專利名稱：檢測β-興奮劑類藥物的五聯檢測卡及其制備方法
技術領域：
本發明涉及β -腎上腺素受體激動劑檢測技術領域，特別是涉及一種克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五聯檢測卡及其制備方法。
背景技術：
隨著畜牧業規模化、商業化的發展，獸藥和飼料添加劑在畜牧業生產中得到了廣泛的應用，獸藥廣泛使用于各種疾病的有效控制，降低了動物死亡率；提高飼料轉化率，提高了動物增重率和縮短了動物飼養周期，改善皮革質量，降低禁食胴體和動物組織廢棄率；促進了動物源性產品產量的增長和動物集約化養殖的發展。現在的獸藥不僅用來防治動物疾病，而且越來越多的藥物用于促進生長，同步發情等非治療用途，造成了更加嚴重的獸藥殘留問題。
近幾年食品安全問題不斷升級，“瘦肉精”在食用動物飼料中的濫用受到人們越來越高的重視，因為該興奮劑殘留于食品基質中，通過食物鏈進入人體后，會對人體健康造成極大的危害。“瘦肉精”是一類動物用藥的統稱。它作為一類化學用品，而不是一種特定的物質，是指能夠促進瘦肉生長的藥物添加劑。任何能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長的物質都可以叫做“瘦肉精”。目前，能夠實現這種功能的物質是一類叫做β -興奮劑(β-agonist)的藥物，比如在中國造成中毒的克倫特羅(clenbuterol)和美國允許使用的萊克多巴胺(Ractopamine ),其他類似藥物還有沙丁胺醇(SalbutamoI)和特布他林(Terbutal ine)等，以及去年飼料中從未出現過的苯乙醇胺A，這種瘦肉精新品種的出現，再次敲響了我國食品安全警鐘。目前對于常見的興奮劑克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的檢測主要有酶聯免疫(ELISA)、氣相色譜-質譜法(GC-MC)、高效液相色譜法(HPLC)等檢測方法，但這些方法需要的設備昂貴，操作復雜，難于推廣。因而有必要建立一種簡便快捷、可靠，并且能同時檢測這五種物質的檢測方法，監控動物源性食品中的獸藥殘留，確保動物源性食品的安全。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能同時檢測克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的檢測卡，適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉、結果準確的檢測方法。本發明的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五聯膠體金檢測卡，由包被了克倫特羅單克隆抗體、萊克多巴胺單克隆抗體、沙丁胺醇單克隆抗體、苯乙醇胺A單克隆抗體和特布他林單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林共5種蛋白質偶聯物和兔抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板及塑料模具等組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發明的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五聯膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入質量濃度為1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL,配制成500 mL質量濃度為O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入質量濃度為1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 ·2Η20)溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； (2)抗體的預處理將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL;或者用O. 01 mol/L PBS將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克倫特羅或萊克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林單克隆抗體的蛋白溶液,反應10 min ；逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速1500 r/min離心20min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL，制備成克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物或萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物或沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物或苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物或特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物、萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物、萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金膜；
(5)包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成Img/mL、克倫特羅抗原稀釋成O. 3 mg/mL、萊克多巴胺抗原稀釋成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀釋成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀釋成I. 5mg/mLA和特布他林抗原稀釋成2. O mg/mL,用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(3)中的金標抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白(BSA) ,10 g鹿糖,加100mL 0.01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，過O. 22 濾膜，現配現用；金標抗體洗滌緩沖液是由 10 g 小牛血清蛋白(BSA)和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL所得。
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化鈉(NaCl)，用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。本發明可有效用于同時測定β-興奮劑克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五種物質，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
圖I為本發明五聯膠體金檢測卡的結構圖圖中I.加樣孔 2.克倫特羅檢測線
3.萊克多巴胺檢測線 4.沙丁胺醇檢測線5.苯乙醇胺A檢測線6.特布他林檢測線
7.質控線8.檢測孔9.試紙條10.檢測卡外殼；
圖2為本發明五聯膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中11.樣品墊12.膠體金結合墊13. PVC膠板14.包被膜15.吸水墊。
具體實施例方式實施例I
圖I為本發明五聯膠體金檢測卡的結構圖、圖2為本發明五聯膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖圖中13為PVC膠板；11為樣品墊；12為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；14為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了克倫特羅-BSA、萊克多巴胺-BSA、沙丁胺醇-BSA、苯乙醇胺A-BSA、特布他林-BSA和兔抗鼠IgG ；15為吸水墊。在PVC膠板13的一端上(樣品加樣端)粘附樣品墊11、膠體金結合墊12，樣品墊11搭接在膠體金結合墊12上。在PVC膠板13的中間粘附硝酸纖維素膜14。在硝酸纖維素膜14上設置有克倫特羅-BSA檢測線2、萊克多巴胺-BSA檢測線3、沙丁胺醇-BSA檢測線4、苯乙醇胺A-BSA檢測線5、特布他林檢測線6和兔抗鼠IgG質控線7。在PVC膠板13的另一端粘附吸水墊15。硝酸纖維素膜14的一端與結合墊9略交叉，另一端與吸水墊15略交叉。該試紙條9可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼10中，在檢測卡外殼10的上蓋上設有加樣孔I和檢測孔5，樣品墊8正對加樣孔1，硝酸纖維素膜14正對檢測孔8。實施例2
克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林五聯膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現
一、膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
二、抗體的預處理將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL;或者用O. 01 mol/L PBS將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
三、膠體金標記物的制備取步驟(一)中的膠體金溶液40mL，用O. 25 mol/L 1(20)3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克倫特羅或萊克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林單克隆抗體的蛋白溶液,反應10 min ；逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速1500 r/min離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL，制備成倫特羅克隆抗體蛋白質偶聯物或萊克多巴胺克隆抗體蛋白質偶聯物或沙丁胺醇克隆抗體蛋白質偶聯物或苯乙醇胺A克隆抗體蛋白質偶聯物或特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物；
四、膠體金膜的制備將步驟(三)克倫特羅克隆抗體蛋白質偶聯物、萊克多巴胺克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克倫特羅克隆抗體蛋白 質偶聯物、萊克多巴胺克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金膜；
五、包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成Img/mL、克倫特羅抗原稀釋成O. 3 mg/mL、萊克多巴胺抗原稀釋成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀釋成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀釋成I. 5mg/mLA和特布他林抗原稀釋成2. O mg/mL,用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
六、樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
七、檢測卡的組裝=PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。實施例3
最低檢出限量試驗
分別配制標準的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林標準品溶液濃度是0、0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、5 ng/mL ;滴加2滴樣品到到檢測卡加樣孔上,5min后觀察檢測線T和質控線C的顯色結果。經多次檢驗，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林的檢出率達99%以上，最低檢出限量少于5 ng/mL。
權利要求
1.檢測β-興奮劑類藥物的五聯檢測卡，其特征在于由包被了克倫特羅單克隆抗體、萊克多巴胺單克隆抗體、沙丁胺醇單克隆抗體、苯乙醇胺A單克隆抗體和特布他林單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林共5種蛋白質偶聯物和兔抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水棉、PVC膠板及塑料模具組成，在PVC膠板的一端 依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水棉。
2.根據權利要求I所述的檢測β_興奮劑類藥物的五聯檢測卡的制備方法，其特征在于由以下步驟制備得到 膠體金溶液制備取I L三角燒瓶I個，加入超純水495 mL，而后加入質量濃度為1%氯金酸5 mL，配制成500 mL質量濃度為O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入質量濃度為1%檸檬酸三鈉溶液5-7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； 抗體的預處理將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體在1000 r/min,4°C條件下,離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成Img/mL;或者用O. 01 mol/L PBS將要標記的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜； 膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用O. 25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg克倫特羅或萊克多巴胺或沙丁胺醇或苯乙醇胺A或特布他林單克隆抗體的蛋白溶液，反應10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫1500 r/min離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL，制備成克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物或萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物或沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物或苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物或特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物； 膠體金膜的制備將步驟(3)克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物、萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 μ /cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含克倫特羅單克隆抗體蛋白質偶聯物、萊克多巴胺單克隆抗體蛋白質偶聯物、沙丁胺醇單克隆抗體蛋白質偶聯物、苯乙醇胺A單克隆抗體蛋白質偶聯物和特布他林單克隆抗體蛋白質偶聯物的膠體金膜； 包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成I mg/mL、克倫特羅抗原稀釋成O. 3 mg/mL、萊克多巴胺抗原稀釋成O. 5 mg/mL、沙丁胺醇抗原稀釋成I mg/mL、苯乙醇胺抗原稀釋成I. 5 mg/mLA和特布他林抗原稀釋成2. O mg/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； 樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； 檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
3.根據權利要求2所述的檢測β_興奮劑類藥物的五聯檢測卡的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的金標抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白，10 g鹿糖,加100 mL O. 01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，過O. 22 Mffl濾膜，現配現用；金標抗體洗滌緩沖液是由10 g小牛血清蛋白和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL 所得。
4.根據權利要求2所述的檢測β_興奮劑類藥物的五聯檢測卡的制備方法，其特征在于所述步驟￠)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白和0.8 g氯化鈉，用含有O.5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本發明涉及檢測β-興奮劑類藥物的五聯檢測卡及其制備方法，涉及β-腎上腺素受體激動劑檢測技術領域。本發明的檢測卡外殼中有試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水棉組成；膠體金膜為含克倫特羅單克隆抗體、萊克多巴胺單克隆抗體、沙丁胺醇單克隆抗體、苯乙醇胺A單克隆抗體和特布他林單克隆抗體膠體金標記物的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有五條檢測線T線和一條質控線C線，質控線C線包被有兔抗鼠IgG抗體。本發明可同時檢測出克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A和特布他林，方法簡單、方便、快捷，結果準確。
文檔編號G01N33/577GK102901818SQ201210366379
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者杜道林, 洪霞, 薛永來, 張禎 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司