基于液相色譜串聯質譜技術測定多種動物源性肉類的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品檢測技術領域，具體地說，涉及一種基于液相色譜串聯質譜技術 測定多種動物源性肉類的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，肉制品摻假成為全球廣泛關注的食品安全問題。肉類摻假事件多次曝光， 一些不法商販為了謀取不正當利益，以次充好，不法經營者使用相對廉價的鴨肉，雞肉，豬 肉等低價肉類原料替代高價肉如牛肉，羊肉進行銷售。這種摻假行為屬于商業欺詐，擾亂了 市場秩序，同時涉及到民族飲食禁忌等問題，嚴重侵犯了消費者的合法權益，因此建立準 確、高效的肉類摻假的檢測方法具有重要的現實意義。
[0003] 目前，國內外開展肉種鑒別的方法主要包括基于抗體抗原的酶聯免疫技術 (ELISA)、基于核酸的聚合酶鏈反應(PCR)技術等，其中實時熒光PCR方法的應用最為廣泛， 也是現行國家和行業標準中指定的主要方法之一。但ELI SA技術容易受制于抗體的制備，加 工過程蛋白變性，復雜基質導致假陽性;PCR技術容易受到DNA降解，復雜基質的干擾和樣品 提取與擴增方法的影響。
[0004] 隨著生物質譜檢測技術的成熟，大規模的定性和定量研究蛋白表達的技術已經很 成熟。因此，利用質譜技術尋找不同肉類樣品特征多肽，并進行定量，能夠避免復雜基質干 擾及假陽性判別的問題。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種基于液相色譜串聯質譜技術測定多種動物源性肉類的 方法。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明的基于液相色譜串聯質譜技術測定多種動物源性肉 類的方法，包括樣品前處理，各種標準肉樣特征多肽的篩選以及高效液相色譜-質譜聯用檢 測待測肉樣中的特征多肽等步驟。
[0007] 樣品前處理包括以下步驟：
[0008] 1)提取樣品總蛋白：將待測肉樣剪碎或分割成小塊，向2g樣品中加入5mL提取液， 冰水浴均質lmin，再用5mL提取液洗刀頭合并，12000r/min離心20min，取上清液；
[0009] 2)還原及烷基化:取100yL上清液，加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10yL，56°C振蕩 反應lh，放置室溫，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20yL，暗處反應30min，再加入50mmol/L二 硫蘇糖醇溶液15yL，暗處反應15min;
[0010] 3)酶切：向上述反應體系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液750yL，然后 加入20yg胰蛋白酶，調節pH為8.0，37°C反應過夜；向上述酶解液中加入0.4%TFA終止反應， 并加入lmL水，所得溶液用于過柱除鹽；
[0011] 4)過柱除鹽:將步驟3)所得溶液用C18固相萃取柱除鹽，收集洗脫液過0.22μπι濾膜， 準備上機。
[0012] 其中，步驟1)中所述提取液為0 · 05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8·0〇
[0013] 優選地，步驟4)中依次用乙腈、50 %乙腈/水、0.1 % TFA活化C18固相萃取柱，將步驟 3)所得溶液上樣，再依次用0.1 % TFA，0.5 %乙酸清洗，最后用lmL 60 %乙腈+0.5 %乙酸洗 脫。
[0014] 利用Easy nLC 1000液相色譜系統和Q Exactive HF質譜儀檢測并篩選各種標準 肉樣中的特征多肽，具體步驟如下：
[0015] 色譜條件:C18色譜柱內徑75μπι，流動相:A相為0.1%FA(阿魏酸相為0.1%ACN (乙臆）；色譜梯度為:〇111；[11，3%13相；2111；[11，8%13相;48111；[11，22%13相;53111；[11，40%13相；55111；[11， 80%B相;59min，80%B相;61min，0%B相;65min，0%B相，進樣量為10yL，每個樣品至少采集 三次數據。
[0016] 質譜條件:噴霧電壓2100V，毛細管溫度275°C，Full Scan分辨率60000,掃描質量 范圍為350~1600，AGC值為1E6，IT時間為50ms，二級掃描，topN為30，分辨率為15000，AGC值 為 1E5，IT 時間為 60ms，NCE 為 27。
[0017]質譜數據分析：用Maxquant對各種標準肉樣進行非標記定量分析，檢索Uniprot數 據庫，最多漏切位點設為2,可變修飾為Oxidation(Methionin)，Acetylation(Protein N-七61'111)，固定修飾為〇31^^11^(1〇11161：1171(〇5^丨6；[11；[116);選擇異亮氨酸等于亮氨酸設置(1=0， peptide for quant i tat ion選擇all，其他參數為默認值;利用非標記定量的結果，選取每 個物種中獨有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，獲得相對特異性多肽，即各種 標準肉樣的特征多肽。
[0018] 高效液相色譜-質譜聯用檢測待測肉樣中的特征多肽，并與標準肉樣的特征多肽 進行比較，從而判定對應的肉樣組分，具體步驟如下：
[0019] 液質聯用三重串聯四極桿質譜儀(TSQ ultra EMR)進行檢測：
[0020] 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD Ci8(2 · 1mm X 100mm，1 · 9μηι);流速0 · 2mL/min;柱 溫40 °C，進樣量50yL;流動相:A相0.1 %FA/H20，B相0.1 %FA/ACN，色譜梯度為:0~0.2min， 3% ~10%B;0.2 ~16min，10% ~40%B;16 ~17min，40% ~80%B;17.5 ~18.5min，80% ~ 3%B〇
[0021 ]質譜條件:噴霧電壓3500V;鞘氣38Arb;輔氣15Arb;離子傳輸管溫度275°C ;離子源 霧化溫度380°C ;傳輸線溫度275°C ;離子源溫度380°C ;采集周期為0.3s;碰撞氣為 1.5mTorr; Q1和Q3分辨率均為0.7。
[0022] 通過對每個物種的特征多肽進行母離子掃描以及SRM掃描，根據保留時間，多個定 性離子匹配以及豐度信息，最終判定對應的肉樣組分。
[0023] 前述的方法，所述待測肉樣來自豬肉、雞肉、牛肉、鴨肉、羊肉、驢肉、兔肉、馬肉等。
[0024] 采用本發明方法獲得的不同動物源性肉類的特征多肽，羊肉、鴨肉、牛肉、豬肉、雞 肉的多肽信息分別如表1所示。
[0025] 表1羊肉、鴨肉、牛肉、豬肉、雞肉的特征多肽信息
[0029] 本發明基于高效液相色譜-質譜聯用技術建立了一種特征性多肽識別方法，從而 實現對多種動物源性肉類成分的鑒別，該方法充分發揮液質質譜強大的掃描功能，通過監 測選擇離子監測模式實時采集信號，利用二級子離子強度觸發，采集對應母離子二級碎裂 全掃描譜圖，獲得更確切的定性信息的功能，避免復雜基質的干擾，降低假陽性概率。其優 點在于：
[0030] ( - )通過SRM掃描方式，可以同時準確定性多種物種來源的肉類。
[0031] (二)測定不同物種的前處理步驟相同，簡化了處理過程，便于批量樣品的操作。
[0032] (三)該方法測定的多肽鏈即使在復雜的肉類加工過程中也不會發生變性，確保準 確性。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發明實施例1中鴨肉的總離子流圖和提取離子流圖。
[0034] 圖2為本發明實施例1中羊肉的總離子流圖和提取離子流圖。
【具體實施方式】
[0035]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0036] 實施例1基于液相色譜串聯質譜技術測定多種動物源性肉類的方法
[0037] 包括以下步驟：
[0038] 1、樣品前處理：
[0039]標準肉樣:分別稱取鴨肉2g，羊肉2g;混合肉樣:稱取鴨肉0.1鴨肉和1.9g羊肉。按 下列步驟進行前處理。
[0040] 總蛋白提取：加入提取液（0 · 05mol/L Tris-HCl，7mol/L尿素，2mo 1/L硫脲，pH 8.0)，冰水浴均質lmin，再用5mL提取液洗刀頭合并，12000r/min離心20min。
[0041 ] 還原及烷基化:吸取100yL上清液，加入10yL的二硫蘇糖醇溶液(50mmol/L)，56°C 振蕩反應lh。放置室溫，加入20yL的碘乙酰胺溶液（100mm〇l/L)，暗處反應30min。再加入15μ L的二硫蘇糖醇溶液(50mmol/L)，暗處反應15min。
[0042] 酶切：加入750yL 25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液，加入20yg胰蛋白酶，調節 pH為8.0,37 °C反應過夜。
[0043] 過柱除鹽:放置室溫后，加入0.4%TFA終止反應，并加入lmL水，所得溶液用于過柱 除鹽。依次用乙腈、50%乙腈/水、0.1 %TFA活化C18固相萃取柱除鹽，上樣，再依次用0.1 % TFA，0.5 %乙酸清洗，最后用lmL 60 %乙腈+0.5 %乙酸洗脫，過0.22μπι濾膜，準備上機。
[0044] 2、鴨肉、羊肉標準肉樣特征多肽的篩選：
[0045] 利用Easy nLC 1000液相色譜系統和Q Exactive HF質譜儀檢測并分別篩選鴨肉、 羊肉標準肉樣中的特征多肽，具體步驟如下：
[0046] 色譜條件:C18色譜柱內徑75μπι，流動相:A相為0.1 % FA; B相為0.1 % ACN;色譜梯度 為：0min，3%B 相；2min，8%B 相；48min，22%B 相；53min，40%B 相；55min，80%B 相；59min， 80%8相;6111^11，0%8相;651^11，0%8相，進樣量為1(^，每個樣品采集三次數據。
[0047] 質譜條件：噴霧電壓2100V，毛細管溫度275°C，Full Scan分辨率60000,掃描質量 范圍為350~1600，AGC值為1E6，IT時間為50ms，二級掃描，topN為30，分辨率為15000，AGC值 為 1E5，IT 時間為 60ms，NCE 為 27。
[0048]質譜數據分析：用Maxquant分別對鴨肉、羊肉標準肉樣進行非標記定量分析，檢索 Uniprot數據庫，最多漏切位點設為2，可變修飾為Oxidation(Methionin)，Acetylation (Protein N-term)，固定修飾為Carbamidomethyl(Cysteinine);選擇異亮氨酸等于亮氨酸 設置（I = U，peptide for quantitation選擇all，其他參數為默認值;利用非標記定量的 結果，選取每個物種中獨有的多肽信息，去掉含有Miss Cleavage的多肽，獲得相對特異性 多肽，即鴨肉、羊肉標準肉樣中的特征多肽。
[0049] 高效液相色譜-質譜聯用檢測混合肉樣中的特征多肽，并與鴨肉、羊肉標準肉樣的 特征多肽進行比較，從而判定對應的肉樣組分，具體步驟如下：
[0050] 液質聯用三重串聯四極桿質譜儀(TSQ ultra EMR)進行檢測：
[0051] 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD Ci8(2 · 1mm X 100mm，1 · 9μηι);流速0 · 2mL/min;柱 溫40 °C，進樣量50yL;流動相:A相0.1 %FA/H20，B相0.1 %FA/ACN，色譜梯度為:0~0.2min， 3%B ~10%B;0.2 ~16min，10% ~40%B;16 ~17min，40%B ~80%B;17.5 ~18.5min，80%B ~3%B〇
[0052] 質譜條件:噴霧電壓3500V;鞘氣38Arb;輔氣15Arb;離子傳輸管溫度275°C ;離子源 霧化溫度380°C ;傳輸線溫度275°C ;離子源溫度380°C ;采集周期為0.3s;碰撞氣為 1.5mTorr; Q1和Q3分辨率均為0.7。
[0053] 通過對混合肉樣的特征多肽進行母離子掃描以及SRM掃描，根據保留時間，多個定 性離子匹配以及豐度信息，最終選取羊肉多肽20條，鴨肉多肽20條作為定性離子的母離子。
[0054] 混合肉樣樣品中檢測出羊肉多肽8條，鴨肉多肽10條，每個母離子下有3個子離子 (表2)。圖1分別列舉了鴨肉和羊肉的