總膽汁酸的定量測定及測定試劑盒的制作方法

專利名稱：總膽汁酸的定量測定及測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及總膽汁酸(TBA)的定量測定方法、試劑及試劑盒。
背景技術：
膽汁酸是在肝臟從膽固醇生成的24-碳類固醇化合物，在人體液中的膽汁酸主要有五種形式膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、和熊脫氧膽酸。這些膽酸合起來稱為總膽汁酸(TBA)。血清膽汁酸水平是反映肝實質損傷的一個重要指標。餐后TBA測定對檢出輕度肝臟病變的靈敏度優于所有其他肝功能試驗。對檢測酒精或工業化學品引起的肝細胞損傷的靈敏度優于其它肝功能試驗。大多數膽汁酸測定方法在測定前需有分離提取步驟，這是因為膽汁酸的不溶性、 多型性和以多種結合狀態存在于體液中等因素。常用的分離方法包括采用有機溶劑和中性樹脂提取，陰離子交換層析方法等，但這些方法都有較多的缺陷，如不易將所有各種不同形式的膽汁酸同時全部提取與分離，實驗費時，操作繁瑣，而且無法進行自動化測定因而不適合在臨床實驗室應用。而且由于一般情況下血清中的膽汁酸含量較低，上述方法重復性與準確性也往往達不到要求。膽汁酸作為從膽固醇轉化形成的類固醇，其分子上3 α -羥基對3 α -羥類固醇脫氫酶(3 α -HSD)的酶催化作用比較敏感，膽汁酸C3上α位的羥基在3 α -HSD的作用下脫氫形成羰基，此酶促反應的輔酶是氧化型輔酶I (NAD+)，反應后NAD+作為受氫體轉化成還原型輔酶I (NADH)。根據這一酶法反應的原理發展出幾種可以適合臨床實驗室進行膽汁酸分析的方法，其一是直接檢測NAD+向NADH的轉變，但因血清樣品中膽汁酸的含量較低而不易準確測定；其二是在上述單一酶促反應基礎上增加另一電子受體如刃天青，刃天青接受 NADH的遞氫作用后可被激發出熒光，但此法需要特殊的熒光分光光度計且不能進行自動分析；其三是在上述單一酶促反應基礎上增加另一個酶(黃遞酶)和另一個受氫體(硝基四氮唑藍ΝΒΤ)，NBT受氫后生成有色物質，可以用比色法測定，但也存在檢測靈敏度與準確性的問題，且因需要用磷酸或鹽酸中止反應，所以也難以自動化分析；雖然后來對上述第三種方法作了改進后也發展出可以進行自動分析的方法，但由于血清中總膽汁酸(TBA)的濃度較低，而且血清中存在的干擾物質對測定結果的影響相對較大，例如一個主要的干擾因素是血清中存在的乳酸脫氫酶(LDH)，由于LDH催化的反應生成的NADH往往比TBA生成的量要大得多，對測定結果有明顯的正干擾，導致測定結果偏高。血清樣品中存在的其他脫氫酶和還原性物質也會產生正干擾，同樣導致測定結果偏高。后來發展了測定TBA的第五代循環酶法。此法的反應體系中引入輔酶I的一種硫代衍生物，也有氧化型和還原型，即氧化型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)和還原型β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)。所謂循環酶法，其反應過程的原理如下膽汁酸被3 α -羥類固醇脫氫酶(3 α -HSD)氧化，生成3_酮類固醇，脫下的氫被 Thio-NAD接受，使Thio-NAD轉化為Thio-NADH ；同時在反應體系中還存在NADH時，3 α -HSD又催化逆向反應，使正反應生成的3-酮類固醇又氧化成為膽汁酸，完成一個循環。經如此反復循環的酶反應，Thio-NADH的生成量不斷增大，在一定時間內，酶循環產生的β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(Thio-NADH)量與樣品中膽汁酸濃度成正比。Thio-NADH在 395nm 415nm波長處有光吸收峰，可在自動生化分析儀器內連續監測410nm的吸光度變化，求得膽汁酸的濃度。目前，以第五代酶循環法測定TBA的市售試劑多為進口產品，價格偏高。經相關專利的檢索，未檢索到第五代酶循環法測定TBA的試劑(盒)的專利。因此，研制發明適用于自動分析的以第五代酶循環法測定TBA的方法，和性能更為優良，能有效抗干擾能力，價格更為低廉的試劑是值得所屬領域技術人員努力的目標。

發明內容
在對酶循環法測定TBA的方法進行多年研究以及反復實驗后，在以下幾方面有了重大突破試劑中Thio-NAD、NADH來源的選擇非常重要，對循環酶反應的效率、速度、和穩定性有直接影響。1、試劑中Thio-NAD、NADH的濃度與相對比例的選擇直接影響酶反應的速度，是準確測定樣品TBA濃度的一個關鍵因素。2、為使血清中各種膽汁酸(包括一級、二級和三級膽汁酸)都能通過循環酶反應而測定，在試劑中除了加入3 α -羥類固醇脫氫酶之外，還加入了 7 α -羥類固醇脫氫酶。3、一種或多種特殊的穩定劑對保持試劑的長期穩定，和抵抗多種明確的和不明確的干擾因素的影響發揮重要的作用。4、選擇合適的緩沖液的ρΗ，以保證循環酶反應的正向反應與逆向反應有相同的反應速度，實現酶反應的良好循環。本發明的目的之一是，提供一種以循環酶法自動分析測定樣品中TBA含量的試劑，所述試劑由分別放置的試劑1和試劑2組成，其中，所述試劑1中含有氧化型β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，緩沖劑，表面活性劑、穩定劑和防腐劑；所述試劑2中含有還原型輔酶I (NADH)，和羥類固醇脫氫酶(HSD)，緩沖劑，表面活性劑、穩定劑以及防腐劑。本發明的另一個目的是，提供一種定量測定血清樣品中TBA的試劑盒，其特征在于其中裝有分別放置的前述試劑1和試劑2。本發明的再一個目的是提供一種定量測定血清樣品中TBA含量的方法。具體而言，本發明用于定量測定血清樣品中TBA含量的試劑盒由分別放置的試劑 1和試劑2組成。其中，所述試劑1中含有氧化型β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，緩沖劑，表面活性劑、穩定劑和防腐劑；所述試劑2中含有還原型輔酶I (NADH)，羥類固醇脫氫酶 (HSD)，緩沖劑，表面活性劑、穩定劑以及防腐劑。如本文中使用的，術語“高純度”是指產品的純度大于95%。所述試劑1的作用在于提供循環酶法正向反應所需的受氫體Thio-NAD，由于試劑 1中不含羥類固醇脫氫酶，并且有穩定劑的保護，所以試劑1在單獨放置時是穩定的。
所述的氧化型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)在試劑溶液中的濃度范圍為500mg/L 2000mg/L ；表面活性劑的濃度范圍為100mg/L 5000mg/L。所述的表面活性劑選自一種或多種表面活性劑，其具體實例可以包括吐溫-20、 曲拉通X-100、Brij ；35等的一種或幾種。所述的穩定劑選自一種或多種試劑，其具體實例可以包括海藻糖、甘露醇、聚乙二醇等的一種或幾種。所述的維持反應環境pH穩定的緩沖劑，其具體實例可以包括GOODS緩沖液、 Tris (三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。緩沖液的pH范圍為pH 3. 5 6. O0所述試劑2中含有還原型輔酶I (NADH)和羥類固醇脫氫酶(HSD)，緩沖劑，表面活性齊 、穩定劑以及防腐劑。所述試劑2的作用在于提供循環酶法反應所需的羥類固醇脫氫酶(HSD)，這種酶選自3α-羥類固醇脫氫酶和7 α-羥類固醇脫氫酶。其在試劑中的濃度沒有特別的限制， 其具體實例中優選的濃度范圍為500U/L 50000U/L。保證酶在試劑中足夠的濃度從而保證用連續監測方法的自動分析得以順利進行。所述試劑2的另一作用在于提供循環酶法逆向反應所需的供氫體還原型NADH，其具體實例中的濃度范圍為1. Og/L 20. Og/L。所述的表面活性劑選自一種或多種表面活性劑，其具體實例可以包括吐溫-20、 曲拉通X-100、Brij ；35等的一種或幾種。所述的穩定劑選自一種或多種試劑，其具體實例可以包括海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、EDTA等的一種或幾種。所述試劑2還含有下述物質維持反應體系pH的緩沖劑，其具體實例可以包括 如GOODS系列的緩沖液、AMPS0;防腐劑，如疊氮化鈉等。這些物質也可同時存在于試劑1中。本發明所述定量測定人血清樣品中TBA試劑盒是將分別放置的上述試劑1和試劑 2以不同的規格(ml)裝入試劑盒包裝中。該試劑盒具有多種不同的規格，可以分別適用于目前在臨床實驗室普遍使用的各種國內外品牌的自動生化分析儀器。本發明所述定量測定血清樣品中TBA含量的方法包括 規定血清樣品與試劑1和試劑2的容積比例，其比例為樣品試劑1 試劑2 =3 210 70。 測定操作的步驟為在反應容器中(一般為分析儀器的比色皿)先加入待測血清樣品，再加入試劑1，混勻后在37°C的恒溫環境中定時保溫5分鐘，然后再加入試劑2起動酶的反應，繼續保溫，經過短暫的延遲時間后，開始在一定的波長處對吸光度的變化進行連續監測，獲得在單位時間段內吸光度的變化率ΔΑ/min。用同樣的方法測定校準液的吸光度變化率ΔΑ/min，血清樣品中的TBA含量可通過下述的計算式得到TBA (ymol/L) = ( Δ A測定 / Δ A校準)X Cs (校準液 TBA 濃度)本發明的TBA測定方法只需3 10微升(μ )血清樣品，總的反應體積也僅有 300 μ 1左右，檢測的靈敏度以測定TBA的最低檢測限(LLD)表示，至少可達1. 5 μ mol/L，所以是一種高效率、高靈敏度、低成本、快速微量的自動測定方法。
下面的實施例是對本專利申請的具體描述，但是，本專利申請不限于這些實施例， 這些實施例也不能解釋為對本專利申請的限制。附圖簡述

圖1示出在實施例2中本發明試劑與對照試劑對LDL-C的測定結果對比。
具體實施例方式實施例1 一、按照下述成分和比例配制下述本發明試劑1及試劑2 試劑1
β-石充代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)952.9 mg/L
GOODS 緩沖液 pH4.00.75mmol/L
乙二醇15ml/L
疊氮化鈉0.5 g/L
草酸鈉1.30 g/L
曲拉通 X-1002.50 g/L試劑2
還原型輔酶I (NADH)6.1g/L
GOODS 緩沖液 pH 9.20.75mmol/L
3α-羥類固醇脫氫酶10000U/L
7α-羥類固醇脫氫酶2000U/L
AMPSO45 g/L
BSA1.5 g/L
疊氮化鈉0.2 g/L
甘露醇9.1 g/L二、測定使用HITACHI7100型自動生化分析儀，設置分析參數具體為分析方法 速率法；測定點19、觀；檢測波長405nm(主)/660nm(副)；樣品量3. 0μ 1 ；試劑Rl 210 μ 1 ；試劑R2 :70μ1 ；反應方向上升；校準模式線性模式，2點校準；單位μ mol/L。 儀器自動執行以下操作過程在比色皿中先加入待測血清樣品3 μ 1，再加入試劑1210 μ 1， 混勻后在37°C的恒溫環境中定時保溫5分鐘，然后再加入試劑2起動酶的反應，繼續保溫， 經過短暫的延遲時間后，開始在405nm波長處對吸光度的變化進行連續監測，自動獲得在單位時間段內吸光度的變化率ΔΑ/min。并自動根據計算公式TBA (μ mol/L) = ( Δ A測定 / Δ A校準)X Cs (校準液 TBA 濃度)自動報告樣品TBA的測定結果。
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對高、中、低三個TBA含量水平的血清樣品進行測定，每份樣品各以上述標準操作方法重復測定20次，按正規的統計學要求，求取每份樣品測定結果的平均值和標準差，然后按公式變異系數(CV% )=標準差/平均值X 100%計算變異系數CV%，結果列于下表1 中。表1高低濃度TBA測定的結果
權利要求
1.一種定量測定血清樣品中總膽汁酸含量的試劑，其適用于自動生化分析儀器進行自動定量測定總膽汁酸，該試劑由分別放置的溶液型試劑1和試劑2兩部分組成，其中，所述試劑1中含有氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、緩沖劑、表面活性劑、穩定劑和防腐劑；所述試劑2中含有還原型輔酶I、羥類固醇脫氫酶、緩沖劑、表面活性劑、穩定劑以及防腐劑。
2.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸選自由酶轉化法制備的輔酶衍生物純品。
3.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的緩沖劑選自 GOODS緩沖液、三(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種，所述緩沖液的PH范圍為pH 3. 5 6.0。
4.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的表面活性劑選自吐溫系列、Brij系列、曲拉通系列的一種或多種表面活性劑；所述的穩定劑選自海藻糖、甘露醇、聚乙二醇中的一種或多種。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的試劑，其特征在于，在所述試劑1中，所述的氧化型β -硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在試劑溶液中的濃度范圍為500mg/L 2000mg/L ；表面活性劑的濃度范圍為100mg/L 5000mg/L ；緩沖液的濃度范圍為0. 5mmol/L 150mmol/ L ；穩定劑的濃度范圍為100mg/L 50000mg/L。
6.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的還原型輔酶I選自由酵母細胞中提取的高純度產品，或是NADH的鈉鹽。
7.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的羥類固醇脫氫酶選自3 α -羥類固醇脫氫酶、7 α -羥類固醇脫氫酶、12 α -羥類固醇脫氫酶中的一種或多種；所述的表面活性劑選自吐溫系列、Brij系列、曲拉通系列的一種或多種表面活性劑；所述的穩定劑選自海藻糖、甘露醇、聚乙二醇等的一種或多種；所述的緩沖劑選自GOODS緩沖液、三(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。
8.根據權利要求7所述的試劑，其特征在于，在所述試劑2中，所述的還原型輔酶I 在試劑溶液中的濃度范圍為1. Og/L 20. Og/L ；羥類固醇脫氫酶的濃度范圍為500U/L 50000U/L ；表面活性劑的濃度范圍為100mg/L 5000mg/L ；緩沖液的濃度范圍為0. 5mmol/ L 150mmol/L ；穩定劑的濃度范圍為100mg/L 50000mg/L。
9.根據權利要求1所述的試劑，其特征在于，試劑1和試劑2中都含有抑菌和穩定的防腐劑，該防腐劑選自疊氮化鈉，防腐劑的優選濃度范圍為0. 05% 1.0%。
10.一種定量測定血清樣品中總膽汁酸含量的試劑盒，其特征在于其中裝有權利要求 1至9中任一項所述的定量測定血清樣品中總膽汁酸含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑1和試劑2組成。
全文摘要
本發明提供了一種以酶學方法定量測定人血清樣品中總膽汁酸含量的試劑，適用于自動生化分析儀器進行自動定量測定總膽汁酸。該試劑由分別放置的溶液型試劑1和試劑2兩部分組成，其中，所述試劑1中含有氧化型β-硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)，緩沖劑，和穩定劑；所述試劑2中含有還原型輔酶I(NADH)和羥類固醇脫氫酶(HSD)以及穩定劑和緩沖劑。本發明還提供了一種裝有本發明試劑1和試劑2的試劑盒，以及一種測定血清總膽汁酸含量的方法。本發明具有靈敏度高、成本低、操作簡便快速、易于推廣的優點。
文檔編號G01N21/31GK102539791SQ20121000509
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者宋高峰, 李清華 申請人:寧波天康生物科技有限公司