一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法

一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法
【專利摘要】本發明屬于中藥材的質量檢測領域，具體涉及一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法，所述的檢測方法為檢測菝葜藥材中綠原酸和Helicioside?A的含量，具體為菝葜藥材中綠原酸的含量≥0.10%，Helicioside?A的含量≥0.05%。本發明通過色譜條件優化，應用變換波長HPLC法首次同步測定菝葜中綠原酸和Helicioside?A兩個不同類別的水溶性藥效成分，對菝葜中藥材的檢測及相關中成藥的檢測、以及建立菝葜藥材及相關中成藥質量檢測標準具有重要的意義；本發明所提供的菝葜的檢測方法能較全面地反映菝葜水溶性代表活性成分，且具有快速、重現性好、穩定性好的特點。
【專利說明】一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于中藥材的質量控制領域，尤其涉及中藥材菝葜或同屬植物水溶性成分的含量檢測方法，還包括原料含有菝葜的中藥制劑的水溶性成分的含量檢測方法。
【背景技術】
[0002]菝葜為百合科植物菝葜(Smilax china L.)、長托菝葜(S.ferox Wall, exKunth)、黑果菝葜(S.glauco-china Warb.)、托柄菝葜(S.discotis Warb.)、小果菝葜(S.davidiana A.DC)、西南菝葜(S.biumbellata Warb.)、柔毛菝葜(S.chingii Wang etTang)、紅果菝葜(S.polycoleaffarb.)等植物的干燥根莖。秋末至次年春采挖，除去須根，洗凈，曬干或趁鮮切片，干燥。味甘，微苦澀，性平，歸肝腎經。傳統醫學認為其根莖具有藥用價值，具有祛風利濕、解毒散瘀的功效，可用于治療筋骨酸痛、小便淋漓、帶下量多和疔瘡癰腫。
[0003]菝葜為《中國藥典》自2005年版開始收載的品種之一，其[含量測定]項下選用薯蕷皂苷元作為含量測定指標，用酸水解法測定其中薯蕷皂苷元的含量。
[0004]“氣相色譜法測定菝葜中薯蕷皂苷元含量”【參見劉楊、王永慶、邱寧嬰等.氣相色譜法測定菝葜中薯蕷皂苷元含量[J].江蘇藥學與臨床研究，2004，12(4):14~15)】報道了一 種氣相色譜法測定菝葜中薯蕷皂苷元含量的方法，通過測定薯蕷皂苷元的含量對中藥材菝葜的質量進行控制。
[0005]申請號為200510200269.5的中國專利申請公開了一種中藥菝葜提取物的制備方法和質量控制方法，所公開的質量控制方法中是采用液相色譜法測定菝葜中薯蕷皂苷元含量的方法，從而通過測定薯蕷皂苷元的含量對中藥材菝葜的質量進行控制。
[0006]薯蕷皂苷經酸水解生成含有27個碳原子的薯蕷皂苷元，薯蕷皂苷與纖維素結合存在于細胞壁中，由于植物細胞壁比較堅韌，因而經典的酸水解法僅能提取1/4的皂苷元。目前總皂苷水解方法主要采用酸水解，另外還有采用兩相溶劑水解法和生物水解法。在酸水解過程中，值得注意的問題是常有副反應發生，一是若用鹽酸水解則有可能發生羥基氯代；二是薯蕷皂苷元易脫水轉變為A3’5-de0Xytig0genin，其所得量可隨酸的濃度、供試品稀釋程度增加而增加，而且苷比苷元更容易形成脫水產物。此外，還可發生25S轉25R構型的差向異構化，產生C 25-epimer及F環開環的化合物等，因此要注意控制好水解條件(聶凌鴻，林淑英，寧正祥.薯蕷屬植物中薯蕷皂苷元的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2004, 25(5):318~320)。菝葜藥材中大量的纖維素和淀粉的存在對水解有干擾作用，因而薯蕷皂苷元的收率低，對于菝葜的含量測定有很大的影響，也影響菝葜含量測定的準確性，同時考慮到薯蕷皂苷元為水解產物，因系水解產物且為非專屬性成分，目前藥品技術法規也不提倡使用水解產物作為含量測定指標，在實際檢驗操作中發現，上述方法存在專屬性差、操作繁瑣、可控性差、含量測定結果穩定性差等諸多不足，嚴重影響標準的可操作性。
[0007]為此本發明人在對菝葜開展系統植化研究的基礎上，將其含量測定指標選定為穩定可控的二氫黃酮醇苷類的活性成分落新婦苷和黃杞苷，提出了申請號為200810089423.X、發明名稱為“一種菝葜的質量控制方法”的發明專利申請，并獲得了發明專利權。在此基礎上將其[含量測定]指標修訂為測定其中主要二氫黃酮醇苷類代表性成分落新婦苷和黃杞苷，專屬性有了顯著提高，并列為《中國藥典》2010年版標準。
[0008]經過本發明人進一步研究，菝葜的質量檢測方法可進一步提高。菝葜作為常用大宗藥材，臨床應用非常廣泛，且該屬不同種很難區分，存在不同種混用的現象，因此亟待尋求一種可操作性的檢測方法，以建立更具專屬性、穩定性、可控性的質量標準，確保菝葜臨床用藥安全可控。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于提供一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法，該方法精密度、穩定性、重現性良好，有利于菝葜的質量控制和保障臨床安全用藥。
[0010]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
[0011]一種菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其中，所述的含量檢測方法為檢測菝葜藥材中綠原酸和/或HeliciosideA的含量。
[0012]本發明人根據菝葜臨床多以水煎入藥的特點，選擇從菝葜水溶性成分入手，首次從菝葜中分離得到綠原酸和HeliciosideA兩個代表性水溶性成分，而且綠原酸也是公認具有廣譜抗菌效果的活性成分，與菝葜在臨床上用于抗菌消炎的作用是相關的，故以此作為藥效成分控制菝葜藥材質量，具有較好的質量藥效相關性。
[0013]本發明所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法中，菝葜藥材中綠原酸的含量≥0.10%, HeliciosideA的含量≥0.05% ;優選菝葜藥材中綠原酸的含量≥0.20%，HeliciosideA的含量> 0.10%。本發明人經過系統的檢測方法學研究，采用變換波長法，建立了 HPLC法同步測定這兩個不同類別代表性成分的含量測定方法，含量測定結果表明，兩個成分均為其主要成分之一，可用于菝葜的檢測，建立菝葜中藥材的質量標準。
[0014]具體地說，本發明所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法包括如下步驟:
[0015]I)色譜條件
[0016]以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-酸水、乙腈-酸水或者甲醇-乙腈-酸水混合溶液為流動相；檢測波長:綠原酸為325nm，HeliciosideA為283nm ;柱溫:35°C ;流速:
1.0ml.mirT1,綠原酸和HeliciosideA對應的保留時間分別為7.3min和13min ；
[0017]2)供試品溶液的制備
[0018]取菝葜粉末1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入提取溶劑25ml，密塞，稱定重量，提取，放冷，稱定重量，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；
[0019]3)對照品溶液的制備
[0020]精密稱取綠原酸和HeliciosideA各IOmg,分別制成濃度為Img.ml-1對照品溶液儲備液，分別吸取兩儲備液各Iml于同一個IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得綠原酸
0.1039mg.mF1 和 HeliciosideA0.0980mg.mF1 的混合對照品溶液；
[0021]4)測定法
[0022]分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；菝葜中含綠原酸≥0.10%，含Helicioside A≥0.05% ;優選菝葜中含綠原酸≥0.20%，含HeliciosideA ^ 0.10%。[0023]本發明人采用高效液相色譜法同時檢測菝葜藥材中綠原酸和HeliciosideA的含量，通過檢測方法學研究，優化了處理方法，色譜條件，表明本含量檢測方法具有操作簡便、準確、重復性好等特點，能夠較好地檢測菝葜藥材的質量。
[0024]更進一步的，步驟I)中所述的以十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱為YMCpackODS-AQ液相色譜柱，優選型號為4.6 X 250mm5 μ m的YMC pack ODS-AQ液相色譜柱。
[0025]步驟I)中所述的流動相為體積比11:89的乙腈-水、體積比11:89的乙腈-0.2%磷酸溶液或體積比10:8:82甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；優選體積比10:8:82的甲醇-乙
腈-0.2%磷酸溶液。
[0026]步驟2)中所述的提取溶劑為丙酮、乙醇或甲醇，優選甲醇，更優選80%甲醇。
[0027]步驟2)中所述的提取為超聲提取、回流提取或索氏提取，優選超聲提取，更優選超聲提取45min，更優選在功率250W、頻率40kHz的條件下超聲提取45min。
[0028]本發明中，所述的菝葜藥材包括同屬不同種的菝葜，具體包括長托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓。
[0029]本發明所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法也適宜于同屬不同種的菝葜，如長托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓等。
[0030]與現有技術相比，本發明所提供的方法具有如下優點:
[0031 ] (I)本發明通過色譜條件優化，應用變換波長HPLC法首次同步測定菝葜中綠原酸和HeliciosideA兩個不同類別的水溶性藥效成分，對菝葜中藥材的檢測及相關中成藥的檢測、以及建立菝葜藥材及相關中成藥質量檢測標準具有重要的意義；
[0032](2)本發明所提供的菝葜水溶性成分的含量檢測方法能較全面地反映菝葜水溶性代表活性成分，且具有快速、重現性好、穩定性好的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為HeliciosideA純度色譜圖；
[0034]圖2 為 HeliciosideA 光譜圖；
[0035]圖3-a為283nm檢視菝葜樣品色譜圖；
[0036]圖3-b為325nm檢視菝葜樣品色譜圖；
[0037]圖4-a為混合對照品HPLC圖和相應對照品的光譜圖；
[0038]圖4-b為混合對照品HPLC圖和相應對照品的光譜圖；
[0039]圖4-c為混合對照品HPLC圖和相應對照品的光譜圖；
[0040]圖5-a為菝葜樣品HPLC圖與對照品相應保留時間的峰的光譜圖；
[0041]圖5-b為菝葜樣品HPLC圖與對照品相應保留時間的峰的光譜圖；
[0042]圖5-c為菝葜樣品HPLC圖與對照品相應保留時間的峰的光譜圖；
[0043]圖6為綠原酸標準曲線；
[0044]圖7 為 HeliciosideA 標準曲線。
【具體實施方式】
[0045]以下為本發明的【具體實施方式】，所述的實施例是為了進一步描述本發明，而不是限制本發明。[0046]【實施例1】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0047]I)色譜條件
[0048]色譜柱:YMC pack 0DS-AQ液相色譜柱(4.6X250mm5 μ m);流動相:體積比10:8:64甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；檢測波長:綠原酸為325nm，HeliciosideA為283nm ;柱溫:35°C;流速:1.0ml.mirT1,綠原酸和HeliciosideA對應的保留時間分別為7.3min和13min ；
[0049]2 )供試品溶液的制備
[0050]取菝葜粉末1.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml作為提取溶劑，密塞，稱定重量，超聲提取45min (功率250W、頻率40kHz)，放冷，稱定重量，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得；
[0051 ] 3)對照品溶液的制備
[0052]精密稱取綠原酸和HeliciosideA各IOmg,分別制成濃度為Img.π-1對照品溶液儲備液，分別吸取兩儲備液各Iml于同一個IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得綠原酸0.1039mg.mF1 和 HeliciosideA0.0980mg.mF1 的混合對照品溶液；
[0053]4)測定法
[0054]分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得；菝葜中含綠原酸≥0.10%，含HeliciosideA≥0.05%。
[0055]【實施例2】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0056]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取溶劑為50%甲醇。
[0057]【實施例3】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0058]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取溶劑為乙醇。
[0059]【實施例4】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0060]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取為回流提取2小時。
[0061]【實施例5】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0062]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取為超聲提取30mino
[0063]【實施例6】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0064]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取溶劑為丙酮。
[0065]【實施例7】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0066]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟I)中的流動相為體積比11:89的乙臆-水。
[0067]【實施例8】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0068]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟I)中的流動相為體積比11:89的乙腈-0.2%溶液。
[0069]【實施例9】菝葜水溶性成分的含量檢測方法
[0070]具體操作步驟同實施例1，與實施例1不同的是步驟2)中的提取為索氏提取。
[0071]試驗例I
[0072]1、儀器、藥品與試劑
[0073]1.1 儀器[0074]Waters2695高效液相色譜儀，waters996 二極管矩陣檢測儀，Empower色譜工作站。1.2藥品與試劑
[0075]綠原酸(對照品)；HeliciosideA (對照品，純度大于98.0%);不同產地的菝葜藥材由桂林三金藥業股份有限公司提供，經鄭躍年高級工程師鑒定；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸為分析純。
[0076]1.2.1HeliciosideA 純度檢測
[0077]精密稱取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的HeliciosideA對照品各10.0mg,置IOml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻，制成每1ml含1.0mg的HeliciosideA對照品溶液，精密吸取10 μ 1，注入液相色譜儀，PAD-UV設置為190至400nm全波段檢測，記錄色譜儀，每40nm為間隔采集數據一次，用歸一化法計算HeliciosideA平均含量為99.28%，符合含量測定用對照品純度要求，考慮到實際測定方便，測定中將對照品含量以100%計。結果見表1，色譜圖見圖1、圖2。其結構式如下:
[0078]
【權利要求】
1.一種菝 葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，所述的含量檢測方法為檢測菝葜藥材中綠原酸和/或Helicioside A的含量。
2.根據權利要求1所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，菝葜藥材中綠原酸的含量≥0.10%, Helicioside A的含量≥0.05% ;優選菝葜藥材中綠原酸的含量≥ 0.20%, Helicioside A 的含量≥ 0.10%。
3.根據權利要求2所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，所述的含量檢測方法包括如下步驟: 1)色譜條件 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-酸水、乙腈-酸水或者甲醇-乙腈-酸水混合溶液為流動相；檢測波長:綠原酸為325nm，Helicioside A為283nm ;柱溫:35°C ;流速:1.0ml.mirT1,綠原酸和Helicioside A對應的保留時間分別為7.3min和13min ； 2)供試品溶液的制備 取菝葜粉末1.5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入提取溶劑25ml，密塞，稱定重量，提取，放冷，稱定重量，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得； 3)對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸和Helicioside A各IOmg,分別制成濃度為Img ^mr1對照品溶液儲備液，分別吸取兩儲備液各Iml于同一個IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得綠原酸0.1039mg.mF1 和 Helicioside A0.0980mg.mF1 的混合對照品溶液； 4)測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ l，注入液相色譜儀，測定，即得；菝葜中含綠原酸≥0.10%，含Helicioside A≥0.05% ;優選菝葜中含綠原酸≥0.20%，含Helicioside A≥0.10%。
4.根據權利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，步驟I)中所述的以十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱為YMC pack ODS-AQ液相色譜柱，優選4.6 X 250mm5 μ m 的 YMC pack ODS-AQ 液相色譜柱。
5.根據權利要求4所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，步驟1)中所述的流動相為體積比11:89的乙腈-水、體積比11:89的乙腈-0.2%磷酸溶液或體積比10:8:82甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；優選體積比10:8:82的甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液。
6.根據權利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述的提取溶劑為丙酮、乙醇或甲醇。
7.根據權利要求6所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，所述的提取溶劑為甲醇，優選80%甲醇。
8.根據權利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述的提取為超聲提取、回流提取或索氏提取。
9.根據權利要求8所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，所述的提取為超聲提取，優選超聲提取45min，更優選在功率250W、頻率40kHz的條件下超聲提取45min。
10.根據權利要求1-9任意一項所述的菝葜水溶性成分的含量檢測方法，其特征在于，所述的菝葜藥材包括同屬不同種的菝葜，具體包括長托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓。
【文檔編號】G01N30/02GK103901118SQ201210576168
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優先權日:2012年12月26日
【發明者】鄒節明, 周艷林 申請人:桂林三金藥業股份有限公司