專利名稱：一種同時測定牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的熒光方法
技術領域：
本發明涉及一種同時測定牛奶中兩種抗生素的檢測方法，特別的，涉及一種同時測定牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的熒光方法。
背景技術：
近年來，隨著我國居民收入的提高和對乳制品 消費觀念的轉變，我國的乳制品工業得到了迅猛地發展。然而從目前國內奶業的生產與加工狀況來看，我國乳制品的質量與安全現狀不容樂觀。我國乳牛的農場化養殖水平較低，大部分原料乳來自乳牛散養戶，因此原料乳的品質波動性很大。乳制品摻假，濫用抗生素等諸多問題使得乳制品安全性存在重大隱患。磺胺甲基異惡唑和達氟沙星分別屬于磺胺類藥物和喹諾酮類藥物，這兩類抗生素都具有廣譜抗菌性，被廣泛地用于治療動物疾病(乳牛的乳房炎)和動物飼料添加劑中。如果對奶牛用藥不當，濫用抗生素并不遵循休藥期，牛乳中就會有抗生素殘留。食用有抗生素殘留的食品會給人體的健康帶來嚴重的危害，如一些過敏反應和細菌耐藥性，長期食用有致癌的可能性。許多國家都規定了牛奶中磺胺類藥物和達氟沙星抗生素的允許的最大殘留量分別為100 μ g/L和30 μ g/L。中華人名共和國國家標準(GB/T 22966-2008和GB/T 21312-2007)分別規定了牛奶中磺胺類抗生素和喹諾酮類抗生素的液相色譜串聯質譜測定方法。這種檢測方法靈敏度高，但通常需要復雜的前處理，耗時較長，費用昂貴。因此，迫切需要建立一種快捷簡便的檢測方法，以滿足日常生產檢驗中對原料乳進行快速監測的需求，從而保證最終產品的質量。熒光光譜法始于十九世紀六十年代，近年來，隨著熒光分析法的發展，其應用范圍日益廣泛，具有靈敏度高、線性范圍寬、不需復雜預處理等特點。隨著技術的進步，熒光分析儀器的靈敏度，準確度和選擇性不斷提高，遍及工業，農業，食品，醫藥，環境科學的各個領域，成為一種重要且有效的痕量組分分析的方法。三維熒光光譜的三個維度是指激發波長、發射波長和熒光強度。三維熒光技術可為二階校正法提供矩陣響應數據陣，能使我們在未知干擾物存在下，依然能對多個感興趣的組分進行定量分析。選擇覆蓋感興趣組分的最大熒光激發和發射波譜區間，對其進行三維熒光掃描，就可以為后期的數據分析提供完整的數據矩陣，對多種物質進行同時檢測。已有研究表明結合三維熒光技術和化學計量學而建立的熒光檢測方法具有直接檢測復雜食品體系中痕量物質如抗生素殘留的能力，但是目前還未有應用此種技術對食品中不同種類的抗生素殘留同時檢測的報道。
發明內容
針對上述情況，本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種快速同時測定牛奶中多類抗生素(磺胺類抗生素和喹諾酮類抗生素)殘留的方法，可快速地篩分出陰性和陽性樣品，并進一步確認其準確濃度，為實際應用提供了一種快捷簡便的監控方法。
本發明通過以下方案實現一種同時測定牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的熒光方法，通過以下步驟實現(I)校正集樣品制備向陰性牛奶中添加一系列隨機組合濃度梯度的磺胺甲基異惡唑和達氟沙星溶液。(2)校正集樣品的熒光測定經過除蛋白質，加入熒光胺試劑衍生化后，采集三維突光光譜。(3)校正集模型的建立對光譜數據預處理后，采用化學計量學方法的多元校正模型構建磺胺甲基異惡唑和達氟沙星兩種物質的濃度和三維熒光光譜數據間的回歸模型。(4)模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型；
(5)模型的預測能力對未知樣品采用與步驟(2)相同的預處理方法，采集其三維熒光光譜，收集到的光譜信息用步驟(4)獲得的校正模型對其進行預測。本發明牛奶樣品的預處理為除脫蛋白質與熒光胺試劑衍生化，不包含其他化學分離。本發明所述的除蛋白質采用加入30% (v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白質的方法。所述的熒光胺試劑衍生化采用lmg/mL熒光胺丙酮溶液的方法進行。本發明三維熒光光譜的采集方式和采集條件為采用三維熒光光譜掃描，激發發射狹縫均為5nm，光電倍增管電壓為600V，掃描速度為12000nm/min，每隔5nm取數據點，每個樣品做3次平行掃描，取平均值。所述的步驟(3)中光譜數據預處理包括平滑與中心化。所述采用的化學計量學方法為三線性偏最小二乘法-判別式(PLSDA)和三線性偏最小二乘法(PLS) ;PLSDA算法用于定性地篩分出陰性和陽性樣品，PLS算法用于確定樣品中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的濃度。所述的模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型，根據Hotelling T2和樣品的剩余偏差去除異常點，再依據模型的預測誤差最小化原則選擇主成分數對未知樣品進行預測。本發明的有益效果(I)磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的同時測定，快速的篩分陰性樣品和陽性樣品，并確定其濃度。(2)牛奶樣品的預處理無需包含復雜的化學分離，僅需脫蛋白質與衍生化，就可利用化學計量學的方法將磺胺甲基異惡唑和達氟沙星信息從復雜的牛奶熒光背景中提取出來。(3)利用三維熒光光譜的高階優勢，對熒光性質與熒光條件各異，并相互干擾的兩種抗生素，利用三維熒光光譜確定兩個抗生素的特征峰，在牛奶體系中實現其同時檢測。(4)采用加標實驗先建立校正模型，進而應用建立的校正模型預測未知樣品。(5)采用的化學計量學方法為三線性偏最小二乘法-判別式(PLSDA)和三線性偏最小二乘法(PLS)。PLSDA算法可用于定性地篩分出陰性和陽性樣品，PLS算法可用于確定樣品中兩種抗生素的濃度。
圖I三維熒光光譜圖(A)空白牛奶；圖2三維熒光光譜圖(B)空白牛奶添加達氟沙星和磺胺甲基異惡唑；圖3化學計量算法解析后的熒光光譜圖(A)激發光譜(I)磺胺甲基異惡唑；(2)達氟沙星；(3)牛奶背景；圖4化學計量算法解析后的熒光光譜圖(B)發射光譜(I)磺胺甲基異惡唑；(2)達氟沙星；(3)牛奶背景；圖5PLSDA模型對預測集樣品的分析結果(A)磺胺甲基異惡唑；圖6PLSDA模型對預測集樣品的分析結果(B)達氟沙星。
具體實施例方式一種同時測定牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的熒光方法，通過以下步驟實現(I)校正集樣品制備向陰性牛奶中添加一系列隨機組合濃度梯度的磺胺甲基異惡唑和達氟沙星溶液。(2)校正集樣品的熒光測定經過除蛋白質，加入熒光胺試劑衍生化后，采集三維突光光譜。(3)校正集模型的建立對光譜數據預處理后，采用化學計量學方法的多元校正模型構建磺胺甲基異惡唑和達氟沙星兩種物質的濃度和三維熒光光譜數據間的回歸模型。(4)模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型；(5)模型的預測能力對未知樣品采用與步驟(2)相同的預處理方法，采集其三維熒光光譜，收集到的光譜信息用步驟(4)獲得的校正模型對其進行預測。本發明牛奶樣品的預處理為除脫蛋白質與熒光胺試劑衍生化，不包含其他化學分離。本發明所述的除蛋白質采用加入30% (v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白質的方法。所述的熒光胺試劑衍生化采用lmg/mL熒光胺丙酮溶液的方法進行。本發明三維熒光光譜的采集方式和采集條件為采用三維熒光光譜掃描，激發發射狹縫均為5nm，光電倍增管電壓為600V，掃描速度為12000nm/min，每隔5nm取數據點，每個樣品做3次平行掃描，取平均值。所述的步驟(3)中光譜數據預處理包括平滑與中心化。所述采用的化學計量學方法為三線性偏最小二乘法-判別式(PLSDA)和三線性偏最小二乘法(PLS) ;PLSDA算法用于定性地篩分出陰性和陽性樣品，PLS算法用于確定樣品中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的濃度。所述的模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型，根據Hotelling T2和樣品的剩余偏差去除異常點，再依據模型的預測誤差最小化原則選擇主成分數對未知樣品進行預測。下面結合實施例，進一步闡述本發明
實施例II.校正集樣本采用GB/T 22966-2008和GB/T 21312-2007的方法確定陰性牛奶樣品作為校正集牛奶基質。加入7個濃度水平的達氟沙星和8個濃度水平的磺胺甲基異惡唑標準工作液溶液，兩種抗生素濃度隨機混合，共15個樣品作為校正集。2.校正集樣品的測定移取5mL牛奶于50mL容量瓶中，加入隨機組合的
O,10，20，30，40，50，60 μ g/L 達氟沙星和 O, 30，50，100，120，150，200 μ g/L 磺胺甲基異惡唑標準溶液，加超純水定容到刻度，混合均勻，取8mL樣液置于IOmL離心管中，加入O. 5mL 30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液,潤旋振蕩,靜置IOmin后4000r/min下離心IOmin,過濾。取5mL濾液于試管，加入400 μ L熒光胺丙酮溶液(lmg/mL)，渦旋振蕩混勻，室溫下反應30min后掃描其三維熒光光譜。3.校正集樣品的三維熒光光譜采集用熒光光譜儀(日立F-7000熒光光譜儀)對校正集樣品進行三維熒光光譜掃描，激發波長范圍為28(T420nm，發射波長范圍為 42(T550nm。光電倍增管電壓(PMT)為600V，響應速度為O. I，掃描速度為12000nm/min，激發、發射的狹縫寬度均為5nm。間隔5nm采集熒光強度數據。4.快速篩選方法的建立將收集到的熒光光譜數據導入Unscrambler 9. 7軟件，用三線性偏最小二乘判別式法(PLSDA)提取分析物的光譜信息，對數據進行回歸計算。(I)首先，對光譜數據進行平滑，中心化處理。(2)對校正集樣品賦值那些小于最大殘留量濃度的樣品被賦值為-I (陰性樣品)而大于最大殘留量濃度的則被賦值為I (陽性樣品)，用賦值變量和三維熒光光譜數據用三線性偏最小二乘判別法進行回歸計算，得到校正模型。牛奶中磺胺類藥物和達氟沙星抗生素的允許的最大殘留量分別為100 μ g/Ι和30 μ g/Ι。(3)根據Hotelling T2 (p-value < 5%)和樣品的剩余偏差去除異常點，采用交叉驗證，對磺胺甲基異惡唑和達氟沙星分別選擇使模型的預測均方根誤差最小時的主成分數。所建立模型的參數見表I。(4)為了檢驗所建立模型的預測能力，按照方法，用所建立的校正模型對樣品進行分析得到測定值。最后，那些預測值小于零的樣品被歸類為陰性樣品，大于零的則歸類為陽性樣品。將本發明方法應用到商業牛乳的檢測中，結果如圖5，圖6和表2顯示，對于磺胺甲基異惡唑，陰性和陽性樣品的判別正確率為100%。而就達氟沙星而言，56個陽性樣品中，被誤判為陰性的樣品數為1，這樣假陰性的概率計算為I. 78%，這遠小于歐盟所規定的5%。5.定量檢測模型的建立■ 與4不同的是用三線性偏最小二乘法(PLS)對收集到光譜數據和兩種抗生素的濃度據同時進行回歸計算。(I)首先，同樣地對光譜數據進行平滑，中心化處理。(2)將磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的添加濃度和三維熒光光譜數據進行回歸計算，得到校正模型。(3)根據Hotelling T2 (p-value < 5%)和樣品的剩余偏差去除異常點，采用交叉驗證，對磺胺甲基異惡唑和達氟沙星分別選擇使模型的預測均方根誤差最小時的主成分數。所建立模型的參數見表I。(4)為了檢驗所建立模型的預測能力，按照方法，用所建立的校正模型對樣品進行分析得到未知樣品中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的濃度。將本發明方法應用到商業牛乳的檢測中，結果顯示，對于磺胺甲基異惡唑，樣品回收率在84. 5 108. 5%，方法的重復性(RDSJ和重現性(RSDk)分別為O. 6%和I. 7% ;而對于達氟沙星而言，樣品回收率在66. 8^153. 0%，方法的重復性(RDSJ和重現性(RSDk)分別為I. 3%和11. 4%。可見，熒光法結合偏最小二乘算法(PLS)能夠進一步確定樣品中這兩種抗生素的濃度。表I兩種化學計量校正模型的相關指標
權利要求
1.一種同時測定牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的熒光方法，其特征在于，通過以下步驟實現 (1)校正集樣品制備向陰性牛奶中添加一系列隨機組合濃度梯度的磺胺甲基異惡唑和達氟沙星溶液。
(2)校正集樣品的熒光測定經過除蛋白質，加入熒光胺試劑衍生化后，采集三維熒光光譜。
(3)校正集模型的建立對光譜數據預處理后，采用化學計量學方法的多元校正模型構建磺胺甲基異惡唑和達氟沙星兩種物質的濃度和三維熒光光譜數據間的回歸模型。
(4)模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型； (5)模型的預測能力對未知樣品采用與步驟(2)相同的預處理方法，采集其三維熒光光譜，收集到的光譜信息用步驟(4)獲得的校正模型對其進行預測。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，牛奶樣品的預處理為除蛋白質與熒光胺試劑衍生化，不包含其他化學分離。
3.根據權利要求I所述的方法，所述的除蛋白質采用加入30%(v/v)的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀蛋白質的方法。
4.根據權利要求I所述的方法，所述的熒光胺試劑衍生化采用lmg/mL熒光胺丙酮溶液的方法進行。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，三維熒光光譜的采集方式和采集條件為采用三維熒光光譜掃描，激發發射狹縫均為5nm，光電倍增管電壓為600V，掃描速度為12000nm/min，每隔5nm取數據點，每個樣品做3次平行掃描，取平均值。
6.根據權利要求I所述的方法，所述的步驟(3)中光譜數據預處理包括平滑與中心化。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述采用的化學計量學方法為三線性偏最小二乘法-判別式(PLSDA)和三線性偏最小二乘法(PLS) ；PLSDA算法用于定性地篩分出陰性和陽性樣品，PLS算法用于確定樣品中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的濃度。
8.根據權利要求I所述的方法，所述的模型的驗證采用交叉驗證的方法建立校正模型，根據Hotelling T2和樣品的剩余偏差去除異常點，再依據模型的預測誤差最小化原則選擇主成分數對未知樣品進行預測。
全文摘要
本發明涉及一種應用熒光光譜快速同時檢測牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星殘留的方法。首先對脫蛋白衍生化后的牛奶進行三維熒光光譜掃描，然后用化學計量學手段解析熒光光譜，構建快速同時檢測牛奶中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星含量的多元校正模型。在用已構建的校正模型對未知牛奶樣品中磺胺甲基異惡唑和達氟沙星的殘留進行預測時發現本發明能夠快速地區分陰性和陽性樣品，并進一步測定兩種藥物殘留的含量。本發明具有簡單快速、靈敏度高的特點，大大提高了檢測效率，簡化抗生素殘留檢測的操作步驟，可處理大批量樣品，可在實際檢測應用中推廣。
文檔編號G01N21/64GK102879370SQ20121036608
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者周鵬, 劉小鳴, 張燕萍, 梁麗, 范大明 申請人:江南大學