專利名稱：一種卵白蛋白雙抗夾心elisa檢測方法
一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法技術領域
本發明屬于生物檢驗檢疫領域，通過將卵清白蛋白免疫實驗動物獲得多克隆抗體，建立卵清白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。
背景技術：
食物過敏是對食物中蛋白質分子產生的一種不良免疫反應。流行病學調查顯示， 25%以上的人群受到過敏疾病的困擾。世界衛生組織(WHO )將牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、 蟹、龍蝦)、花生、大豆、核果類(杏、板栗、腰果等)及小麥這8類食物定為常見的過敏食物。
雞蛋中的蛋白質屬于優質蛋白質，除了含有成年人所需要的八種必需氨基酸外， 還含有嬰幼兒必須通過膳食補充的組氨酸，更是唯一一個蛋白質生物價達100的天然食物。然而正是這些對人體相當有益的蛋白質卻可能成為兒童患過敏性疾病的禍首。不僅是兒童，某些先天性遺傳缺陷的成年人同樣有著對雞蛋過敏的煩擾。據報道，雞蛋過敏的高危人群為嬰幼兒和兒童，是兒童繼發性營養不良的原因之一。
迄今為止，雞蛋過敏尚無特效療法，嚴格避免食用帶雞蛋的食物是雞蛋過敏患者的最佳選擇。然而雞蛋營養豐富，若從雞蛋過敏患者的膳食中除去雞蛋，勢必造成其營養不均衡。而且，由于現在食物配料的多樣化，使食物的組成變得十分復雜，雞蛋過敏患者很難避免遭受危害，因此，雞蛋過敏已經嚴重影響了部分人群的生活質量，甚至危急生命，值得我們去關注和研究。
雞蛋中的過敏原主要存在于蛋清中，目前公認蛋清中有4種蛋白成分能與人類血清結合而引起過敏反應，為雞蛋的主要過敏原，它們分別是卵類黏蛋白、卵白蛋白OVA、卵轉鐵蛋白和溶菌酶。
目前國內檢測卵白蛋白主要利用進口的酶聯免疫檢測試劑盒，靈敏度高，重復性好，但是價格昂貴，而國內尚沒有市售的OVA ELISA檢測試劑盒。一般企業為節約檢測成本，只使用其檢測疫苗原液及成品，無法廣泛用于工藝評價。發明內容
本發明提供一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，目的是建立快速、有效、低成本的卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法。
本發明采取的技術方案是 (一)抗卵白蛋白的單克隆抗體制備(a)采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速免疫方案用lmg/mL的卵白蛋白100 μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μ L ； 首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；(b)細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1 :5 10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔lOOul，放入37°C、5%0)2培養箱中培養；并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換HAT培養基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆， 然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3%和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，2011年12月7日在地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數為4. SXlO8M-1 ；(二)制備抗卵白蛋白的多克隆抗體(a)用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西蘭大白兔，免疫劑量為lmg/lmL/只，第一次免疫用弗式完全佐劑與等體積的卵白蛋白OVA乳化完全后于頸部及背部皮下結合后腿根部肌肉多點注射，以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及免疫方法同第一次免疫，第三次加強免疫后10天耳緣靜脈采血并分離血清，用雙向免疫瓊脂擴散方法測定血清效價，當血清效價達到24及以上時，心臟采血并在37°C放置ai，4°C靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體；(b)多克隆抗體的純化采用辛酸-硫酸銨法純化兔血清，具體操作如下(1)1份血清加入3份醋酸鹽緩沖液 CpH 4. 5)，混合均勻后于30min內逐滴加入正辛酸，邊加邊攪拌，加入辛酸的量為75ul/mL 兔血清。4°C靜置Ih ;(2)4°C以12000rpm離心30min，棄沉淀收集上清并準確記錄體積，加 Λ 1/10倍體積的PBSC0. 01Μ，ρΗ7· 0)，調ρΗ至7. 2，然后逐滴加入飽和硫酸銨至50%飽和， 邊加邊攪拌，4°C靜置2h ； (3) 40C，12000rpm離心15min，棄上清，沉淀用適當體積的PBS (0. 01M, pH7. 0)溶起，逐滴加入飽和硫酸銨至33%飽和，4°C靜置2h ； (4)重復第3步；5) 40C，12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當體積的PBS (0. 01M，pH7. 0)溶起，并于4°C 條件下在PBS (0. 01M, pH7. 0)中透析直到沒有硫酸根離子為止；紫外分光光度計測定純化后的蛋白濃度，并分裝保存至_80°C備用；(c)辣根過氧化物酶(HRP)標記多克隆抗體純化后的多克隆抗體用一種活化的辣根過氧化物酶試劑盒標記，標記方法按照試劑盒說明書進行，具體操作方法如下(1) Img HRP用50μ 去離子水完全溶解后，加入50μ 純化后的多克隆抗體溶液，含有多克隆抗體lOOPg，混合均勻后加入IOPL左右的啟動劑，調ρΗ 至9. 5；(2) 4°C放置12h，加入少量的硼氫化鈉，再加入終止劑，約3倍體積啟動劑的量，調節ρΗ至7.0左右；(3)加甘油至50%，_20°C保存備用；(d)卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法(1)用純化后的單克隆抗體4E9(5Pg/mL)包被ELISA板，100 PL/孔，4°C包被過夜；(2)0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(3)加入新鮮配制的1%脫脂奶粉，100μ /孔，37°C包被Ih ；(4)0. 1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(5)加入系列稀釋的OVA標準品溶液或者待檢樣品及辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體(1:2000倍稀釋)，各IOOPL/孔，37°C孵育Ih ；(6)0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(7)加入OPD底物溶液，ΙΟΟμ ν孔，37°C避光反應15min；(8)加入2M硫酸終止反應，50μ /孔；(9)酶標儀492nm處讀值，記錄OD值；(10)繪制標準曲線，計算待檢樣品中OVA含量。
本發明卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測試劑盒的組裝，試劑盒包括包被用的單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體、包被液、封閉劑、洗液、系列稀釋的OVA標準品溶液、酶標多抗稀釋液、底物溶液和終止液；包被抗體為單克隆抗體4E9，檢測抗體為辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體，封閉劑為1%脫脂奶粉，酶標多抗稀釋液稀釋液為含有 1%BSA的PBST (0. OlM的PBS,含tween-20 0. 05%)，底物為OPD溶液，終止液為2M硫酸。
本發明包被抗體用特異性高的單克隆抗體，檢測抗體用HRP標記的多克隆抗體， 檢測程序簡單方便，檢測時間短，且靈敏度高，最低檢測限可達到0. 31ng/mL，用于制備快速、有效、低成本的過敏原檢測試劑盒，操作簡單方便，一次操作時間不超過池，且可同時檢測多個樣品，節省時間，檢測靈敏度高。
具體實施方式
實施例1用高純度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠具體的免疫方法如下采用兩種免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一種是足墊快速免疫方案用lmg/mL的 0VA100 μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min。使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30 μ L。首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上， 首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價。另一種是常規免疫方案首次免疫乳化方法同足墊快速免疫法，腹腔及背部皮下多點注射100yg/100yL的卵白蛋白，兩周后進行加強免疫，100 μ g/100 μ L抗原與等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫每次間隔兩周，四免后三天斷尾檢測小鼠血清效價。
實施例2細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆具體操作步驟如下強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟(足墊免疫小鼠無菌取出胭淋巴結)，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液(或者用注射器研磨胭淋巴結制備細胞懸液)，按1 :(5 10)的比例與SP2/0細胞充分混合， 在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合，將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的 HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔lOOul，放入37°C、 5%C02培養箱中培養，并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換HAT培養基，待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高，細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止，先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3% 和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株。
實施例3單抗亞類鑒定及腹水大量制備具體方法如下(1)用檢測原卵白蛋白OVA包被酶標板，4°C過夜；(2)PBST洗滌3次，甩干；(3 )加入適當稀釋的腹水或細胞培養上清，37°C，Ih ；(4)PBST洗滌3次，加入單抗亞類鑒定試劑，37°C，Ih ；(5)PBST洗滌3次，甩干；(6)每孔加入IOOul底物溶液，37°C顯色15min，酶標儀讀值判斷陽性結果。
單克隆抗體亞類鑒定
權利要求
1. 一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，其特征在于包括下列步驟(一)抗卵白蛋白的單克隆抗體制備(a)采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速免疫方案用lmg/mL的卵白蛋白100 μ L與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min ；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μ L ； 首免后七天用lmg/mL的BALB/C 100 μ L與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；(b)細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1 :5 10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37°C水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔lOOul，放入 37°C,5%C02培養箱中培養；并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換 HAT培養基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價， 篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20. 3%和73. 1%，陽性率分別為0和1. 78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC No. 5557，分類命名產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數為 4. 8 X IO8M"1 ；(二)制備抗卵白蛋白的多克隆抗體(a)用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西蘭大白兔，免疫劑量為lmg/lmL/只，第一次免疫用弗式完全佐劑與等體積的卵白蛋白OVA乳化完全后于頸部及背部皮下結合后腿根部肌肉多點注射，以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫用弗氏不完全佐劑，免疫劑量及免疫方法同第一次免疫，第三次加強免疫后10天耳緣靜脈采血并分離血清，用雙向免疫瓊脂擴散方法測定血清效價，當血清效價達到24及以上時，心臟采血并在37°C放置ai，4°C靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體；(b)多克隆抗體的純化采用辛酸-硫酸銨法純化兔血清，具體操作如下(1)1份血清加入3份醋酸鹽緩沖液 CpH 4. 5)，混合均勻后于30min內逐滴加入正辛酸，邊加邊攪拌，加入辛酸的量為75ul/mL 兔血清，4°C靜置Ih ;(2)4°C以12000rpm離心30min，棄沉淀收集上清并準確記錄體積，加 Λ 1/10倍體積的PBSC0. 01Μ，ρΗ7· 0)，調ρΗ至7. 2，然后逐滴加入飽和硫酸銨至50%飽和， 邊加邊攪拌，4°C靜置2h ； (3) 40C，12000rpm離心15min，棄上清，沉淀用適當體積的PBS (0. 01M, pH7. 0)溶起，逐滴加入飽和硫酸銨至33%飽和，4°C靜置2h ； (4)重復第3步；5) 40C，12000rpm離心15min,棄上清，沉淀用適當體積的PBS (0. 01M，pH7. 0)溶起，并于4°C 條件下在PBS (0. 01M, pH7. 0)中透析直到沒有硫酸根離子為止；紫外分光光度計測定純化后的蛋白濃度，并分裝保存至-80°C備用；(c)辣根過氧化物酶(HRP)標記多克隆抗體純化后的多克隆抗體用一種活化的辣根過氧化物酶試劑盒標記，標記方法按照試劑盒說明書進行，具體操作方法如下(1) Img HRP用50μ 去離子水完全溶解后，加入50μ 純化后的多克隆抗體溶液，含有多克隆抗體lOOPg，混合均勻后加入IOPL左右的啟動劑，調ρΗ 至9.5 ;(2)4°C放置12h，加入少量的硼氫化鈉，再加入終止劑，約3倍體積啟動劑的量，調節pH至7.0左右；(3)加甘油至50%，_20°C保存備用； (d)卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法(1)用純化后的單克隆抗體4E9(5Pg/mL)包被ELISA板，100 PL/孔，4°C包被過夜；(2)0.1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(3)加入新鮮配制的1%脫脂奶粉，100μ 7孔，37°C包被Ih ；(4)0. 1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(5)加入系列稀釋的OVA標準品溶液或者待檢樣品及辣根過氧化物酶標記的多克隆抗體(1:2000倍稀釋)，各 οομ ν孔，37°C孵育Ih;(6)0. 1%的PBST洗滌3次，5min/次，拍干；(7)加入OPD底物溶液，ΙΟΟμ ν孔，37°C避光反應15min；(8)加入2M硫酸終止反應，50μ /孔；(9)酶標儀492nm處讀值，記錄OD值；(10)繪制標準曲線，計算待檢樣品中OVA含量。
全文摘要
本發明涉及一種卵白蛋白雙抗夾心ELISA檢測方法，屬于生物檢驗檢疫領域。抗卵白蛋白的單克隆抗體的制備，抗卵白蛋白的多克隆抗體的制備，包被抗體用特異性高的單克隆抗體，檢測抗體用HRP標記的多克隆抗體，檢測程序簡單方便，檢測時間短，且靈敏度高，最低檢測限可達到0.31ng/mL，用于制備快速、有效、低成本的過敏原檢測試劑盒，操作簡單方便，一次操作時間不超過2h，且可同時檢測多個樣品，節省時間，檢測靈敏度高。
文檔編號G01N33/68GK102539788SQ20121001049
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者任洪林, 馮小麗, 盧士英, 周玉, 宋杰, 張茂林, 李兆輝, 李巖松, 柳增善 申請人:吉林大學