是其對分子的其他部分沒有不利作用。合適來源的[18F]氟化物陰離子的實例包括堿金屬[18F]氟化物，如，[18F]氟化鈉，[18F]氟化鉀，[18F]氟化銫；[18F]氟化銨，四烷基[18F]氟化銨，如四丁基[18F]氟化銨。其中，優選堿金屬[18F]氟化物，特別優選氟化鉀。[18F]氟化物陰離子的來源可以通過能夠復合[18F]氟化物陰離子源的抗衡陽離子種類的配體的存在而被活化。 該配體可以為可以特別為環狀或多環狀多齒配體。合適配體的實例特別包括冠醚，如1，4， 7，10，13-五氧雜環十八烷(18-C-6)，或穴狀配體，如以名稱K222 銷售的4,7,13，16，21， 24-六氧雜-1，10-二氮雜雙環-[8，8，8] 二十六烷。優選地，[18F]氟化物陰離子的來源為堿金屬[18F]氟化物-穴狀化合物(cryptate)絡合物，特別為[18F]氟化鉀_穴狀化合物絡合物，優選為[18F]氟化鉀-4，7，13，16，21，24-六氧雜-1，10-二氮雜雙環-[8，8，8] 二十六烷(K[18F]/K222)。絡合物 K[18F]/K222 可以通過任何常規方法 φοF. et al. (1999) J. Med. Chem. 42 :2251-2259 or Dolci L. et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. 7 :467-479)制備。氟化反應可以在各種溶劑中進行，并且可以在寬的溫度范圍上發生。一般來說， 方便在約50°C至約200°C的溫度進行反應，較常使用的溶劑有二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈。反應所需的時間也可以根據許多因素在寬的范圍內變化(例如，從約5分鐘至15分鐘)，所述因素特別為反應溫度、試劑和溶劑的性質、所使用的標記前體的量(Kilbourn MR. (1990)In Fluorine-18 Labeling of Radiopharmaceuticals, Nuclear Science Series (Kilbourn MR Ed. ), National Academy Press, Washington,D.C.,1-149 ； Lasne Μ. -C. et al. (2002)Topics in Current Chemistry, 222 :201-258 ；Dolle F. et al. (2005) Curr. Pharm. Design 11 :3221-3235 ；Cai L. et al. (2008)Eur. J. Org. Chem. 17 2853-2873 ；Dolle F. et al. (2008)In Fluorine and Health =Molecular Imaging, Biomedical Materials and Pharmaceuticals, Tressaud A, Haufe G(Eds). Elsevier :Am sterdam-Boston-HeideIberg-London-New York-Oxford-Paris-San Diego-San Francisc o-Singapore-Sydney-Tokyo，3-65)。這樣制備的放射性氟化的化合物通常通過HPLC來純化，如對碳-11-標記的衍生物所描述的，但是還可以通過使用其他已知的色譜技術從反應混合物中回收或預純化，或者簡單地通過在預填充分離柱上過濾回收或預純化。[18F]氟乙氧基-A (7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代_3_ (4- [18F]氟乙氧基)-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺)[18F]氟乙氧基-A的制備包括下列步驟(1)用DMSO溶液(600 μ L)吸收 K[18F]F-Kryptofix 222絡合物，所述DMSO溶液含有用于標記的甲苯磺酰基氧基前體 (2. 0-8. Omg) ； (2)在 165°C加熱 3-10 分鐘；(3)使用 C-8 或 C-18PrepSep 柱預純化，和(4)使用半制備型HPLC純化。質量控制特別是放射性化學物質以及化學物質純度確定在等分的最終制備批次上進行。用其他鹵素(溴-76，碘-123, W -124)標記所有其他放射性鹵素化的衍生物(溴-76，碘-123，碘-124)的制備依據本領域技術人員已知的標準技術和方法(MaziSre B. et al. (2001) Curr. Pharm. Des.7 :1931-1943 ；Coenen H. H. et al. (2006)In Radioiodination reactions for pharmaceuticals-Compendium for effective synthesis strategies, Coenen H. H., Mertens J. , Maziere B. (Eds), Springer Verlag, Berlin-Heidelberg,1-101)。用放射性金屬(鎵-68，銅-64和锝_99m)標記用放射性金屬(鎵-68、銅-64和锝_99m)標記的衍生物的制備也依照標準技術和本領域技術人員已知的方法(Brunner U. K. et al. (1995) Radiotracer production-Radiometals and their chelates In Principle of Nuclear Medecine, Wagner H. N. (Ed).Saunders :Philadelphia,220-228 ；Weiner R. Ε. et al. (2003) Chemistry of gallium and indium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharm aceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New Yor k-Chichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub. ,363—400 ；Anderson C. J. et al. (2003)Chemistry of copper radionucleides and radiopharmaceuticals products In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds. ), New York-Chichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub. ,401-422 ；Mahmood A.et al. (2003)Technetium radiopharmaceuticals In Handbook of Radiopharmaceuticals-Radiochemistry and Applications(Welch MJ, Redvanly CS Eds.), New York-Chichester-Brisbane-Toronto, Wiley-Interscience Pub.,323-362)。配制作為用于注射的靜脈內(i. v.)溶液的["(:]Ηα 195、[11C]-A或任何其他放射性標記的A衍生物的配制常常包括基于Waters kpPak 柱除去HPLC溶劑和/或用0. 9% NaCl 水溶液(生理鹽水)簡單稀釋至乙醇濃度低于10%。動物模型所有的研究都根據法國法律和European導則的進行。神經炎癥的大鼠模型Wistar 大鼠(平均體重 300g，centre cT^levage Rene Janvier,France)保持
在調節溫度的、控制濕度的裝置中，經歷12小時/12小時明/暗循環(在上午7點和下午7 點之間為明)，允許自由獲得食物和水。神經炎癥如下誘導通過立體定位(stereotaxic) 注射AMPA ( α -氨基-3-羥基-5-甲基_4_異噁唑丙酸酯(propionate)) (15mM預PBS緩沖液中，Sigma )，使用1 μ L微量注射器和微泵(注射速率0. 5 μ L/分鐘，UltraMicroPump II 和 Micro4 Controller，WPI Inc.，USA)，如前所述的(Boutin, H. et al. (2007)Glia 55 :1459-68. ；Boutin, H. et al. (2007) J. Nucl. Med. 48 :573-581)。將 AMPA(0.5yL)注射入右紋狀體(Bregma+0. 7mm，距離矢狀縫2. 7mm，距離腦表面的深度5. 5mm)。手術期間通過使用力口熱種(Homeothermic Blanket Control Unit, Harvard Apparatus Limited , Edenbridge,Kent,UK)將動物保持在正常溫度(體溫36. 7士0. 5°C，平均值士標準偏差)。
神經炎癥的靈長類模型WM.^] 4~5kg 的^1] (Cynomolgus macaques) (Macaca fascicularis) τ 調節溫度的、控制濕度的裝置中，經歷12小時/12小時明/暗循環(在上午7點和下午 7點之間為明)，允許自由獲得食物和水。神經炎癥如下誘導在兩個不同的外科手術介入期間，通過局部立體定位注射喹啉酸(喹啉酸，Sigma, St. Louis, MO ；溶解在0. IM PBS 中，pH 7. 2)至靈長類紋狀體(1個注射定位于尾狀核(caudate)中，2個注射定位于殼核 (putamen)內)，在這兩個手術介入期間喹啉酸在第1天注射進入一個半球，在2周或7個月后注射進入第二半球(圖8和9)。在每個外科手術期間，動物接收eOnmol的喹啉酸，分布在三個不同的紋狀體位點上，一個5 μ L定位于尾狀核中，兩個10 μ L定位于殼核中，使用10 μ L-Hamilton注射器，其連接26-量規注射針。根據Swabo和Cowan的立體定位的圖 (1984)確定的立體定位的坐標如下尾狀核位點[AP+19mm，ML士6mm，DV-14mm，距離竇]，殼核位點1[AP :+19讓，ML 士 12讓，DV :_17讓，距離立體定位的零點]；殼核位點2[AP :+17mm, ML ± 13mm, DV :-16mm，距離竇]。興奮性毒素以0. 1 μ L/分鐘的速率注射，注射器再留在原位5分鐘，以避免毒素的回流。整個手術過程中，靈長類溫度保持為正常溫度(直腸溫度， 360C 士0.6°C，平均值士標準偏差)。在除去針后，縫合皮膚，動物從麻醉中蘇醒，并在完全清醒后返回到它們的籠子中。轉基因小鼠完成了單PS1M146L(PS1)和雙 APP751SLXPS1M146L(APPXPS1)轉基因小鼠的產生和表征，如前所述(Blanchard,V. et al. (2003)Exp. Neurol. 184 :247-263)。在這些動物中，APP在所有的皮質神經元中在Thy-I啟動子調控下以高水平表達。具有M146L突變的人PSl在HMG-CoA還原酶啟動子的調控下表達。發現淀粉樣蛋白荷載的水平在給定年齡非常具有重現性。Sanofi-Aventis提供的單個PSl和雙重APPXPS1小鼠均用于在11-12月齡的PET成像和20-23月齡的放射自顯影。MicroPET掃描和數據采集大鼠和轉基因小鼠在AMPA注射后7日在大鼠和11_12月齡的轉基因小鼠中實施MicroPET成像。在小鼠和大鼠中，麻醉均通過5%異氟烷誘導，然后通過2-2. 5%異氟烷在70% /30% N02/02 中的混合物保持。對于PET掃描，將大鼠的頭部置于自制的與PET采集相容的立體定位框架 (stereotaxic frame)中，將大鼠保持在正常溫度(直腸溫度36. 7士0. 5°C，平均值士標準偏差)。將小鼠置于裝配有允許加熱空氣流的麻醉罩的床上，直腸溫度使用Homeothermic Blanket Control Unit監測。所有成像實驗設計用Concorde Focus 220 PET掃描儀使用 [11C] PKl 1195 ^ [11C]-A 進行。在大鼠中，放射性標記的化合物和未標記的配體使用M量規導管注射入尾靜脈。 放射性標記的化合物伴隨著PET采集的開始注射，未標記的化合物在注射放射性示蹤物后 20分鐘注射。采集PET數據80分鐘。在小鼠中，緊接PET掃描啟動之前，放射性標記的化合物使用觀量規針注射在尾靜脈中。采集PET數據60分鐘。靈長類在注射喹啉酸之前和之后的不同時間點(損傷后M小時，48小時，9天，16天和7 個月)實施成像階段。注射["C]-A，測量腦動力學，接著進行PET 90分鐘。
PET成像前1小時，通過肌內注射氯胺酮/賽拉嗪混合物(15mg/kg/l. 5mg/kg)麻醉動物，并且插管。然后將導管置于隱靜脈中用于放射性示蹤物注射，并且置于股動脈中用于血液采樣。動物通過靜脈內注射丙泊酚(Diprivan 05mg. kg—1. mirT1)保持麻醉。為了確保動物在裝置中的正確定位，將動物的頭部固定在自制的立體定位框架中。PET掃描使用高分辨的Focus micro-PET(CTI-Siemens,Knoxville,TN)進行，其同時采集95個鄰接平面。對于衰減校正，透射掃描首次使用68Ge旋轉棒源(rotating rod source) 進行。向短尾猴經靜脈內注射192. 士33.67MBq的["C]-A，采集進行90分鐘。所有PET 采集在列表模式(3D模式)進行，使用下列時間框架重建圖像 個圖像，2 ) + 個圖像， 30s) +O個圖像，1分鐘)+ (5個圖像，2分鐘)+ (3個圖像，5分鐘)+ (3個圖像，10分鐘)和 (1個圖像，15分鐘)，對于[11CJ-A總計90分鐘。成像分析PET 成像分析使用 ASIftO VM (CTI Concorde Microsystems'Analysis Tools 和 System Setup/Diagnostics Tool)禾口Brainvisa/Anatomist(http://brainvisa. info/)進行。大鼠血液和腦中的代謝產物分析向對照(native)的或手術過的(operated)成年雄性Wistar大鼠(體重 300-400g)的尾部靜脈經靜脈內注射["C]-A.。在10、20或30分鐘后處死動物。收集血液樣品，通過離心(5min，3000rpm)分離血漿。通過添加400 μ L的乙腈，血漿蛋白從400 μ L 血清中析出。離心(5分鐘，3000rpm)后，將上清液注射至HPLC柱上。除去大鼠腦，分離半球。超聲勻化在每半球ImL乙腈中進行。在快速離心后，將上清液與團塊分離并在減壓條件下濃縮，然后注射至HPLC上(參見HPLC條件的放射性化學部分)。放射自顯影["C]_A放射自顯影使用來自大鼠(損傷后7-8天)或小鼠Q0-23個月)的 20 μ m腦切片進行。非特異性結合使用過量的未標記HQ1195或A進行評估。PBR對中樞苯并二氮雜革結合位點的特異性通過使用過量的未標記氟馬西尼進行評估。切片在 Tris Buffer (TRIZMA pre-set Crystals, Sigma ,于 4°C 調節在 pH 7· 4，50mM，含 NaCl 120mM)中培育20分鐘，然后用冷的緩沖液漂洗2次每次2分鐘，接著在冷的蒸餾水中快速洗滌。然后，將切片置于與Wiosphor-Imager屏直接接觸并暴露過夜。放射自顯影圖使用 ImageQuant 軟件分析。實施例1[11C]PKl 1195放射合成[11C]PKl 1195的最終HPLC純化在半制備型Waters Symmetry C-18 HPLC 柱上進行(洗脫液水 / 乙腈/TFA :40/60/0. 1 [ν ν ν]；流速 7mL/分鐘)，收集對應放射性化學純的[nC]PK11195的峰(Rt :6. 5-7. 0分鐘)。通常，從 55. 5GBq[nC]C02回旋加速器生產批量(cyclotron production batch)開始，在30分鐘的放射合成(包括HPLC純化和配制)得到約4. 5-5. OGBq的[nC]PK111950放射性化學物質純度(通過分析型HPLC在Waters Symmetry-M C-18柱上確定)大于95%，并且比放射活性(specific radioactivity)范圍為50至90GBq/μ mol (在放射合成結束時)。實施例2["C]_A放射合成(在N-甲基吲哚官能團處標記)[11C]-A的最終HPLC純化在半制備型hrbax SB-C-18 HPLC柱上進行(洗脫液0. 9% NaCl水溶液/EtOH/lM磷酸鹽緩沖水溶液(pH 2，3) =50/50/0. 1 [ν ν ν]；流速6mL/分鐘)，收集對應于放射性化學純的[11CJ-A的峰(Rt 8. 0-8. 5分鐘)。通常，從55. 5GBq[nC]C02回旋加速器生產批量開始， 在25分鐘的放射合成(包括HPLC純化和配制)內得到約4. 5-6. OGBq的[11Cj-A0放射性化學物質純度(通過分析型HPLC在Waters Symmetry-M C_18柱上確定)大于95%，并且比放射活性范圍為50至90GBq/ μ mol (在放射合成結束時)。實施例3["C]_A放射合成(在N，N-二甲基乙酰胺官能團處標記)["C]-A的最終 HPLC純化在半制備型SymmetryI3I^p C-18 HPLC柱上進行(洗脫液水/乙腈/TFA 50/50/0. 1 [ν ν ν]；流速5mL/分鐘)，收集對應于放射性化學純的["C]-A(Rt: 8. 0-8. 5分鐘)的峰。通常，從55.568(1[11(]0)2回旋加速器生產批量開始，在25分鐘的放射合成(包括HPLC純化和配制)內得到約3. 5-5. OGBq的["C]_A。放射性化學物質純度 (通過分析型HPLC在Waters Sy_etry-M C-18柱上確定)大于95%，并且比放射活性范圍為50至90GBq/ μ mol (在放射合成結束時)。實施例4i)4-羥基-A合成。4-羥基-A可以根據W000/44384合成。& 0. 15 (SiO2-TLC (CH2Cl2/MeOH :95/5v ν)). 1H NMR(DMS0-d6) δ 9. 71 (s, 1H) , 7. 94 (s, 1Η)，7. 86 (d, 1Η, J :8· 4Ηζ)，7. 39 (d, 1Η, J :8· 4Ηζ)，7. 32 (d, 2Η, J :8· 8Ηζ)，6. 84 (d, 2Η, J 8. 8Hz)，4· 27(s，3H)，4· 20(s，2H)，3· 16 (s，3H)，2· 84 (s，3H) · 13C 匪 R(DMS0_d6) δ 168. 6 [C], 157. 1 [C]，154. 8 [C]，141. 2 [C]，140. 9 [C]，133. 6 [C]，132. 1 [C]，130. 9 [C]，127. 8 [2. CH]，124. 0[CH]，122. 6 [CH] ,118. 9 [C] ,117. 3 [C]，115. 3[2. CH]，111. 6 [CH]，40. 0 [CH2]， 37. 4 [CH3]，35. 4 [CH3]，32. 0 [CH3].ii) [11C]甲氧基-A放射合成。用碳-11標記以及最終HPLC純化可以如制備 [11C]-A(實施例2/實施例3)的記載使用上面合成的A的4-羥基衍生物(實施例4i)進行。實施例5合成(氟)烷氧基-A和甲苯磺酰基氧基烷氧基-A的一般方法。向！^⑶^川！!^， 0. 73mmol)在無水DMF(8_12mL)中的懸浮液中加入在無水DMF^nL)中的A的4-羥基衍生物 (150mg,0. 36mmol，參見W000/44384)溶液。室溫攪拌反應混合物30分鐘，接著逐步加入在 DMF(2mL)中的合適的烷基化試劑O當量)溶液。在70°C攪拌全部混合物2小時，并在室溫再攪拌另一小時。然后混合物通過添加飽和的NH4Cl水溶液中止，并用CH2Cl2萃取。合并有機層，并用鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并濃縮至干。殘余物通過硅膠柱色譜法(CH2Cl2/ MeOH 98 2至95 5v/v作為洗脫液)純化，得到預期的(氟)烷氧基_A，為白色粉末或白色蓬松固體。實施例6甲氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例幻和甲基碘得到目標化合物，產率 40 %。& :0. 35(Si02-TL(^CH2Cl2/Me0H :95/5v ν))。1H NMR(CDCl3) δ 7. 94(d，1H， J :8. 4Hz)，7. 53 (m, 3H)，7. 33 (dd, 1H, J :8. 4，1· 6Ηζ)，7. 00 (d, 2Η, J :8· 8Ηζ)，4. 32 (s, 3Η)， 4. 18(s，2H)，3. 86(s，3H)，3. 22(s，3H)，3. 00(s，3H). 13C 匪R(CDCl3) δ 168. 4[C]，158. 9[C]，155. 3 [C], 141. 6 [C]，140. 1 [C], 134. 6 [C]，133. 2 [C], 131. 3 [C], 127. 3 [2. CH], 123. 3 [CH]， 123. 0 [CH]，119. 0 [C]，117. 4 [C]，113. 9[2. CH]，110. 6[CH] ,55. 5 [CH3] ,39. 6 [CH2]， 37. 6 [CH3]，35. 7 [CH3] ,31. 6 [CH3].實施例7氟乙氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例幻和2-氟乙基-4-甲基苯磺酸酯(根據 Damont A. et al. (2008) J. label. Compds Radiopharm. 51 :286-292 合成)，得到目標化合物，產率 63%。Rf 0. 38 (SiO2-TLC (CH2Cl2/MeOH :95/5v ν)). 1H NMR(CD2Cl2) δ 7. 89 (d, 1H, J :8. 8Hz)，7. 58 (d, 1H, J :1. 6Hz)，7. 54 (d, 2H, J :9. 2Hz)，7. 34 (dd, 1H, J :8. 8， 1. 6Hz)，7. 03 (d, 2H, J :9. 2Hz)，4. 78 (dt, 2H, J2H_F :47. 6，J3H_H :4. 0Hz)，4. 32 (s, 3H)，4. 27 (dt, 2H, J3h_f :28. 4Hz, J3m :4. 0Hz)，4· 16(s，2H)，3· 19(s，3H)，2· 96(s，3H). 13C NMR(CD2Cl2) δ 168. 2 [C], 157. 6 [C]，155. 1 [C]，141. 3 [C], 140. 7 [C]，140. 3 [C], 135. 4 [C], 132. 8 [C]， 127. 4[2· CH]，123. 2 [CH]，122. 6 [CH] ,118. 9 [C] ,117. 2 [C] ,114. 3[2· CH] ,110. 7 [CH]， 82. 0[d, J1c-F :169Hz，CH2] ,67. 5[d, J2C_F :20Hz，CH2], 39. 5 [CH2], 37. 4 [CH3], 35. 2 [CH3]， 31. 6[CH3]. C23H22ClFN4O3. 0. 15H20 的分析計算值:C，60. 11，H，4. 89，N, 12. 19，測量值C， 60. 00，H, 4. 96，N, 12. 18。實施例8氟丙氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例幻和3-氟丙基-4-甲基苯磺酸酯， 得到目標化合物，產率 58%。:0. 39(Si02-TLC(CH2Cl2/Me0H :95/5v ν))。1H 匪 R(CD2Cl2) δ 7. 89 (d, 1H, J :8. 4Hz)，7. 58 (d, 1H, J :1. 6Hz)，7. 52(d，2H，J :9. 2Hz)，7. 34 (dd, 1H, J 8. 4，1. 6Ηζ)，7· 01 (d，2H，J :9· 2Ηζ)，4· 67(dt，2H，J2H_F :46. 8Hz, J3H_H :6. OHz)，4· 31 (s, 3Η)，4· 16(m，4H)，3· 19(s，3H)，2· 96(s，3H)，2· 20(dq5，2H，J3H_F :26. OHz, J3H_H :6. 0). 13C NMR (CD2Cl2) δ 168. 2 [C], 158. 0 [C], 155. 1 [C], 141. 3 [C]，140. 3 [C], 135. 0 [C], 132. 8 [C]， 131. 3 [C]，127. 3 [2. CH]，123. 2[CH]，122. 5[CH] ,119. 0[C]，117. 2 [C] ,114. 2[2· CH]， 110. 7[CH] ,80. 8[d, JVf :163Hz，CH2]，63. 9 [d，J3C_F :6.0Hz，CH2], 39. 5 [CH2], 37. 4 [CH3], 35. 2 [CH3] ,31. 5 [CH3]，30. 3 [CH2, J2C_F :20. OHz]。實施例9氟丁氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例幻和4-氟丁基溴得到目標化合物， 產率 70%。Rf 0. 40 (SiO2-TLC (CH2Cl2/MeOH :95/5v ν)). 1H NMR(CD2Cl2) δ 7. 90 (d, 1H, J 8. 8Hz)，7. 58 (d, 1H, J :1. 6Hz) ,7. 51 (d, 2H, J :9. 2Hz)，7. 34 (dd, 1H, J :8. 8，1. 6Hz)，6. 99 (d, 2H, J :9. 2Hz)，4. 54(dt，2H，J2H_F :47. 2Hz, J3H_H :5. 6Hz)，4. 33(s，3H)，4. 16(s，2H)，4. 08 (t, 2H, J :5. 6Hz) ,3. 19(s，3H)，2. 96(s，3H)，1. 97-1. 85(m，4H). 13C NMR(CD2Cl2) δ 168. 2 [C]， 158. 2 [C]，155. 1 [C]，141. 3 [C]，140. 2 [C], 134. 9 [C]，132. 8 [C]，131. 4 [C]，127. 3 [2. CH]， 123. 2[CH]，122. 5 [CH] ,119. 0 [C] ,117. 2 [C] ,114. 2 [2. CH] ,110. 7[CH] ,83. 8[d, J1c^f 163Hz, CH2] ,67. 6 [CH2] ,39. 5 [CH2] ,37. 4 [CH3] ,35. 2 [CH3] ,31. 5 [CH3] ,27. 1 [CH2, J2C_F 20. OHz]，25. 1 [CH2, J3C_F :5. OHz]。實施例102-(氟乙氧基)乙氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例幻和2-(2-氟乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯，得到目標化合物，產率69%。45 (SiO2-TLC (CH2Cl2/ 丙酮80/20v v)). 1H NMR(CD2Cl2) δ 7. 91 (d, 1H, J 8. 4Hz) ,7. 60 (d, 1H, J 1. 6Hz),7. 54 (d, 2H, J 8. 8Hz)，7. 36 (dd, 1H, J 8. 4，1. 6Hz)，7. 04 (d, 2H, J 8. 8Hz)，4. 61 (dt,2H, J2h_f :48. 0Hz, J3m :4. 0Hz) ,4. 34(s，3H)，4. 22(t，2H，J :4· 8Ηζ)，4· 17 (s，2Η)，3· 91 (t，2Η，J 4. 8Hz)，3. 83 (dt,2H, J3H_F :30. 0，J3H_H :4. 0Hz)，3. 21 (s, 3H)，2. 98 (s, 3H). 13C 匪IUCD2Cl2) δ 168. 2 [C]，157. 9 [C]，155. 1 [C]，141. 3 [C]，140. 3 [C]，135. 1 [C]，132. 8 [C]，131. 4 [C]， 127. 3[2. CH]，123. 2 [CH]，122. 5 [CH] ,119. O [C] ,117. 2 [C] ,114. 3[2. CH] ,110. 7 [CH]， 83. 2[d, J1c-F 167Hz, CH2] ,70. 4 [d, J2C_F :19Hz，CH2] ,69. 7 [CH2], 67. 8 [CH2], 39. 5 [CH2]， 37. 4 [CH3]，35. 2 [CH3] ,31. 6 [CH3]。實施例112- -(氟乙氧基)乙氧基)乙氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例 5)和242-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯，得到目標化合物，產率 63 V0o Rf :0· 32 (SiO2-TLC (CH2Cl2/ 丙酮80/20v v))。1H NMR(CD2Cl2) δ 7. 91 (d，1Η， J :8. 8Ηζ)，7· 60 (d, 1H, J :1. 6Hz)，7· 54(d，2H，J :8. 8Hz)，7· 36 (dd, 1H, J :8. 8，1. 6Hz)， 7. 04(d，2H，J :8. 8Hz)，4. 57(dt，2H，J2H_F :47. 6Hz, J3H_H :4. 4Hz)，4. 33(s，3H)，4. 21 (t，2H， J :4. 4Hz)，4. 17(s，2H)，3. 88(t，2H，J :4. 8Hz)，3. 80-3. 65(m，6H)，3. 21 (s，3H)，2. 98 (s， 3H). 13C NMR(CD2Cl2) δ 168. 2 [C]，158. 0 [C]，155. 1 [C]，141. 3 [C]，140. 3 [C]，135. 1 [C]， 132. 8 [C], 131. 4 [C]，127. 3 [2. CH]，123. 2 [CH]，122. 5 [CH], 119. 0 [C] ,117. 2 [C], 114. 3 [2. CH], 110. 7 [CH]，83. 2 [d, /C_F 167Hz，CH2]，70. 7 [CH2]，70. 6 [CH2]，70. 3 [d, J2C_F :19Hz，CH2]， 69. 6 [CH2]，67. 8 [CH2]，39. 5 [CH2]，37. 4 [CH3]，35. 2 [CH3] ,31. 6 [CH3]。實施例12甲苯磺酰基氧基乙氧基-A合成。使用上述一般方法(實施例5)和乙烷-1，2-二基二 (4-甲基苯磺酸酯)(根據 Damont A. et al. (2008) J. label. Compds Radiopharm. 51 286-292 合成)，從而得至Ij 目標化合物 45 % 產率。Rf :0. 72 (SiO2-TLC (CH2Cl2/MeOH 95/5v v)). 1H NMR (CD2Cl2) δ 7. 89 (d, 1H, J :8. 8Hz)，7. 84 (d, 2H, J :8. 4Hz)，7. 60 (d, 1H, J 1. 6Hz)，7. 53 (d, 2H, J :8. 8Hz)，7. 41 (d, 2H, J :8. 4Hz)，7. 36 (dd, 1H, J :8. 8，1. 6Hz) ,6. 91 (d, 2H, J :8. 8Hz)，4. 40 (t, 2H, J :4. 4Hz)，4. 32 (s,3H)，4. 22 (t,2H, J :4. 4Hz)，4. 17 (s,2H)， 3. 21 (s, 3H), 2. 98 (s, 3H), 2. 48 (s, 3H). 13C NMR (CD2Cl2) δ 168. 1 [C]，157. 2 [C]，155. 0 [C]， 145. 2 [C]，141. 2 [C]，140. 3 [C], 135. 5 [C]，132. 8 [C]，132. 7 [C]，131. 3 [C]，129. 9[2. CH]， 127. 9[2. CH]，127. 4[2. CH]，123. 2 [CH]，122. 6 [CH]，118. 9[C]，117. 2 [C]，114. 4[2. CH]， 110. 7 [CH]，68. 3 [CH2]，65. 8 [CH2]，39. 5 [CH2]，37. 4 [CH3]，35. 2 [CH3] ,31. 6 [CH3] ,21. 3 [CH3]。甲苯磺酰基氧基丙氧基-A、甲苯磺酰基氧基丁氧基-A、2_(甲苯磺酰基氧基乙氧基)乙氧基-A和2-(甲苯磺酰基氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基-A作為用于使用氟-18 標記上述氟烷氧基-A衍生物的前體，它們可以用合適的烷基化試劑正如上所述制備。實施例13[18F]氟乙氧基-A放射合成[18F]氟乙氧基-A的最終HPLC純化在半制備型 Symmetry C-18 HPLC 柱上進行(洗脫液水 / 乙腈/TFA :60/40/0. 1 [ν ν ν]；流速 5mL/min)，收集對應于放射性化學純的[18F]氟乙氧基-A(Rt :11. 0-13. 0分鐘)的峰。從 37GBq[18F]氟化物回旋加速器生產批量(fluoride cyclotron production batch)開始，在 90分鐘的放射合成(包括HPLC純化和配制)內得到約3. 7GBq的[18F]氟乙氧基_A。放射性化學物質純度(通過分析型HPLC在Waters Symmetry-M C-18柱上確定)大于95%，并且比放射活性大于50GBq/ μ mol (在放射合成結束時)。[18F]氟丙氧基-A、[18F]氟丁氧基-A、2-([18F]氟乙氧基)乙氧基-A和2_(2_([18F] 氟乙氧基)乙氧基)乙氧基-A可以正如上所述的從相應的甲苯磺酰基氧基烷氧基-A衍生物(實施例12)作為氟-18-標記的前體制備。實施例14[11CJ-A的吸收在AMPA-注射的大鼠的受損紋狀體(PBR表達被誘導的區域)中顯著高于完整對側紋狀體，后者預期不表達或只表達非顯著量的PBR(圖1)。["C]-A的吸收在受損紋狀體中也顯著高于參照PBR PET配體["C]PK11195觀察到的吸收(圖1)。關于在受損的紋狀體對完整的紋狀體中的吸收比，["C]-A也顯著高于["(]冊11195(圖2)。關于結合能力和 Rl, [11CJ-A 也顯著高于[11C]PKl 1195 (BP = 1. 65士0. 36 對(vs)0. 66士0. 15 ； Rl = 1. 26 士 0. 08 對 1. 10 士 0. 05)。未標記的1195(圖3)和A (圖4) (lmg/kg經靜脈內；[11C]-A注射后20分鐘) 顯著減少["C]-A在受損紋狀體中的腦吸收。未標記化合物誘導了 [11C]-A結合在對側的少量增加，這可能是由于因[11C]-A從腦外結合位點釋放引起的[11C]-A的血液濃度的增加。在注射["C]_A后10和20分鐘存在于大鼠血液和血漿中的代謝產物的分析，以及在注射["C]_A后10、20分鐘和30分鐘存在于大鼠腦中的代謝產物的分析基本上僅檢測到母體化合物(圖10)。此外，["C]_A結合在腦切片的放射自顯影反映了具有高的同側與對側比值(3.8) 的成像結果，該比值通過過量的未標記的HQ1195或A消除(圖5)。在使用未標記的氟馬西尼，苯并二氮雜革拮抗劑時，觀察到少量但是顯著減少的["C]-A結合(圖5)。實施例15在APPXPS1和野生型PSl轉基因小鼠中，["C]_A在整個腦中的吸收(排除小腦)高于[11CpKlll95的吸收(圖6)。但是，在APPXPS1對野生型PSl中，["C]-A和 [nC]PK11195的吸收均不是顯著較高。與此相反，在來自APPXPS1小鼠的整個腦切片中的 [3HJ-A結合的特異性為來自野生型PSl小鼠的約2倍(圖7)。這些數據顯示了，在大鼠神經炎癥的急性模型和在阿爾茨海默病的小鼠模型中， ["C]-A可以特異性檢測增加的PBR結合和炎癥。體內PET成像證實了，["C]-A可以用來在嚙齒動物中成像PBR受體過表達和神經炎癥。此外，通過使用[11C]-A的PET成像觀察到的PBR受體結合大于用參照PBR受體PET配體["C]PK11195觀察到的結合。實施例16在注射興奮性毒素后M小時，在注射喹啉酸的靈長類的受損右紋狀體中["C]_A 的吸收顯著高于在對側未注射的紋狀體和兩個未注射的對照腦區域(小腦、前額皮質)中的[11C]-A的吸收(圖8)。在對側未注射的紋狀體中的[11C]-A吸收保持穩定，且與未注射靈長類的腦區域中的["C]_A吸收水平相同(圖8)。["C]-A吸收的增加在注射興奮性毒素后48小時仍然可見(在左半球)，而在興奮性毒素注射后7個月的[11C]-A吸收(7個月之前受損的右紋狀體中的動力學)已經回到基線水平。神經炎癥早期的更詳細的表征顯示增加的["C]_A吸收可以從M小時至16天可見(圖9)。在注射放射性示蹤劑后30分鐘，全身給藥大量過量的未標記HQ1195導致["C]-A結合在受損紋狀體中的特異性取代 (displacement)，而在非受損對照腦區域中沒有觀察到顯著的改變(圖9)。
應用本發明可以用作診斷工具，以及作為跟蹤病理的演化和進展的工具，在該病理中 PBR水平發生改變并且存在炎癥。本發明還可以應用于受體占有率研究，并用來評估在病理狀況中的治療性治療的功效，以及作為翻譯性生物標志物用于動物模型至人的研究。
權利要求
1.放射性標記的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4， 5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物在個體內檢測與正常狀況和病理狀況相關的PBR水平的用途，其中所述放射性標記選自碳-11、放射性鹵素和放射性金屬。
2.根據權利要求1的用途，其中7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用碳-11進行放射性標記。
3.根據權利要求1和2的用途，其中7-氯-N，N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并W，5-b]叼丨哚-1-乙酰胺用碳-11在位于吲哚核5位的甲基碳上進行放射性標記。
4.根據權利要求1的用途，其中7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性鹵素進行放射性標記。
5.根據權利要求1或4的用途，其中7-氯-N，N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用放射性鹵素氟-18進行放射性標記。
6.根據權利要求1或5的用途，其中7-氯-N，N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用氟-18在3-苯基環的對位上進行放射性標記。
7.根據權利要求1-6的用途，其中所述PBR水平和炎癥的檢測通過PET成像(正電子放射斷層掃描術)或SPECT成像(單光子發射計算機斷層掃描術)進行。
8.根據權利要求1-7的用途，其中所述PBR水平和炎癥的檢測通過PET成像(正電子放射斷層掃描術)進行。
9.根據權利要求1-8的用途，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自腦損傷、腦感染和神經疾病。
10.根據權利要求1-8的用途，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自精神疾病。
11.根據權利要求1-8的用途，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自增殖性疾病。
12.根據權利要求1-8的用途，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自外周炎性過程。
13.根據權利要求1-8的用途，其中PBR水平的檢測用于占有率研究。
14.根據權利要求1-8的用途，其中PBR水平的檢測用于評估治療性治療的功效。
15.檢測與正常狀況相關的PBR水平和與病理狀況相關的PBR水平變化的方法，其中所述檢測使用放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并W，5-b]吲哚-1-乙酰胺進行，其中所述放射性標記選自碳-11、放射性鹵素和放射性金屬。
16.根據權利要求15的方法，其中所述放射性標記形式的7-氯-N，N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-I-乙酰胺包含碳-11。
17.根據權利要求15-16的方法，其中7-氯-N，N,5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并W，5-b]叼丨哚-1-乙酰胺用碳-11在位于吲哚核5位的甲基碳上進行放射性標記。
18.根據權利要求15的方法，其中7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用氟-18進行放射性標記。
19.根據權利要求15的方法，其中7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺用氟-18在3-苯基環的對位上進行放射性標記。
20.根據權利要求15-19的方法，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自腦損傷、腦感染和神經疾病。
21.根據權利要求15-19的方法，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自精神疾病。
22.根據權利要求15-19的方法，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自增殖性疾病。
23.根據權利要求15-19的方法，其中與PBR水平變化相關的病理狀況選自外周炎性過程。
24.根據權利要求15-19的方法，其中PBR水平的檢測用于占有率研究。
25.根據權利要求15-19的方法，其中PBR水平的檢測用于評估治療性治療的功效。
26.用于檢測與正常狀況相關的PBR水平和與病理狀況相關的PBR水平變化的診斷試劑盒，其包含放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5- 二氫-4H-噠嗪并[4,5-b]吲哚-1-乙酰胺。
全文摘要
本發明提供了放射性標記形式的7-氯-N，N，5-三甲基-4-氧代-3-苯基-3，5-二氫-4H-噠嗪并[4，5-b]吲哚-1-乙酰胺作為生物標志物在個體內檢測與正常狀況和病理狀況相關的PBR水平的用途。還提供了檢測與正常狀況和病理狀況相關的PBR水平的方法。并提供了診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/60GK102223899SQ200980143233
公開日2011年10月19日 申請日期2009年10月27日 優先權日2008年10月28日
發明者伯特蘭·塔維蒂安, 克里爾·托米尼奧克斯, 盧克·里夫龍, 安妮勞爾·達蒙特, 弗蘭克·瑪格特, 弗雷德里克·多爾, 托馬斯·魯尼, 杰瑟斯·貝納維德斯, 菲利普·漢特拉耶, 赫維·布廷, 馬里-諾埃爾·卡斯特爾 申請人:原子能和代替能源委員會, 賽諾菲-安萬特