專利名稱：一種水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，屬于分析化學領域，更具體涉及水產品中污染物的檢測技術領域。本發明將富集純化技術與超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用相結合，對水產品中微囊藻毒素和節球藻毒素進行定量分析。
背景技術：
近年來我國大部分湖泊水體富營養化加劇，造成夏季藍藻大量繁殖，發生“水華” 現象。藍藻衰敗過程中產生有害藍藻毒素，其中微囊藻毒素(microcystin，MC)和節球藻毒素(nodUlarin，N0D)是淡水藍綠藻產生的兩大類肝毒素。MC具有環狀七肽結構，性質穩定， 是腫瘤促進劑，其中以MC-RR、MC-YR、MC-LR最為常見，世界衛生組織推薦飲用水中MC-LR的限量標準為1 μ g/L，并推薦人群最大可耐受日攝入量為每千克0.04 Ug0 NOD具有與MC 相似的環狀五肽結構，是直接的致癌物質。值得注意的是藻毒素不僅通過飲用水威脅人類健康，而且能在動植物等水產品中聚集，通過食物鏈威脅人類健康。由于目前缺乏防止藻類水華發生的有效措施，因此要預防和消除藻毒素對人畜的危害，監測和控制藻毒素在各類水產品中的限量是行之有效的方法。傳統檢測手段主要有小鼠腹腔注射生物分析法、酶聯免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析方法，但存在操作較復雜，受復雜基體干擾影響大，且不能用于不同種類的分析鑒定等缺點。液相色譜和質譜聯用法已經被應用于水體和生物體中多種藻毒素化合物的檢測，而近年來開發出超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)方法具有分析速度快、樣品分析通量高、分析靈敏度高等特點，對于復雜生物體中目標物的分析有著更大的優勢。通過結合質譜成為藻毒素定性定量的強有力工具，樣本在質譜儀中被轉化為去溶劑化的離子，通過改變內源電壓獲取有價值的碎片，特別是特征碎片離子來檢測復雜基質中的藻毒素，不同分子質量的藻毒素同系物，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用監測那些在一定保留時間下，某特定質量數的離子強度達到定量目的。因此，建立靈敏度高、回收率高、 重現性好的水產品中痕量MC-RR、MC-YR、MC-LR和NOD分析方法，成為研究的關鍵。
發明內容
本發明的目的是針對水產品樣品基體復雜，藻毒素痕量存在，前處理技術難度大等問題，擬開發一種靈敏度高、回收率高、快速、準確的分析技術，實現對水產品樣品中 MC-RR、MC-YR、MC-LR 及 NOD 的定量測定。本發明的技術方案如下
一種水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，稱取一定量的樣品用溶劑浸泡，采用超聲輔助萃取方式，使藻毒素萃取到溶劑中，通過離心分離，減壓濃縮后，將提取濃縮液上固相萃取柱，洗脫液氮吹濃縮，定容后直接用于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜分析。 步驟為
A.樣品的提取將冷凍干燥的水產品樣品粉碎均勻，按0.20 g干粉加正丁醇-甲醇-水(體積比1 4 15，下同)抽提液5-10mL比例，浸泡10 min后，超聲波功率為 150-250W，超聲10 min, 12000 r/min離心10-15 min,移取上層清液，沉淀再抽提兩次(條件同前)，合并上清液，40°C以下減壓濃縮至5 mL。B.樣品的富集及純化采用已活化的500mg C18固相萃取柱對步驟A得到的濃縮液上樣富集藻毒素，控制流速lmL/min ；依次用純水、10%的甲醇水溶液各3_5mL沖洗固相萃取柱，控制流速2mL/min ；最后用5_10 mL 0. 05-0. 1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫柱上藻毒素，控制流速2-3mL/min，洗脫液在30°C條件下氮吹濃縮，于_18°C冷凍保存。C.色譜分析前將步驟B保存的冷凍品用甲醇定容并用0.22 μ m有機濾頭過濾， 定容體積1. OOmL。D、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜分析
液相色譜條件超高效液相色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱，2. 1 mmXIOO mmXl. 7 μ m,柱溫為45°C ；流動相為A 水；B 乙腈；A、B均含體積分數0. 10%甲酸，流速為0. 30 mL/min ；梯度洗脫程序為0-6. O min 含B :20%_35%，其余組分為A ;6. 0-8. O min 含B 35%-100%，其余組分為A ；
質譜條件Q-TOF-MS條件電噴霧離子源正離子電離模式ESI+;離子源溫度 IOO0C ；脫溶劑氣溫度:2500C ；毛細管電壓3. 5 kV ；錐脫溶劑氣流量:500 L/h ；錐孔電壓 30 V ；錐孔氣流量50 L/h ；四級桿范圍m/z: 100-1500 ；碰撞能量6V ；TOF離子飛行方式采用V模式，選擇離子監測模式，目標化合物以保留時間和特征離子確定，繪制標準曲線， 以外標法進行定量測定。步驟B所述的C18固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純甲醇、5mL超純水、3mL 5%甲醇水溶液，流速均為lmL/min。其中所述藻毒素為MC-RR、MC-YR、MC-LR及NOD的色譜分析保留時間及定量離子見表1。表1四種藻毒素的色譜分析保留時間及定量離子
權利要求
1.一種水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，其特征在于稱取一定量的樣品用溶劑浸泡，采用超聲輔助萃取方式，將藻毒素萃取到溶劑中，通過離心分離，減壓濃縮后，將藻毒素提取濃縮液上固相萃取柱，洗脫液氮吹濃縮，定容后直接用于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜分析；該方法依次包括以下步驟(1)、樣品的提取將冷凍干燥的水產品樣品粉碎均勻，按0.20g干粉加正丁醇-甲醇-水體積比1 4 15抽提液5-10mL比例，浸泡10 min后，超聲波功率為150-250W，超聲10 min, 12000 r/min離心10-15 min，移取上層清液，沉淀用同前的條件再抽提兩次，合并上清液，40°C以下減壓濃縮至5 mL ；(2)、樣品的富集及純化采用已活化的500mgC18固相萃取柱對步驟(1)得到的濃縮液上樣富集藻毒素，控制流速lmL/min;依次用純水、10%的甲醇水溶液各3_5mL沖洗固相萃取柱，控制流速2mL/min ；最后用5_10 mL 0. 05%-0. 1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脫柱上藻毒素，控制流速2-3mL/min，洗脫液在30°C條件下氮吹濃縮，于_18°C冷凍保存；(3)、色譜分析前將步驟(2)保存的冷凍品用甲醇定容并用0.22ym有機濾頭過濾，定容體積1. OOmL ；(4)、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜分析液相色譜條件超高效液相色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱，2. 1 mmXIOO mmXl. 7 μ m,柱溫為45°C ；流動相為A 水；B 乙腈；A、B均含體積分數0. 10%甲酸，流速為0. 30 mL/min ；梯度洗脫程序為0-6. O min 含B :20%_35%，其余組分為A ;6. 0-8. O min 含B 35%-100%，其余組分為A;質譜條件Q-TOF-MS條件電噴霧離子源正離子電離模式ESI+;離子源溫度 IOO0C ；脫溶劑氣溫度:250°C ；毛細管電壓3. 5 kV ；錐脫溶劑氣流量:500 L/h ；錐孔電壓 30 V;錐孔氣流量50 L/h;四級桿范圍m/z: 100-1500 ；碰撞能量6V ;TOF離子飛行方式采用V模式，選擇離子監測模式，目標化合物以保留時間和特征離子確定，繪制標準曲線， 以外標法進行定量測定。
2.根據權利要求1所述的水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，其特征在于步驟B 所述的C18固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純甲醇、5mL超純水、3mL 5%甲醇水溶液， 流速均為lmL/min。
3.根據權利要求1所述的水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，其特征在于其中所述藻毒素為微囊藻毒素MC-RR、MC-YR、MC-LR及節球藻毒素NOD。
全文摘要
本發明涉及一種水產品中痕量藻毒素含量的檢測方法，屬于分析化學領域，更具體涉及水產品中污染物的檢測技術領域。本方法將富集純化技術與超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯用相結合，對水產品中微囊藻毒素和節球藻毒素定量分析，其處理步驟包括超聲提取、固相萃取純化、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術快速測定水產品中的微囊藻毒素MC-RR、MC-YR、MC-LR和節球藻毒素NOD。本發明建立的方法能夠快速分析水產品中的藻毒素含量，其靈敏度高、專屬性好，易于操作且回收率高。
文檔編號G01N30/88GK102393435SQ20111035201
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月9日 優先權日2011年11月9日
發明者何恩奇, 徐夏葉, 楊健, 武鑠, 虞銳鵬, 鈕偉民, 陳海燕, 陶冠軍 申請人:江南大學