專利名稱：苯乙醇胺a的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
技術領域：
本發明涉及β -腎上腺素受體激動劑檢測技術領域，特別是涉及苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
背景技術：
近年來，接連不斷的瘦肉精事件已成為中國食品安全領域揮之不去的幽靈。去年，湖南省成功破獲一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生產、銷售案件，并從飼料中檢測出以前從未出現過的苯乙醇胺Α，這種瘦肉精新品種的出現，再次敲響了我國食品安全警
鐘。 苯乙醇胺Α，又稱“克倫巴胺”，可被非法添加于豬和牛的飼料中，有刺激動物生長，加強蛋白質在動物體內沉積，提高基礎代謝水平，使體脂趨于分解等作用，也可促進豬生長速度加快、使其皮紅毛亮、瘦肉率提高。人食用含這種瘦肉精的肉后，會出現惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，甚至誘發高血壓、心臟病等。因此，近期被農業部第1519號公告列為“禁止在飼料和動物飲水中使用的物質”。現有技術對于苯乙醇胺A的檢測主要是高效液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的缺陷明顯設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。
發明內容
針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出β -腎上腺素受體激動劑苯乙醇胺A的問題。本發明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理將要標記的苯乙醇胺A抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20min,取上清，用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； (6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化鈉(NaCl),用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發明可有效用于測定β -腎上腺素受體激動劑苯乙醇胺Α，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
圖I為本發明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡的結構圖圖中I.加樣孔 2.檢測線3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼；
圖2為本發明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9. PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
具體實施例方式實施例I
圖I為本發明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡的結構圖、圖2為本發明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG ;11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、膠體金結合墊8，樣品墊7和膠體金結合墊8為并排結構。在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設置有羊抗鼠IgG質控線3和苯乙醇胺A-BSA檢測線2。在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，在檢測卡外殼6的上蓋上設有加樣孔I和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。實施例2
苯乙醇胺A膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理將要標記的苯乙醇胺A抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20min,取上清,用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL, 過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。實施例3 最低檢出限量試驗
苯乙醇胺A最低檢出限量試驗
準確稱量O. 500 g苯乙醇胺A標準品溶于超純水并定容至100 mL,標為A1溶液，取A1溶液I mL于容量瓶加超純水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液I mL于容量瓶加超純水并定容至1000 mL,形成A3溶液，則A3溶液的濃度為5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液ImL于4支試管中，并分別標號廣4，往試管中分別加入往9 mL、4 mL、l mL、0 mL超純水，配成苯乙醇胺A標準品溶液濃度分別是0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL>5 ng/mL ;另取一支空試管，加入5 mL超純水,標為5號試管。取上述I、號試管中液體作為樣品滴加到苯乙醇胺A檢測卡上，加樣后5 min觀察結果，檢測線2和質控線3的顯色結果見表I。表I苯乙醇胺A最低檢出限量試驗
權利要求
1.苯乙醇胺A膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到 膠體金溶液制備取I L三角燒瓶I個，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 · 3H20 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7 · 2H20溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； 抗體的預處理將要標記的苯乙醇胺A抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm 濾膜； 膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用O. 25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4 , 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物； 膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜； 包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質偶聯物稀釋成I mg/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； 樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； 檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
2.根據權利要求I所述的苯乙醇胺A膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白和O. 8 g氯化鈉，用含有O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本發明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及β-腎上腺素受體激動劑檢測技術領域。本發明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含苯乙醇胺A單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有T線和C線，T線包被有苯乙醇胺A蛋白質偶聯物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發明有效用于快速檢測苯乙醇胺A，方便、快捷、結果準確。
文檔編號G01N33/577GK102901819SQ201210366789
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者杜道林, 洪霞, 張禎, 薛永來 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司