專利名稱：一種使用液相色譜-質譜檢測轉基因大豆中痕量黃酮類代謝物的方法
技術領域：
本發明涉及利用液相色譜-質譜聯用技術檢測轉基因大豆中痕量黃酮類代謝物的方法及黃酮類物質分子印跡聚合物的合成方法。
背景技術：
自抗草甘膦轉基因大豆商品化以來，已經建立了不少的檢測方法，以檢測核酸為目標的各種PCR檢測技術以及PCR快速檢測試劑盒；以檢測外源蛋白為目標的ELISA檢測技術以及酶聯免疫快速檢測試紙條、試劑盒，這些檢測方法都可以為鑒定轉基因作物以及為轉基因作物的環境安全評價提供技術支持。但是自中國2009年批準轉基因水稻和轉基因玉米生產安全證書的釋放，成為第一個批準主糧商業化種植的國家后，對轉基因作物安全性評價、特別是轉基因作物在食品安全性評價方面提出更高的要求。生物信息是按DNA — mRNA—蛋白質一代謝產物方向流動的，代謝物是細胞調控過程的終產物，它們的種類和數量變化被視為生物系統對基因或環境變化的最終響應 (Fiehn, 2002)，轉基因作物均是通過調控基因的表達來控制目的性狀的改變，基因表達上極微小的變化即可導致代謝物種類、含量、分布的大幅改變。因此，對轉基因作物代謝物的分離鑒定，檢測分析可以為生物安全、特別是食品安全相關預警信號提供一個預知平臺。由于植物代謝物在時間和空間都具有高度的動態性(Stitt et al.，2003)，尤其是次生代謝物種類繁多、結構迥異，且產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性，難于進行分離分析，所以人們一直在尋找更為強大的檢測分析工具與方法。對代謝組的分析力求可檢測樣品中的每種代謝物，并可監測各種條件變化下代謝物的變化。 在轉基因產品的食品安全分析上，利用代謝組學工具發現外源基因在目標植物體內表達的相關代謝物標志物可以為轉基因產品在安全性評價方面提供一種新的技術。代謝組學的研究方法與蛋白質組學的方法類似，通常有兩種方法。一種方法稱作代謝物指紋分析(Metabolomic fingerprinting)，采用液相色譜-質譜聯用(LC-MS)的方法，比較不同樣品中各自的代謝產物以確定其中所有的代謝產物。代謝指紋分析涉及比較不同個體中代謝產物的質譜峰，最終了解不同化合物的結構，建立一套完備的識別這些不同化合物特征的分析方法。另一種方法是代謝輪廓分析(Metabolomic profiling)，研究人員假定了一條特定的代謝途徑，并對此進行更深入的研究，再結合模式識別方法，有可能找出與之相關的生物標志物(Biomarker)。用于代謝物檢測的主要技術手段是核磁共振(NMR)，質譜(MS)，色譜(HPLC，GC)。 對于代謝產物來說，不僅只有質譜峰這個特征，由于質譜只能檢測離子化的物質，但有些代謝產物在質譜儀中不能被離子化，因此，質譜(MS)并不能檢測出所有的代謝產物。此外，質譜分析發現，代謝產物的同質性不高，由于缺乏均勻性，使色譜分析變得更加困難，無法識別出樣品中的未知物質。采用核磁共振(NMR)的方法，可以彌補色譜的不足，但由于核磁共振檢測的靈敏度不高，所以只用于分析低豐度代謝產物。因此，對代謝產物的分析最大的挑戰就是對代謝產物的識別以及高效的檢測方法。抗草甘膦轉基因大豆中外源EPSPS基因的表達可能導致黃酮類代謝物在種類以及含量上的差異，我們探索通過分析轉基因與非轉基因大豆間黃酮類代謝物的差異，進而判斷是否是轉基因大豆的技術難點在于如何分離富集大豆中的黃酮，提高檢測的靈敏度和特異性。本發明就是利用可以特異性吸附黃酮的分子印跡聚合物作為分離富集材料，從基質中分離黃酮，并與液相色譜_質譜聯機建立在線檢測方法，實現轉基因大豆中痕量黃酮的準確檢測。
發明內容
利用液質聯用技術痕量檢測轉基因大豆中黃酮類代謝物的方法。1、一種可以檢測轉基因大豆植株中痕量黃酮的液相色譜-質譜聯用檢測方法，其特征在于使用具備對轉基因大豆植株中黃酮類化合物有特異性吸附的分子印跡材料作為填充材料的固相萃取柱與液相色譜-質譜儀在線聯用，實現對轉基因大豆中痕量黃酮的準確檢測。2、黃酮分子印跡材料的制備方法包括下面兩個步驟1)使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑，模板分子、交聯劑和功能單體按照摩爾比例為1 6 9溶解到含水30%的乙醇中，加入引發劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮氣15min，365nm紫外光照射引發聚合12h ；2)反應結束后，產物經過粉碎、過篩，取粒徑大小為80-125 μ m的顆粒，以50mL乙醇和50mL 1. Omol L—1鹽酸的混合溶液攪拌洗滌6h，用體積比為9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，進一步去除模板分子，將除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h， 即可作為固相萃取柱的填充材料；3、分子印跡材料在固相萃取柱中的填料量決定于萃取柱的容量，一般為萃取柱體積的5%，本發明使用容積為2毫升的萃取柱，分子印跡材料填料為10毫克；4、固相萃取柱與流動注射儀的連接方式為將流動注射儀的出樣端與固相萃取柱的進樣端聯接，萃取柱的出樣端與液相色譜進樣口相聯，通過液相色譜分離和質譜檢測可以同時檢測大豆植株中27種黃酮類化合物，具體化合物見下表
權利要求
1.一種可以檢測轉基因大豆植株中痕量黃酮的液相色譜-質譜聯用檢測方法，其特征在于使用具備對轉基因大豆植株中黃酮類化合物有特異性吸附的分子印跡材料作為填充材料的固相萃取柱與液相色譜-質譜儀在線聯用，實現對轉基因大豆中痕量黃酮的準確檢測。
2.權利要求1所述及的黃酮分子印跡材料，其制備方法包括如下步驟1)使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑，模板分子、交聯劑和功能單體按照摩爾比例為1 6 9溶解到含水30%的乙醇中， 加入引發劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮氣15min，365nm紫外光照射引發聚合12h ；2)反應結束后，產物經過粉碎、過篩，取粒徑大小為80-125μ m的顆粒，以50mL乙醇和 50mLl. Omol Γ1鹽酸的混合溶液攪拌洗滌6h，用體積比為9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，進一步去除模板分子，將除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h，即可作為固相萃取柱的填充材料。
3.權利要求1所述及的固相萃取柱其特征在于所使用的分子印跡材料填料為10毫克。
4.權利要求1所述及的檢測方法，其特征在于將固相萃取柱通過流動注射儀與液相色譜_質譜儀連接，可以同時檢測大豆植株中27種黃酮類化合物。
全文摘要
本發明涉及一種準確檢測轉基因大豆中痕量黃酮的液相色譜-質譜聯用檢測方法，其主要的技術要點是使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑，模板分子、交聯劑和功能單體按照摩爾比例為1∶6∶9溶解到含水30％的乙醇中，加入引發劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮氣15min，365nm紫外光照射引發聚合12h，合成分子印跡材料作為固相萃取柱的填充材料，將所制備的固相萃取柱與液相色譜-質譜通過流動注射儀聯接，建立在線檢測方法，實現對轉基因大豆中痕量黃酮的準確檢測。所建立的檢測方法可以為鑒定抗草甘膦轉基因大豆提供一種新的手段。
文檔編號G01N30/02GK102466660SQ20101054558
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者林敏 , 王俊平, 王俊英 申請人:中國農業科學院生物技術研究所