專利名稱：一種蛋白水解度的檢測方法及用于檢測的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物分析化學領域，具體的說，涉及一種蛋白水解度的檢測方法及用于檢測的試劑盒。
背景技術：
蛋白質是由各種不同氨基酸通過肽鍵相連形成一級結構后再螺旋纏繞組成的高級結構，蛋白質的水解度可以代表蛋白質在水解過程中肽鍵被裂解的程度。在實際生產中， 經常需要測定蛋白質的水解度來反映加工處理工藝的優劣或產品質量的好壞。目前國內、 外常用的方法主要有φΗ-state法、三硝基苯磺酸法、鄰苯二甲醛法、水合茚三酮法、考馬斯亮藍法等，但這些方法都是以測定水解后的氨基酸含量的變化為基礎或者直接測定樣品中的蛋白質含量，比較適宜在單一蛋白質加工或氨基酸生產工藝中應用，而對含多種蛋白質或富含多種有機物的混合樣品測定時，因存在大量的干擾源，如多糖、脂類等，使測定結果與真實值之間存在很大的差異，因此實際生產中需要更加精確、方便的檢測系統與方法。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種能夠在混合樣品中檢測蛋白質水解度的方法及用于檢測的試劑盒，可用于餐廚垃圾處理、蛋白飼料生產、食品有機廢水處理等復雜有機物加工和處理過程中蛋白質水解情況的檢測。本發明的目的通過下述技術方案予以實現一種蛋白水解度的檢測方法，按照下述步驟進行(一)制備標準曲線和標準對比卡配置溶解液，并將酪蛋白溶于溶解液中，定容得到標準蛋白溶液，例如稱取酪蛋白 O. 25克溶于溶解液中，定容到25毫升配成標準蛋白溶液配置測定液配制質量百分數為10%的氫氧化鉀水溶液，待用，再稱取氯化銅、酒石酸鉀鈉和碘化鉀溶解于蒸餾水中，攪拌加入質量百分數為10 %的氫氧化鈉水溶液，最后加蒸餾水定容到目標體積，使得各個溶質的最終質量百分數分別為氯化銅O. 15%、酒石酸鉀鈉O. 6%、碘化鉀O. I %和氫氧化鉀3% ；將標準蛋白溶液、溶解液和測定液配置成不同濃度的系列溶液，在分光光度計可見光區540nm處測定吸光度，以標準蛋白質含量為橫坐標、測定的吸光度值為縱坐標，繪制成標準曲線，制成標準比對卡。例如按照下表進行混合均勻后，室溫下放置30分鐘后，在分光光度計可見光區540nm處測定吸光度。以標準蛋白質含量為橫坐標、測定的吸光度值為縱坐標,繪制成標準曲線,制成標準比對卡
權利要求
1.一種蛋白水解度的檢測方法，其特征在于，按照下述步驟進行(一)制備標準曲線和標準對比卡配置溶解液，并將酪蛋白溶于溶解液中，定容得到標準蛋白溶液；再配置測定液；然后將標準蛋白溶液、溶解液和測定液配置成不同濃度的系列溶液，在分光光度計可見光區 540nm處測定吸光度，以標準蛋白質含量為橫坐標、測定的吸光度值為縱坐標，繪制成標準曲線，制成標準比對卡(二)檢測樣品中蛋白的水解度分別向加工前與加工后的樣品中加入沉淀液后靜置，離心后去除上層清液，再向沉淀中加入洗脫液，離心后去除上層清液，然后向沉淀中加入溶解液，待溶解后向其中加入測定液，靜置后，在540nm波長下進行吸光度測定，與標準比對卡進行比對，確定加工前后蛋白含量，二者的差值除以加工前蛋白含量即可計算出蛋白水解程度。
2.根據權利要求I所述的一種蛋白水解度的檢測方法，其特征在于，所述溶解液選用氫氧化鉀的水溶液；所述洗脫液選用乙醇和水的混合溶液；所述沉淀液選用三氯乙酸的水溶液。
3.根據權利要求2所述的一種蛋白水解度的檢測方法，其特征在于，所述溶解液選用0.05摩爾/升的氫氧化鉀水溶液；所述洗脫液為將分析純乙醇與蒸餾水按19 I體積比混合后得到；所述沉淀液按照下述方法制備，將固態三氯乙酸加熱至60°C以上實現由固態向液態的轉變后，再按照液態三氯乙酸和水3 17的體積比與蒸餾水互溶；所述標準蛋白溶液按照下述方法制備，稱取酪蛋白0. 25克溶于溶解液中，定容到25毫升配成標準蛋白溶液。
4.根據權利要求I所述的一種蛋白水解度的檢測方法，其特征在于，所述測定液按照下述步驟制備配制質量百分數為10%的氫氧化鉀水溶液，待用，再稱取氯化銅、酒石酸鉀鈉和碘化鉀溶解于蒸餾水中，攪拌加入質量百分數為10 %的氫氧化鈉水溶液，最后加蒸餾水定容到目標體積，使得各個溶質的最終質量百分數分別為氯化銅0. 15%、酒石酸鉀鈉0.6%、碘化鉀0. 1%和氫氧化鉀3%。
5.根據權利要求I所述的一種蛋白水解度的檢測方法，其特征在于，將加工前與加工后的樣品溶于溶解液中后，再吸取樣品溶液加入沉淀液，進行檢測。
6.一種用于檢測蛋白水解度的試劑盒，其特征在于，包括溶解液、沉淀液、洗脫液、測定液及標準比對卡，其中所述溶解液選用氫氧化鉀的水溶液所述洗脫液選用乙醇和水的混合溶液所述沉淀液選用三氯乙酸的水溶液所述測定液按照下述步驟進行制備配制質量百分數為10%的氫氧化鉀水溶液，待用，再稱取氯化銅、酒石酸鉀鈉和碘化鉀溶解于蒸餾水中，攪拌加入質量百分數為10%的氫氧化鈉水溶液，最后加蒸餾水定容到目標體積，使得各個溶質的最終質量百分數分別為氯化銅0. 15%、酒石酸鉀鈉0. 6%、碘化鉀0. I %和氫氧化鉀3%所述標準比對卡按照下述方法進行測定將酪蛋白溶于溶解液中，定容得到標準蛋白溶液；將標準蛋白溶液、溶解液和測定液配置成不同濃度的系列溶液，在分光光度計可見光區540nm處測定吸光度，以標準蛋白質含量為橫坐標、測定的吸光度值為縱坐標，繪制成標準曲線，制成標準比對卡。
7.根據權利要求6所述的一種用于檢測蛋白水解度的試劑盒，其特征在于，所述溶解液選用0. 05摩爾/升的氫氧化鉀水溶液；所述洗脫液選用乙醇和水的混合溶液，將分析純乙醇與蒸餾水按19 I體積比混合后得到；所述沉淀液選用三氯乙酸的水溶液，將固態三氯乙酸加熱至60°C以上實現由固態向液態的轉變后，再按照液態三氯乙酸和水3 17的體積比與蒸餾水互溶；所述標準蛋白溶液按照下述方法制備，稱取酪蛋白0. 25克溶于溶解液中，定容到25毫升配成標準蛋白溶液。
8.一種利用如權利要求6所述的試劑盒進行蛋白水解度檢測的方法，其特征在于，分別向加工前與加工后的樣品中加入沉淀液后靜置，離心后去除上層清液，再向沉淀中加入洗脫液，離心后去除上層清液，然后向沉淀中加入溶解液，待溶解后向其中加入測定液，靜置后，在540nm波長下進行吸光度測定，與標準比對卡進行比對，確定加工前后蛋白含量， 二者的差值除以加工前蛋白含量即可計算出蛋白水解程度。
9.根據權利要求8所述的利用試劑盒進行蛋白水解度檢測的方法，其特征在于，測試中也可將加工前與加工后的樣品溶于溶解液中后，再吸取樣品溶液加入沉淀液，進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白水解度的檢測方法及用于檢測的試劑盒，包括溶解液、沉淀液、洗脫液、測定液及標準比對卡，首先制備標準曲線和標準對比卡，再檢測樣品中的蛋白水解度。本發明的技術方案不以測定水解后的氨基酸含量變化為基礎，而是將樣品中蛋白質析出后間接測定蛋白水解度，因此可抵抗多糖、脂類等多種有機物的干擾，適宜在含有多種有機物的混合物生產、加工、處理工藝中應用。
文檔編號G01N21/31GK102590107SQ20121000704
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉剛, 宋志敏, 李嵐, 王茉, 陳元政, 陳冠益, 顏蓓蓓 申請人:天津大學