專利名稱：牡丹根部活體取樣方法
技術領域：
本發明屬于植物根部活體取樣方法，特別屬于牡丹根部活體取樣方法。
背景技術：
《中華人民共和國藥典》QOlO版)規定中藥牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，丹皮酚為評價牡丹皮質量的定性與定量指標。為研究不同產區、不同生長年限、不同生長發育時期牡丹植株丹皮酚含量的動態變化，需采集牡丹根部樣品進行追蹤分析。而藥用植物能防病治病的物質基礎，是由于其植物體或藥用部分的一些組織、細胞內積累有與防病、治病有關的藥用化學成分。為此，研究藥用成分在藥用植物體內的分布，植物在生長發育中藥用成分量的動態變化規律以及植物體內藥用成分的合成部位、運輸途徑和貯存場所，可以為確定藥材的最佳采收時間、提高藥材的產量和質量提供科學依據，并將植物的結構、發育與藥用成分的合成積累聯系起來。在對根部入藥的藥用植物進行藥用成分在藥用植物體內的分布、植物在生長發育中藥用成分量的動態變化規律以及植物體內藥用成分的合成部位、運輸途徑和貯存場所的研究時，需要進行跟蹤監測，常用的采樣方法是按照每年數次，每次數株植株進行采樣，樣品采集后在實驗室進行處理和分析。現有專利和文獻僅簡單陳述對植物根部進行取樣或者是取其主根，而沒有根部活體取樣技術。這樣即存在著下述問題取樣部位不明確；采樣時對植物根或根系損傷嚴重， 采樣后植株難以存活；然而每次采樣均需選取數株植株并有可能傷及植株甚至導致植物死亡，進而造成植物資源的極大浪費；同時在需要跟蹤檢測時不能在同一株植株上進行取樣， 因此存在取樣植株不同而產生的誤差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種活體取樣方法，采樣時對牡丹根部損傷較輕，采樣后植株能夠正常生長，進而降低因采樣而導致的資源浪費，同時每次采樣均可在同一株牡丹植株上進行進而解決因實驗取樣植株的不同而產生的誤差問題。本發明解決技術問題的技術方案為牡丹根部活體取樣方法，包括以下工序1)在樣地中隨機選取正常生長的植株，觀察測量并記錄植株的基本信息；2)在植株一側距離植株20cm-50cm處將土挖出，挖至10cm_25cm深時斜向植株方向挖土，當所要采樣的部位即根部的根尖部位暴露出時，即可進行采樣；3)在根尖成熟區上部靠近根基一側用枝剪剪下采樣長度為3cm-5cm，所采根樣直徑為3mm-5mm，用2ml_8ml的中藥提取液或2g_8g草木灰涂抹采樣后產生的傷口，并用滅菌過的玉米須或絲瓜絡或玉米苞葉5g-10g包裹傷口處，防止感染，挖出的土重新填入壓實；4)所采樣品用毛刷或濕巾將表面的土輕輕拂去后立即用錫紙包裹放入帶冰塊的保溫盒中低溫(0°c -40C )儲藏，所采樣品應在M小時內進行實驗室內試驗及數據處理分析。
在下一采樣期、在同一植株上按步驟2-4進行重復采樣即可。所述的植株的基本信息包括植株株高、生長發育時期。所述的采樣期包括花前期、始花期、盛花期、花后期、始果期、盛果期、果實成熟期、 休眠期。所述的中藥提取液為具有促進植物傷口愈合、根部生長發育、殺菌抑菌功效的中藥的提取液，包括三七提取液、蠶沙提取液、麥冬提取液、枸杞提取液、五味子提取液、垂盆草提取液、茯苓提取液、絲瓜傷流液、蒲黃提取液、透骨草提取液、苦參提取液、蛇床子提取液。所述的三七提取液為將五加科植物三七的干燥根IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含皂甙、黃酮甙、淀粉、 蛋白質、油脂等成分具有散瘀止血，消腫定痛的功效。所述的蠶沙提取液為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾幼蟲的干燥糞便IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有β -谷甾醇、 膽甾醇、麥角留醇、廿四醇、蛇麻脂醇、β-谷留醇-β-葡萄糖甙、亮氨酸、組氨酸、皂化物， 具有促進植物根部的生長發育的功效。所述的麥冬提取液為百合科沿階草屬植物麥冬的干燥塊根IOg置于300ml水中， 煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有β _谷甾醇、氨基酸、多量葡萄糖、葡萄糖甙、甜菜堿、阿托品、天仙子胺，具有促進植物傷口愈合、促進植物生長發育的功效。所述的枸杞提取液為茄科枸杞屬植物枸杞的成熟果實IOg置于300ml水中，煮沸 30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有玉蜀黍黃質， 酸漿果紅素、隱黃質、東莨菪素、胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、煙酸、維生素C，具有促進植物根部的生長發育的功效。所述的五味子提取液為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有五味子素、去氧五味子素、新一味子素、五味子醇(schizan-drol)、五味子酯，具有促進植物傷口愈合、促進植物根部的生長發育的功效。所述的垂盆草提取液為景天科植物垂盆草的新鮮或干燥全草IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有 N-甲基異石榴皮堿、二氫-N-甲基異石榴皮堿、景天庚酮糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，具有具有促進植物傷口愈合的功效。所述的茯苓提取液為為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核IOg置于300ml水中，煮沸 30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含有多糖、三萜類化合物，具有促進植物根部的生長發育的功效。所述的絲瓜傷流液為采取入秋后廢棄的葫蘆科絲瓜屬植物絲瓜的藤的汁液，從植株近根60-80cm處剪斷，插入瓶中，所流出的汁液，含有皂甙、生物堿等成分，具有抑菌和殺菌作用。所述的蒲黃提取液為將香蒲科植物水燭香蒲的花粉IOg置于300ml水中，煮沸30 分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含n_ 二十五烷、硬脂酸、黃酮類成分具止血，化瘀之功效。所述的透骨草提取液為將透骨草科植物透骨草的干燥全草IOg置于300ml水中， 煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含透骨草素及透骨草醇乙酸酯成分有舒筋活絡、活血止痛之功效。所述的苦參提取液為將來自豆科植物苦參的干燥根IOg置于300ml水中，煮沸30 分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含苦參堿等成分具有抑菌作用。所述的蛇床子提取液為將傘形科植物蛇床的干燥成熟果實IOg置于300ml水中， 煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含蛇床子素、 佛手柑內酯、異虎耳草素和花椒毒酚具有顯著的抗菌作用。所述的草木灰為將草本植物和木本植物燃燒后的灰燼，含有鉀、磷、鈣、鎂、硅、硫和鐵、錳、銅、鋅、硼、鉬等微量營養元素，尚含糖醇類化合物、蕓香苷、生物堿，具有抗菌消炎和防止傷口感染的功效。所述的玉米須為禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭，含脂肪油、揮發油、樹膠樣物質、樹脂、苦味糖甙、皂甙、生物堿、維生素C、泛酸，肌醇、維生素K、谷留醇、豆留醇、蘋果酸、 枸椽酸，酒石酸，草酸、硝酸鉀，a-生育醌成分，具有止血、抗菌消炎和防止傷口感染的功效。所述的絲瓜絡為葫蘆科植物絲瓜的果實的維管束。夏、秋季果實成熟、果皮變黃、 內部干枯時采摘，除去外皮及果肉，洗凈，曬干，除去種子即得。絲瓜絡含木聚糖，可能還含甘露聚糖、半乳聚糖及木質素等，具有通經活絡，解毒消腫的功效。所述的玉米苞葉為禾本科植物玉蜀黍的苞葉，含維生素E，Bi、B2、B6及胡蘿卜素、 煙酸、硒和鎂、賴氨酸、木質素、谷胱氨酸、草酸、鈣鹽等，具有抗菌消炎的功效。玉米須、絲瓜絡、玉米苞葉的滅菌方法為用千分之一的高錳酸鉀溶液或5%的84
清毒液浸泡清洗。本發明的優點是采樣時對根部損傷較輕，采樣后牡丹能夠正常生長，進而降低因采樣而導致的資源浪費同時每次采樣均在同一株牡丹植株上進行，解決實驗中因取樣植株不同而產生的誤差。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作詳細的說明。實施例1 1)對三年生牡丹的根系進行考察，了解并記錄其根系的生長情況，包括根系的分布的廣度、深度、分枝的疏密程度，確定牡丹根系的特點是分支多，以根莖交界處為中心在土中發散生長，分布半徑多處在30cm的范圍內，根系深度為30cm。2)在樣地中隨機選取正常生長的植株，觀察測量并記錄植株的基本信息，株高 70cm、花前期。3)將植株一側距離植株30cm處將土挖出，挖至15cm深時斜向植株方向挖土，當所要采樣的部位即根部的根尖部位暴露出時，即可進行采樣，在根尖成熟區上部靠近根基一側用枝剪剪下直徑為3mm、長度為3cm的根樣，用3ml的三七提取液和3ml的苦參提取液涂抹采樣后產生的傷口，并用滅菌的玉米須6g包裹傷口處，防止感染，挖出的土重新填入壓實。所采樣品用毛刷將表面的土輕輕拂去后立即用錫紙包裹放入帶冰塊的保溫盒中低溫 (4°C )儲藏，所采樣品在8小時進行實驗室內試驗及數據處理分析。實施例2 取相同的牡丹，除在盛花期期外，其余與實施例1相同。實施例3 取相同的牡丹，除在盛果期期外，其余與實施例1相同。實施例41)對五年生牡丹的根系進行考察，了解并記錄其根系的生長情況，包括根系的分布的廣度、深度、分枝的疏密程度，確定牡丹根系的特點是分支多，以根莖交界處為中心在土中發散生長，分布半徑多處在45cm的范圍內，根系深度為40cm。2)在樣地中隨機選取正常生長的植株，觀察測量并記錄植株的基本信息，株高 85cm、盛花期。3)將植株一側距離植株45cm處將土挖出，挖至20cm深時斜向植株方向挖土，當所要采樣的部位即根部的根尖部位暴露出時，即可進行采樣，在根尖成熟區上部靠近根基一側用枝剪剪下直徑為5mm、長度為5cm的根樣，用蒲黃提取液和5g草木灰涂抹采樣后產生的傷口，并用滅菌的絲瓜絡9g包裹傷口處，防止感染，挖出的土重新填入壓實。所采樣品用濕巾將表面的土輕輕拂去后立即用錫紙包裹放入帶冰塊的保溫盒中低溫儲藏，所采樣品在12小時進行實驗室內試驗及數據處理分析。實施例5 取相同的牡丹，除在始果期期外，其余與實施例4相同。實施例6 取相同的牡丹，除在休眠期期外，其余與實施例4相同。實施例7 取相同的牡丹，除用蠶沙提取液、絲瓜傷流液替代三七提取液和苦參提取液外，其余與實施例1相同。實施例8 取相同的牡丹，除用麥冬提取液、蛇床子提取液替代三七提取液和苦參提取液外， 其余與實施例1相同。
實施例9 取相同的牡丹，除用五味子提取液替代三七提取液外，其余與實施例1相同。實施例10 取相同的牡丹，除用枸杞提取液替代三七提取液外，其余與實施例1相同。實施例11 取相同的牡丹，除用垂盆草提取液替代三七提取液外，其余與實施例1相同。實施例12 取相同的牡丹，除用茯苓提取液替代三七提取液外，其余與實施例1相同。實施例13 采樣后植物活力的測定在牡丹種子收獲季節，使用TTC法快速鑒定植物種子生活力，實驗表明使用實 施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12植株活種子的百分率分別為85 % ,84 % ,86 % ,84 %, 85%、87%、86%、85%、85%、84%、86%、85%，而未采樣植株活種子的百分率為90%，可證 實采樣對植株的正常生長無明顯不良影響。所述的TTC法為氯化三苯基四氮唑(TTC)水溶液浸泡種子，使之滲入種胚的細胞 內，如果種胚具有生活力，其中的脫氫酶就可以將氧化態無色的TTC作為受氫體使之還原 成不溶性的紅色三苯甲腙(TTF)。如果種胚死亡便不能染色；若種胚生活力衰退或部分喪失生活力，則染色較淺或 局部被染色，因此，可以根據種胚染色的部位或染色的深淺程度來鑒定種子的生活力。計算活種子的百分率活種子的百分率=胚部染成紅色的種子數(粒)/供試種子數(粒)X 100%其結果如下實施例1植株活種子的百分率=85/100X100%= 85% ；實施例2植株活種子的百分率=84/100X100%= 84% ；實施例3植株活種子的百分率=86/100X100%= 86% ；實施例4植株活種子的百分率=84/100X100%= 84% ；實施例5植株活種子的百分率=85/100X100%= 85% ；實施例6植株活種子的百分率=87/100X100%= 87% ；實施例7植株活種子的百分率=86/100X100%= 86% ；實施例8植株活種子的百分率=85/100X100%= 85% ；實施例9植株活種子的百分率=85/100X100%= 85% ；實施例10植株活種子的百分率=84/100X100%= 84% ；實施例11植株活種子的百分率=86/100X100%= 86% ；實施例12植株活種子的百分率=85/100X100%= 85% ；未采樣植株活種子的百分率=90/100X100%= 90%。
權利要求
1.牡丹根部活體取樣方法，包括以下工序1)在樣地中隨機選取正常生長的植株，觀察測量并記錄植株的基本信息；2)在植株一側距離植株20cm-50cm處將土挖出，挖至10cm-25cm深時斜向植株方向挖土，當所要采樣的部位即根部的根尖部位暴露出時，即可進行采樣；3)在根尖成熟區上部靠近根基一側剪下采樣長度為3cm-5cm，所采根樣直徑為 3mm-5mm,用2ml_8ml的中藥提取液或2g_8g草木灰涂抹采樣后產生的傷口，并用滅菌過的玉米須或絲瓜絡或玉米苞葉5g-10g包裹傷口處，防止感染，挖出的土重新填入壓實；4)將所采樣品表面的土拂去后，于低溫(0°C-4°C )儲藏，所采樣品應在M小時內進行實驗室內試驗及數據處理分析；5)在下一采樣期、在同一植株上按步驟2-4進行重復采樣即可。
2.根據權利要求1所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的采樣期包括花前期、始花期、盛花期、花后期、始果期、盛果期、果實成熟期、休眠期。
3.根據權利要求1所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的中藥提取液為具有促進植物傷口愈合、根部生長發育、殺菌抑菌功效的中藥的提取液，包括三七提取液、 蠶沙提取液、麥冬提取液、枸杞提取液、五味子提取液、垂盆草提取液、茯苓提取液、絲瓜傷流液、蒲黃提取液、透骨草提取液、苦參提取液或蛇床子提取液一種或數種的混合物。
4.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的三七提取液為將五加科植物三七的干燥根IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。所述的蠶沙提取液為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾幼蟲的干燥糞便IOg置于300ml水中，煮沸30 分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
5.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的麥冬提取液為百合科沿階草屬植物麥冬的干燥塊根IOg置于300ml水中，煮沸 30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可；所述的枸杞提取液為茄科枸杞屬植物枸杞的成熟果實IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可；所述的五味子提取液為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實IOg置于 300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
6.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的垂盆草提取液為景天科植物垂盆草的新鮮或干燥全草IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可；所述的茯苓提取液為為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
7.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的絲瓜傷流液為采取入秋后廢棄的葫蘆科絲瓜屬植物絲瓜的藤的汁液，從植株近根60-80cm處剪斷，插入瓶中，所流出的汁液；所述的蒲黃提取液為將香蒲科植物水燭香蒲的花粉IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可，含n_ 二十五烷、硬脂酸、 黃酮類成分具止血，化瘀之功效。
8.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的透骨草提取液為將透骨草科植物透骨草的干燥全草IOg置于300ml水中，煮沸 30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
9.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的苦參提取液為將來自豆科植物苦參的干燥根IOg置于300ml水中，煮沸30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
10.根據權利要求3所述的牡丹根部活體取樣方法，其特征在于所述的蛇床子提取液為將傘形科植物蛇床的干燥成熟果實IOg置于300ml水中，煮沸 30分鐘后取其過濾液備用，將藥渣中加入IOOml水繼續煮沸15分鐘后取濾液備用，繼續向藥渣中加入IOOml煮沸15份取濾液，將三次濾液混合濃縮至50ml即可。
全文摘要
本發明公開了牡丹根部活體取樣方法，包括以下工序在樣地中隨機選取植株，在植株一側距離植株20cm-50cm處將土挖出，挖至10cm-25cm深時斜向植株方向挖土，在根尖成熟區上部靠近根基一側用枝剪剪下采樣長度為3cm-5cm，直徑為3mm-5mm的樣品，用中藥提取液或草木灰涂抹采樣后產生的傷口，并用滅菌過的玉米須或絲瓜絡或玉米苞葉包裹傷口處，所采樣品用用錫紙包裹放入帶冰塊的保溫盒中低溫儲藏，本發明與現有技術相比，采樣時對根部損傷較輕，采樣后牡丹能夠正常生長，進而降低因采樣而導致的資源浪費同時每次采樣均在同一株牡丹植株上進行，解決實驗中因取樣植株不同而產生的誤差。
文檔編號G01N1/04GK102297786SQ201110172330
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月24日 優先權日2011年6月24日
發明者劉曉龍, 李晉, 章晴, 鄭艷 申請人:安徽師范大學