一種藍藻的檢測分析方法

專利名稱：一種藍藻的檢測分析方法
技術領域：
本發明涉及一種藍藻的檢測分析方法，用于對藍藻的不同生理期進行分析，有助 于對水域中的藍藻狀況進行提前預警。
背景技術：
湖泊是人類最重要的水資源之一，在湖泊周圍也是我國人口和工業聚集區。因為 人類活動的影響，今年湖泊的富營養化日趨嚴重，大中型湖泊太湖、巢湖、滇池、洞庭湖、洪 澤湖、白洋淀等資源屬性受到威脅。富營養化的直接后果就是藍藻水華的發生，2008年太湖 爆發的藍藻水華嚴重影響了周邊居民的正常生活。如何在藍藻水華爆發前進行準確的預警 變得非常重要。對水中藍藻含量進行連續監測是切實可行的途徑。目前對藍藻的監測都是通過檢測藍藻在特定波長下的吸收強度或者熒光強度來 判斷其濃度的，其技術為
1.利用藍藻中的藻藍蛋白對特定波長的光的吸收特性進行吸收度測量以確定藍藻濃 度，定量分析依據為朗伯-比爾定律，我們簡稱之為吸收法，如圖1，包括光源1，樣品池2，光 接收器3，照射光束4，透射光束5。2.利用藻藍蛋白在吸收光照之后受激發射的特定波長的熒光，根據檢測到的熒光 量的大小來確定藍藻濃度，簡稱為熒光法。藻藍蛋白的激發波長峰值在621nm，而發射波長 的峰值在646nm，現有技術中大多是用這個波段的光源進行照射。圖2給出了熒光法的示 意圖，包括光源1，樣品池2，，照射光束6，熒光光束7，探測器8，收集透鏡9。圖3為熒光法 的另外一種實施例，基本原理一樣，都是通過熒光強度的大小來判斷藍藻的濃度，包括光源 1，樣品池2，照射光束6，熒光光束7，探測器8，濾色片10。上述方法的缺陷在于
1.檢測的是一個樣本的總體，而非每個藍藻細胞的個體，光強的變化量(吸收光或者熒 光)不能與藍藻濃度直接對應，需要通過復雜的定標體系來實現，一般方法為顯微鏡鏡檢， 非常費時費力，并且同一個檢測儀器對不同的水域都需要重新定標。2.由于不同生理期的藍藻熒光強度是不同的，會造成濃度定標的不準確。例如 生長期的藍藻細胞熒光量大于成熟期的藍藻細胞熒光量，那么低濃度的生長期藍藻細胞與 高濃度的成熟期藍藻細胞就可能會得到同樣的熒光量，此時定標已經失去意義。3.檢測的只是通過藍藻細胞的濃度，無法對水域的藍藻的生理期進行判斷，預警 功效較差。解決上述問題的最好方法是采用流式細胞儀對待測樣本進行測量，但是流式細胞 儀體積龐大、沉重、價格昂貴，且需要在機外進行樣本處理，只適合在實驗室測試，不能夠進 行現場測試以及在線實時監測。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，從而提供一種藍藻的檢測分析方法，該方法適合現場測量的藍藻分析，可實現對待測樣本所含的藍藻細胞進行逐個測量；不 僅精確得到藍藻的濃度，而且對藍藻的不同生理期進行分析，有助于對水域中的藍藻生長 狀況進行提前預警。按照本發明提供的技術方案，一種藍藻的檢測分析方法，包括以下檢測分析步 驟
(1)、鞘流形成被測對象由兩種液體形成，一種是待測樣本液，首先用吸樣器采集水 樣，濾除水樣中粒徑大于Imm的泥沙顆粒；然后在吸樣器內部經過篩選排除空氣和砂粒，余 下的浮游植物作為待測樣本液；另一種是鞘液；由吸樣與液路控制單元將兩種液體送至流 動室中，待測樣本液在鞘液的包裹下流過流動室檢測區，在流體聚焦的作用下將樣本液壓 縮至2個藍藻細胞的寬度，使藍藻細胞逐個通過流動室檢測區；
(2)、光照射部分
光源經過第一聚焦透鏡或透鏡組，形成一個橢圓形光斑，橢圓形光斑照射到流動室檢 測區中流過的待測樣本液上；鞘液在流動室整流區中形成層流，在流動室加速區中將樣本 液逐漸聚焦，直至在流動室檢測區中將待測樣本液壓縮成直徑為小于2個藍藻細胞尺度的 樣本流，這樣待測樣本液中的藍藻細胞就只能一個一個的通過檢測區照射光的照射，在每 次檢測事件中只能檢測一個細胞；
(3)、光接收探測部分藍藻細胞逐個地受到檢測區照射光的照射而產生光學信號，所 述光學信號通過第二聚焦透鏡收集，再通過長通濾色片進入光電探測器；光學信號被光電 探測器接收，經過光電轉換后形成電脈沖信號，送至信號處理與數據分析單元，一個細胞流 過檢測區時就形成一個電脈沖信號，這樣就實現了樣本中單個細胞的逐個測量；
(4)信號處理與數據分析部分信號處理與數據分析單元對光電探測器的電信號進行 濾波處理，并對樣本的統計數據進行分析，根據分析方法在至少一維的藍藻統計數據中劃 分至少2個區域，分別表示藍藻的不同生理期，對區域中的藍藻細胞分別計數和分析，得 到樣本液的藍藻總濃度、不同生理期的藍藻濃度、不同生理期藍藻所占百分比；所述藍藻總 濃度為一次測量過程中所有脈沖的總數目除以被測體積。所述流動室包含一個液體流過的導孔，該導孔分為三個區域整流區、加速區、檢 測區；所述檢測區是光照射區域為一個邊長為200um 400um的方孔或者矩形孔，由光學透 明材料制成；所述方孔或矩形孔的入口漸擴的部分形成加速區，鞘液通道與樣本液通道相 嵌套的部分為整流區。所述樣本液通道出口為直徑0. 3mm的圓孔。所述光源采用發光二極管；所述光電探測器采用光電二極管。所述發光二極管的波長620 士 5nm，透光波長為640歷 850nm。所述流動室內部流動的液流要滿足層流條件，即雷諾數<2300 ；鞘流對樣本流進 行流體聚焦，將樣本流壓縮至小于2個藍藻細胞直徑的寬度。所述橢圓形光斑短軸的長度為20士5um、長軸的長度為200士20um ；橢圓形光斑
短軸的方向與細胞流動方向一致，橢圓形光斑長軸方向垂直于細胞流動方向和光束傳播方 向。所述橢圓形光斑在流動室中心處的大小要求為在樣本流動方向上小于2個藍藻 直徑，在同時垂直于光束傳播和樣本流動的方向上不小于流動室內孔寬度；在垂直于光束傳播的方向上用一個大數值孔徑的第二聚焦透鏡將光信號收集到光電探測器上。所述藍藻細胞受到照射后產生的光學信號包括前向散射光、側向散射光和熒 光，所述前向散射光指的是沿著光路傳播方向1飛度范圍內的散射光，反映了細胞的體 積大小；側向散射光指的是垂直于光傳播方向的散射光，角度范圍為75度 115度，反映 了細胞的內部復雜程度；熒光的角度范圍和側向散射光角度一致，其熒光的波長范圍為 640nnT850nm。本發明的優點是
1.解決傳統儀器的定標問題。對特定體積的待測樣本中所含的藍藻細胞數目進行逐個 計數，得到準確的藍藻濃度，而無須通過復雜的定標系統來得到藍藻濃度，測量結果更加精 確。2.在測量出濃度的同時，可以對樣本中藍藻的不同生理期進行分析，對水域的藍 藻生長狀況進行提前預警。3.用LED照明，大大降低了儀器成本和尺寸，有利于野外現場操作。


圖1是現有透射法原理圖。圖2是現有熒光法原理圖。圖3是應用光纖的藍藻熒光檢測傳感器原理圖。圖4是采用本發明進行檢測的系統原理圖。圖5是本發明光電傳感器的結構圖。圖6(a)是流動室剖面圖。圖6 (b)是圖6 (a)的A-A剖面圖。圖7是流動室中檢測區的檢測示意圖。圖8是濾色片的光譜曲線圖。圖9是藍藻細胞統計直方圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。如圖4、圖5所示，本發明檢測分析系統包括光電傳感器100、信號處理與數據分析 單元200、吸樣與液路控制單元300 ；所述光電傳感器100包括光照射單元11、流動室12及 光接收探測單元13。所述光電傳感器100的光接收探測單元13輸出端與信號處理與數據 分析單元200輸入端連接，所述吸樣與液路控
制單元300與光電傳感器100的流動室12連接。本發明所述光電傳感器100，能夠對水域樣本的藍藻濃度進行測量，包括以下部 分光照射單元11、流動室12及光接收探測單元13。如圖6(a)、圖6(b)所示，所述流動室12放置在流動室座中，內含一個讓鞘液和樣 本液流過的導孔，該導孔分為三個區域整流區121、加速區122、檢測區123。其中檢測區 123，也就是光照射區域為一個邊長為200um 400um的方孔或者矩形孔，檢測區的外形為 一個立方體或長方體，由光學透明材料制成。所述方孔的入口漸擴為鞘液通道，鞘液通道內平行插入樣本液通道，樣本液通道出口在所述方孔入口漸擴區域，與方孔入口正對，所述樣 本液通道出口為直徑0. 3mm的圓孔。方孔的入口漸擴的部分形成加速區122，鞘液通道與樣 本液通道相嵌套的部分為整流區121。所述光照射單元11包括光源1及第一聚焦透鏡或者透鏡組16，置于光源組件的內 孔中；光源發出的光束通過透鏡16形成一個聚焦光斑照射到流動室中流過的樣本流上；所 述光照射單元11至少包含一個紅色LED作為光源，其波長在620nm士5nm ；
3)光接收探測單元13包括第二聚焦透鏡7、長通濾色片10及光電探測器8，所述第 二聚焦透鏡7放在透鏡座內；所述長通濾色片10以及光電探測器8放置在探測組件內，將 樣本流中的粒子受到照射后產生的光信號收集到探測器上，并進行光電轉換。本發明一種藍藻的檢測分析方法包括以下步驟
1、鞘流形成被測對象由兩種液體形成。一是待測樣本液，首先用吸樣器采集水樣，濾 除水樣中粒徑大于Imm的泥沙顆粒；然后在吸樣器內部經過篩選排除空氣和砂粒，余下的 浮游植物作為待測樣本液；另一種是鞘液，由吸樣與液路控制單元300將兩種液體送至流 動室12中，兩種液體在流動室12中流過，待測樣本液在鞘液的包裹下流過流動室檢測區 123。所述流動室12內部流動的流體要滿足層流條件，即雷諾數<2300。鞘流對樣本流 進行流體聚焦，將樣本流壓縮至小于2個藍藻細胞的寬度，以使藍藻細胞一個一個的通過。本發明中涉及的鞘液為生理鹽水。樣本液即被過濾后、含有被測藍藻細胞的湖水。所述吸樣和液路控制單元300包括壓力源，氣、液管路，閥，控制電路，樣品過濾 裝置。壓力源為氣泵或者注射器。2、光照射光源1采用發光二極管，經過第一聚焦透鏡或透鏡組16，形成一個 橢圓形光斑14，橢圓形光斑照射到流動室檢測區123中流過的待測樣本液上，當經過上述 流體聚焦的藍藻細胞逐個通過時，它們就會逐個地被照射；
3、光接收探測部分藍藻細胞15通過檢測區123照射光的照射，經過照射后會產生光 學信號，所述光學信號通過光接收探測單元13，即通過第二聚焦透鏡7，再通過長通濾色片 10進入光電探測器8 ；光學信號被光電探測器8接收，經過光電轉換后形成電脈沖信號，送 至信號處理與數據分析單元200，每個細胞在通過的時候就會產生與此細胞特征一一對應 的一個或多個電脈沖信號，這樣就實現了樣本中單個細胞的測量；
所述藍藻細胞15受到照射后產生光學信號，光學信號包括前向散射光、側向散射光 和熒光。前向散射光FSC，指的是沿著光路傳播方向廣5度(士 0.3)范圍內的散射光，反映 了細胞的體積大小。側向散射光SSC，指的是垂直于光傳播方向的散射光，角度范圍為75度 115度(士5度)，反映了細胞的內部復雜程度。熒光的角度范圍和側向散射光角度一致，其 熒光的波長范圍為640nnT850nm。為了降低成本和減小尺寸，使系統能夠適用于現場檢測，本發明采用LED作為光 源1。藻藍蛋白的熒光激發譜在620nm附近。所述橢圓形光斑14短軸的長度為20士5um、長軸的長度為200士20um ；橢圓形光斑
短軸的方向與細胞流動方向一致，橢圓形光斑長軸方向垂直于細胞流動方向和光束傳播方 向。如圖7中所示。橢圓形光斑14在流動室中心處的大小要求為在樣本流動方向上小于 2個藍藻直徑，在同時垂直于光束傳播和樣本流動的方向上不小于流動室內孔寬度。在垂
7直于光束傳播的方向上用一個大數值孔徑的第二聚焦透鏡7將光信號收集到光電探測器8 上，
所述光電探測器8采用光電二級管。為了消除背景光，得到良好的信噪比，在光電探測 器8前增加一個長通濾色片10，將背景光(主要是照射光)最大限度的抑制，同時讓熒光通 過。針對藻藍蛋白的激發光譜和發射光譜特性，長通濾色片10的光譜曲線如圖8所示小 于620nm的波長通過率小于0. 01%，640nnt850nm波長的通過率大于80%。4、信號處理與數據分析部分信號處理與數據分析單元200對光電探測器的電信 號進行濾波處理，并對樣本的統計數據進行分析數據分析方法在至少一維的藍藻統計數 據中劃分至少2個區域，分別表示藍藻的不同生理期，對區域中的藍藻細胞分別計數和分 析，得到樣本液的藍藻總濃度、不同生理期的藍藻濃度、不同生理期藍藻所占百分比；所述 藍藻總濃度為被測樣本液中所有單個藍藻細胞測量個數的集合。這樣就實現了樣本中單個 細胞的檢測。檢測上萬個藍藻細胞，形成統計特性就是這個樣本的總體特征。在本發明中，不僅可以對水域內藍藻的濃度進行定量測量，更進一步，可以對藍藻 的不同生理期進行分析判斷。數據分析模塊將單個藍藻細胞的熒光量統計在一起，形成直 方圖，如圖9所示，在直方圖上劃分三個區域——生長期、茂盛期、成熟期。圖9給出了只用一維熒光信號進行分析的實施例。對于藻細胞來說，藻藍蛋白的含量生長期 > 茂盛期 > 成熟期，因此在熒光量上成熟 期 < 茂盛期 < 生長期。藻藍蛋白的激發波長峰值620nm，發射波長峰值640nm。圖9的橫軸為粒子的熒光量fl，縱軸為熒光量為fl的粒子的數目η。當一個藍藻 細胞隨著樣本流進入光照區時產生的熒光被光電探測器8所接收，在信號處理與數據分析 單元200中形成的最終信號為fly則在圖9所示的直方圖中，熒光量為hiw地方的縱軸高 度iii增加1。以此類推，每個藍藻細胞通過檢測區的時候都會在其相應的橫軸(熒光量)處 的縱軸高度(數目)增加1，當所有被測樣本的藍藻細胞都檢測完畢的時候就形成了圖9所 示的直方圖。信號處理和數據分析單元200在直方圖中的熒光量方向設置不同的閾值thbk， thma，thgr,當藍藻細胞的熒光量處于某閾值內就反映了該細胞的生理狀態，如某個粒子的 熒光量處于thbk，和thma之間則認為它處于成熟期m,如果細胞的熒光量位于thma和之 間則認為它處于成熟期b，如果細胞的熒光量大于thg,則認為它處于生長期g。m, b, g只 是表示藍藻的不同生理周期——成熟期，茂盛期和生長期。信號處理和數據分析單元200將單個藍藻細胞的光學量統計在一起，形成多維數 據空間，在數據空間上用特定的邊界劃分幾個區域——成熟期m、茂盛期b、生長期g。落在 三個區域內的藍藻細胞數目分別為 ，nb, ne，假設被測樣本的體積為v則此被測樣本的總 藍藻濃度為
c=(nm+nb+ng)/v
不同生理期的藍藻濃度分別為
cm=nm"
cb=nb"
cg=ng/v
不同生理期的藍藻占本水域藍藻總量的百分比為%M=NM/(NM+NB+NG) %B=NB/(NM+NB+NG) %G=Ng/(Nm+Nb+Ng)0在圖9中，直方圖全部面積代表本樣本中所有藍藻細胞個數，除以樣本體積即可 得到待測樣本的藍藻總濃度。用不同的閾值標識藍藻的不同生理期，各個區域下的面積就 是本生理期內的藍藻細胞總數。用C，CM, Cb, Cg, %M, %B, %G來表征這片水域的藍藻狀 況。利用以上參數可以對本水域藍藻的濃度以及各個生理期濃度進行判斷。當成熟期 藍藻細胞濃度過高時，Cm很大，預示著藍藻水華即將爆發，當茂盛期和生長期的藍藻濃度過 高時就意味著本區域的藍藻含量有增加的趨勢，應采取措施進行抑制，一般的抑制方法為 限制氮、磷等營養鹽的進入。因此通過本發明的分析系統不但可以對藍藻濃度進行測量，而 且可以對本水域內藍藻的生長狀況進行分析。另外一種分析方法是在數據空間上劃分兩個區域——成熟期M和生長期G，計算 方法同上。通過數據顯示以及在數據上劃分區域，在不同區域內進行計數、統計，實現對樣 本藍藻生理期的分析，能夠獲得比只對藍藻總數計數更多的信息，有助于全面掌握水域的 藍藻動態。使用本發明在一次完整的測量過程中，每個“事件”只檢測一個細胞，通過多個事 件的統計特性得到整個樣本的性質，使測量更加準確，無須定標。而且不但得到樣本中藍藻 總濃度，還可以對不同生理期的藍藻濃度和比例進行分析，掌握更多的樣本信息，有利于對 本水域的藍藻的生長情況進行早期預警。
權利要求
1.一種藍藻的檢測分析方法，其特征是包括以下檢測分析步驟(1)、鞘流形成被測對象由兩種液體形成，一種是待測樣本液，首先用吸樣器采集水 樣，濾除水樣中粒徑大于Irnm的泥沙顆粒；然后在吸樣器內部經過篩選排除空氣和砂粒，余 下的浮游植物作為待測樣本液；另一種是鞘液；由吸樣與液路控制單元將兩種液體送至流 動室中，待測樣本液在鞘液的包裹下流過流動室檢測區，在流體聚焦的作用下將樣本液壓 縮至2個藍藻細胞的寬度，使藍藻細胞逐個通過流動室檢測區；(2)、光照射部分光源經過第一聚焦透鏡或透鏡組，形成一個橢圓形光斑，橢圓形光斑照射到流動室檢 測區中流過的待測樣本液上；鞘液在流動室整流區中形成層流，在流動室加速區中將樣本 液逐漸聚焦，直至在流動室檢測區中將待測樣本液壓縮成直徑為小于2個藍藻細胞尺度的 樣本流，這樣待測樣本液中的藍藻細胞就只能一個一個的通過檢測區照射光的照射，在每 次檢測事件中只能檢測一個細胞；(3)、光接收探測部分藍藻細胞逐個地受到檢測區照射光的照射而產生光學信號，所 述光學信號通過第二聚焦透鏡收集，再通過長通濾色片進入光電探測器；光學信號被光電 探測器接收，經過光電轉換后形成電脈沖信號，送至信號處理與數據分析單元，一個細胞流 過檢測區時就形成一個電脈沖信號，這樣就實現了樣本中單個細胞的逐個測量；(4)信號處理與數據分析部分信號處理與數據分析單元對光電探測器的電信號進行 濾波處理，并對樣本的統計數據進行分析，根據分析方法在至少一維的藍藻統計數據中劃 分至少2個區域，分別表示藍藻的不同生理期，對區域中的藍藻細胞分別計數和分析，得 到樣本液的藍藻總濃度、不同生理期的藍藻濃度、不同生理期藍藻所占百分比；所述藍藻總 濃度為一次測量過程中所有脈沖的總數目除以被測體積。
2.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述流動室包含一個液 體流過的導孔，該導孔分為三個區域整流區、加速區、檢測區；所述檢測區是光照射區域 為一個邊長為200um 400um的方孔或者矩形孔，由光學透明材料制成；所述方孔或矩形孔 的入口漸擴的部分形成加速區，鞘液通道與樣本液通道相嵌套的部分為整流區。
3.如權利要求2所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述樣本液通道出口為 直徑0. 3mm的圓孔。
4.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述光源采用發光二極 管；所述光電探測器采用光電二極管。
5.如權利要求4所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述發光二極管的波長 620 士 5nm，透光波長為 640nm 850nm。
6.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述流動室內部流動的 液流要滿足層流條件，即雷諾數<2300 ；鞘流對樣本流進行流體聚焦，將樣本流壓縮至小于 2個藍藻細胞直徑的寬度。
7.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述橢圓形光斑短軸的 長度為20士5um、長軸的長度為200士20um ；橢圓形光斑短軸的方向與細胞流動方向一致， 橢圓形光斑長軸方向垂直于細胞流動方向和光束傳播方向。
8.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述橢圓形光斑在流動 室中心處的大小要求為在樣本流動方向上小于2個藍藻直徑，在同時垂直于光束傳播和樣本流動的方向上不小于流動室內孔寬度；在垂直于光束傳播的方向上用一個大數值孔徑 的第二聚焦透鏡將光信號收集到光電探測器上。
9.如權利要求1所述的一種藍藻的檢測分析方法，其特征是所述藍藻細胞受到照射 后產生的光學信號包括前向散射光、側向散射光和熒光，所述前向散射光指的是沿著光路 傳播方向廣5度范圍內的散射光，反映了細胞的體積大小；側向散射光指的是垂直于光傳 播方向的散射光，角度范圍為75度 115度，反映了細胞的內部復雜程度；熒光的角度范圍 和側向散射光角度一致，其熒光的波長范圍為640ηπΓ850ηπι。
全文摘要
本發明涉及一種藍藻的檢測分析方法，其包括以下檢測分析步驟由吸樣與液路控制單元將兩種液體送至流動室中，待測樣本液在鞘液的包裹下流過流動室檢測區；光源照射到流動室檢測區中流過的待測樣本液上；待測樣本液中的藍藻細胞通過檢測區照射光的照射，經過照射后會產生光學信號被光電探測器接收，經過光電轉換后形成電信號，送至信號處理與數據分析單元；信號處理與數據分析單元對光電探測器的電信號進行濾波處理，并對樣本的統計數據進行分析。本發明可實現對待測樣本所含的藍藻細胞進行逐個測量；其不僅精確得到藍藻的濃度，而且對藍藻的不同生理期進行分析，有助于對水域中的藍藻生長狀況進行提前預警。
文檔編號G01N21/64GK102095686SQ20101059825
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月21日 優先權日2010年12月21日
發明者孔巢城, 楚建軍, 趙丙強, 陳力 申請人:無錫榮興科技有限公司