專利名稱：：一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法
技術領域：
：本發明涉及一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，屬于蛋白檢測方法
技術領域：
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背景技術：
：Birc6(baculoviralInhibitorofApoptosis(IAP)repeat-containing6)被認為是一種抗凋亡蛋白，其基因位于染色體2p22-21。目前birc6的主要檢測方法包括蛋白免疫印記法、酶聯免疫吸附法，它們的缺點是耗時、費力，靈敏度不夠高，不適于大規模樣本的篩選。
發明內容本發明的目的是克服上述問題，提供一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法。為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，其特征在于，具體步驟為第一步采取人全血，4攝氏度下凝固1小時，離心，取上層血清，保存在-80攝氏度冰箱中，將弱陽離子交換磁珠或免疫金屬親和銅離子磁珠與磁珠結合液在薄壁PCR管中混合，加入血清樣本，室溫孵育5min，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，移去上清，將所剩磁珠用磁珠洗滌液洗滌后，加入磁珠洗脫液，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，得到洗脫液，將洗脫液與磁珠穩定液混合得到磁珠富集液；第二步將第一步得到的磁珠富集液加入基質溶液，按以下條件進行基質輔助激光解離電離飛行時間質譜檢測第一離子源電壓20kv;第二離子源電壓18.6kv;晶體電壓7.6kv;脈沖離子時間320ns;極性正；矩陣抑制模式門控；門控強度最大；抑制高限600Da;檢測器:1400-1500v;樣本率1.00Gs/s;電子獲取:增強，100mv;實時流暢高;激光頻率20Hz;激光衰減關73%，范圍20%;峰檢測標準信噪比大于5，2Da峰寬過濾，最多峰數200;第三步分析第二步得到的質譜圖，觀察質譜圖中質荷比為4964±1處是否有峰，若有峰，則血清中含有Bicr6蛋白。本發明的優點為本發明選用快速而敏感的基質輔助激光解離電離飛行時間質譜來檢測血清birc6，屬于蛋白質組學研究范疇，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜在發現和鑒定疾病相關的蛋白或多肽方面是一個非常有效的工具，已經被用來尋找多種疾病特異性標志，該技術聯合磁性微粒富集血清蛋白的方法更加快速、有效和精確。這種以磁性微粒為基礎的高敏感性和可重復性技術讓其在蛋白組學研究領域獨樹一幟。本方法每次檢測只需要數十分鐘的時間，完成了血清birc6蛋白的富集和檢測，相對于傳統的蛋白免疫印記法、酶聯免疫吸附法(耗時8小時以上)操作簡單、省時，便于大批量樣本的檢測；因不依賴生物化學反應而不受反應條件的諸多限制，重復性高；另外傳統方法的檢測靈敏度為微克級，而本方法的檢測靈敏度達納克級，顯著高于傳統的方法。圖1為一份經過磁珠富集后的人血清質譜檢測圖。具體實施例方式下面結合實施例來具體說明本發明。實施例1.主要試劑弱陽離子交換磁珠MB-WCX試劑盒(BrukerDaltonikGmbH，德國)，免疫金屬親和銅離子磁珠MB-IMACCu試劑盒(BrukerDaltonikGmbH，德國)ct-氰基-4-羥基肉桂酸a_Cyano_4_hydroxycinnamicacid(HCCA)(sigma，美國)丙酮(sigma，美國)乙醇(sigma，美國)AnchorChip革巴(BrukerDaltonikGmbH，德國)2.耗材和儀器真空采血管(BDVacutainerTM，美國)低溫冰箱(SANYO,日本)渦旋混合儀(H101，上海康禾光電儀器有限公司)恒溫高速離心機(Z400K，HERMLE，德國)磁珠分離器(BrukerDaltonikGmbH，德國)AutoflexII基質輔助激光解離離子時間飛行質譜(BrukerDaltonikGmbH，德國)LC/MS/MS聯用儀(美國應用生物系統公司，上海)其他注射器、E卯endorf管、加樣槍、槍頭等3.生物標本的收集選用BDVacutainerTM真空采血管(黃頭蓋)采取人全血后，4度下凝固1小時，用離心機按3000rpm共10min，取上層血清，保存在E卯endorf管內于-80度冰箱待用。4.血清樣本前處理(1)在渦旋混合儀上將弱陽離子交換MB-WCX磁珠溶液或免疫金屬親和銅離子MB-IMACCu磁珠溶液徹底混勻lmin。(2)10ii1MB-WCX磁珠結合液和10ii1WCX磁珠溶液轉移入一個標準的薄壁PCR管中，上下吹吸混勻。(或用50ii1MB-IMACCu磁珠結合液預處理5y1MB-IMACCu磁珠溶液，將薄壁PCR管放入磁珠分離器，將薄壁PCR管在相鄰孔之間移動10次，聚集磁珠于管壁20s，用槍小心移去上清，重復二次，將MB-IMACCu磁珠重懸于20iUMB-IMACCu磁珠結合液中)。加入5iU人血清樣本，上下吹吸5次，混勻液體。室溫孵育5min。將PCR管置于磁珠分離器內，將管子前后移動3次后，聚集磁珠于管壁lmin，用槍小心移去上清。4向管中加入100ill磁珠洗滌液，將PCR管在磁珠分離器內前后來回移動IO次，注意磁珠的移動。聚集磁珠于管壁上20s，用槍小心移去上清。重復本步驟兩次。加入5ii1MB-WCX磁珠洗脫液(或10MB-IMACCu磁珠洗脫液)，通過強烈的上下吹吸10次將磁珠從管壁上溶解下來，等待5min。將管子放入磁珠分離器，在管壁上聚集磁珠2min，將含有洗脫分子的上清轉移進一個干凈的管子中。向洗脫液中加入4iU磁珠穩定液，上下吹吸強烈混勻。將1ill洗脫的樣品加入101的基質溶液(HCCA溶液，其在乙醇丙酮為2:1的溶液中濃度為0.3g/l)，點1yl到MALDI-TOF質譜靶上。5.質譜條件第一離子源電壓20kv;第二離子源電壓18.6kv;晶體電壓7.6kv;脈沖離子時間:320ns;極性:正;矩陣抑制模式門控；門控強度:最大；抑制高限:600Da;檢測器:1400-1500V;樣本率1.OOGs/s;電子獲取增強，lOOlW;實時流暢高；激光頻率20Hz;激光衰減關73%，范圍20%。峰檢測標準信噪比大于5，2Da峰寬過濾，最多峰數200。6.結果分析如圖1所示，為一份經過磁珠富集后的人血清質譜檢測圖，分析如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上表中質荷比為4963.46處的峰即為Birc6蛋白的峰。7.標志物的進一步鑒定磁珠富集液用液相色譜質譜質譜聯用儀進行鑒定，用MASCOT程序對質譜數據進行在線的國際蛋白參數(InternationalProteinIndex,IPI)數據庫(http://www.ebi.ac.uk)查詢。其中，液相色譜_質譜/質譜設備由二個LC-20AD的納米流液相色譜泵、一個SIL-20AC自動進樣器、LC-20AB微流液相色譜泵連接LTQ-Orbitrap質譜構成。樣本裝填于CAPTRAP柱，流速50ul/分，3分鐘后進入C18反相柱進行液相分離，流速500nl/分，流動相為5%乙腈和0.1%甲酸(A相、裝填相)、95X乙腈和0.1%甲酸(B相)，B相線性梯度5%-45%(60分鐘)。分離后的樣本通過ADVANCE30um二氧化硅接口端進入質譜儀，噴霧電壓lkv，溫度18(TC，數據依賴模式，每次完整質譜掃描質量范圍400-2000Da，分辨力100000。肽段在LTQ部分應用氦氣碰撞誘導解離，標化解離能量值35X。帶2+和3+的解離峰被選做質譜/質譜分析。選用BioWorks3.3.1spl軟件對IPI人類蛋白數據庫進行在線搜索，條件2個可能誤差位點，多肽質量偏差允許為10ppm，片段質量偏差允許為1.00Da。質荷比為4964士1的物質峰鑒定為birc6蛋白。權利要求一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，其特征在于，具體步驟為第一步采取人全血，4攝氏度下凝固1小時，離心，取上層血清，保存在-80攝氏度冰箱中，將弱陽離子交換磁珠或免疫金屬親和銅離子磁珠與磁珠結合液在薄壁PCR管中混合，加入血清樣本，室溫孵育5min，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，移去上清，將所剩磁珠用磁珠洗滌液洗滌后，加入磁珠洗脫液，將薄壁PCR管置于磁珠分離器內進行磁珠分離，得到洗脫液，將洗脫液與磁珠穩定液混合得到磁珠富集液；第二步將第一步得到的磁珠富集液加入基質溶液，按以下條件進行基質輔助激光解離電離飛行時間質譜檢測第一離子源電壓20kv；第二離子源電壓18.6kv；晶體電壓7.6kv；脈沖離子時間320ns；極性正；矩陣抑制模式門控；門控強度最大；抑制高限600Da；檢測器1400-1500v；樣本率1.00Gs/s；電子獲取增強，100mv；實時流暢高；激光頻率20Hz；激光衰減關73％，范圍20％；峰檢測標準信噪比大于5，2Da峰寬過濾，最多峰數200；第三步分析第二步得到的質譜圖，觀察質譜圖中質荷比為4964±1處是否有峰，若有峰，則血清中含有Bicr6蛋白。全文摘要本發明提供了一種人血清中腫瘤標記物Bicr6蛋白的質譜篩選方法，其特征在于，具體步驟為取人血清，用磁珠吸附后洗脫得到磁珠富集液；將磁珠富集液加入基質溶液，按以下條件進行基質輔助激光解離電離飛行時間質譜檢測第一離子源電壓20kv；第二離子源電壓18.6kv；晶體電壓7.6kv；脈沖離子時間320ns；極性正；矩陣抑制模式門控；門控強度最大；抑制高限600Da；檢測器1400-1500v；樣本率1.00Gs/s；電子獲取增強，100mv；實時流暢高；激光頻率20Hz；激光衰減關73％，范圍20％；質荷比為4964±1處的峰為Bicr6蛋白。本發明時間短、靈敏度高。文檔編號G01N30/72GK101793882SQ201010105550公開日2010年8月4日申請日期2010年2月4日優先權日2010年2月4日發明者劉韜韜,沈錫中,董玲,薛如意申請人:復旦大學附屬中山醫院