淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的制作方法

淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體，該核酸適體具有G-四分體結構、且為選自由下述多核苷酸組成的組中的至少1種：(1)由序列編號1～序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸；(2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號18的任意之一所表示的堿基序列中有1個或2個以上堿基發生缺失、取代或者添加而成的堿基序列所構成的多核苷酸；以及(3)多核苷酸，其是含有所述(1)或(2)的多核苷酸作為結構單元的多聚體。
【專利說明】淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體
【技術領域】
[0001]本發明涉及淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體及其應用。
【背景技術】
[0002]α -突觸核蛋白(a -Syn)是在帕金森氏病(PD)或路易氏體失智癥(DLB)中所觀察到的包涵體的主結構蛋白，據認為，其通過聚集而得到細胞毒性、引起疾病。據報告，作為a -Syn聚集中間體的α -突觸核蛋白低聚物顯示出了比最終形成的淀粉樣纖維更高的細胞損傷性，因而暗示出α -突觸核蛋白低聚物可能為H)、DLB發癥中的毒性主體。
[0003]此外，并不限于α-突觸核蛋白，阿茲海默氏病、感染性蛋白質病、多聚谷氨酰胺病、亨廷頓舞蹈癥等的發病還分別與β淀粉樣肽和Tau蛋白、感染性蛋白、多聚谷氨酰胺肽、亨廷頓蛋白等淀粉樣蛋白的累積有很大相關。另外，這些淀粉樣蛋白也是在體內以可溶化形態持續存在的蛋白質，在受到某些刺激時構型發生變化而形成低聚物，其后變成不溶化形態的淀粉樣纖維。
[0004]在以這些淀粉樣蛋白的沉積等為原因的疾病中，對淀粉樣蛋白低聚物的特異性檢測在疾病原因的探究查明中是必要的。此外，只要能夠把握低聚物在組織內的局部存在，則在預防及診斷中也是有效的。
[0005]因此開發出了用于特異性檢測低聚物形態的淀粉樣蛋白的各種技術。例如，在日本特表2010-531992號公報和日本特表2010-530227中公開了抗淀粉樣β肽的抗體。此夕卜，在日本特表2010-502938號公報和日本特表2010-537962號公報中公開了抗淀粉樣β蛋白的單克隆抗體。
[0006]另一方面，已知有作為與任意分子特異結合的多核苷酸分子的核酸適體。核酸適體可使用市售的核酸合成機化學全合成，與特異抗體相比，成本非常低，并且易于修飾，因而具有可設計結構變化的 優點。進一步地，與肽不同，即使在高溫發生變性，也會恢復原狀，因而穩定性優異。核酸適體形成特定的三維結構，對目標分子發揮出選擇性的分子識別功能。作為核酸適體的三維結構，迄今為止據報告其可采取發夾型、假結型、凸環型、G-四分體型之類的各種形態。
[0007]作為用于檢測α -突觸核蛋白的核酸適體，已知具有2個以上發夾型結構的核酸適體Μ5-15 (參照 Biotechnol.Lett., (2010) vol.32, pp.643-648)。據記載，該與 α -突觸核蛋白結合的核酸適體Μ5-15不僅可識別低聚體型的突觸核蛋白，還可識別單體型的α-突觸核蛋白。

【發明內容】

[0008]發明所要解決的課題
[0009]如上所述，需要特異性識別淀粉樣蛋白低聚物，但尚未得到對于特異性識別淀粉樣蛋白低聚物有用的核酸適體。
[0010]因而，本發明的目的在于提供能夠特異性識別淀粉樣蛋白低聚物的核酸適體和使用其的淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法。
[0011]解決課題的手段
[0012]本發明提供下述方式。
[0013][I] 一種對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體，該核酸適體具有G-四分體結構、且為選自由下述多核苷酸組成的組中的至少I種:
[0014](I)由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸；
[0015](2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列中有I個或2個以上堿基發生缺失、取代或者添加而成的堿基序列所構成的多核苷酸；以及
[0016](3)多核苷酸，其是含有所述(I)或(2)的多核苷酸作為結構單元的多聚體。
[0017][2]如[I]所述的核酸適體，其中，所述(3)的多核苷酸具有所述⑴或(2)的多核苷酸與將各(I)或(2)的多核苷酸間連接的接頭序列。
[0018][3] 一種淀粉樣蛋白低聚物檢測試劑盒，其含有[I]或[2]所述的核酸適體。
[0019][4] 一種淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法，該方法包括以下步驟:使[I]或[2]所述的核酸適體與待檢試樣接觸；以及對所述待檢試樣中的淀粉樣蛋白低聚物和所述核酸適體的復合物進行檢測。
[0020][5]如[4]所述的淀粉樣蛋白低聚物檢測方法，其中，所述待檢試樣為選自由髓液、血清、血漿和它們的稀釋物組成的組中的至少I種。
[0021][6] 一種多核苷酸,其由序列編號I?序列編號18的任意之一所表不的堿基序列構成。
[0022][7] 一種多聚體多核苷酸，其是含有由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸作為結構單元的多聚體。
[0023]發明的效果
[0024]根據本發明，能夠提供可特異性識別淀粉樣蛋白低聚物的核酸適體和使用該核酸適體的淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為示出了實施例1中的對各核酸適體相對于α -突觸核蛋白單體、低聚物或纖維的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
[0026]圖2為示出了實施例1中的對各核酸適體相對于各種蛋白質的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
[0027]圖3為示出了實施例1中的對各核酸適體相對于β淀粉樣肽A β H0的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
[0028]圖4為示出了實施例2中的對各核酸適體相對于α -突觸核蛋白單體、低聚物或纖維的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
[0029]圖5為示出了實施例3中的各核酸適體相對于A β蛋白的結合能力的圖表。
[0030]圖6為示出了實施例3中的對二聚體型核酸適體相對于β淀粉樣肽A β H。的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
[0031]圖7為示出了實施例4中的改良型核酸適體相對于Αβ蛋白的結合能力的圖表。[0032]圖8為示出了實施例4中的2G16和3G4的PAGE解析結果的圖像。
[0033]圖9為示出了實施例4中的對二聚體型核酸適體相對于β淀粉樣肽A β H。的結合能力進行比較的核酸適體印跡分析結果的圖。
【具體實施方式】
[0034]本發明的核酸適體為對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體，其為具有G-四分體結構的多核苷酸，且為選自由下述多核苷酸組成的組中的至少I種:
[0035](I)由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸；
[0036](2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列中有I個或2個以上堿基發生缺失、取代或者添加而成的堿基序列所構成的多核苷酸；以及
[0037](3)具有上述⑴或(2)的多核苷酸的多核苷酸，其是至少二聚體以上的多聚體。
[0038]本發明的相對于淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體(下面稱為“淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體”)具有特定的堿基序列或與其類似的堿基序列，為具有G-四分體結構的核酸適體，因而根據淀粉樣蛋白的構型變化，可特異性識別、結合低聚物。
[0039]若進一步進行說明，則如上所述，淀粉樣蛋白的構型可變更為單體型、低聚體型和纖維型。本發明中發現，具有G-四分體結構的所述特定的核酸適體相對于低聚體型與單體型的結合能力不同。通過使用這樣的G-四分體型核酸適體，可特異性識別出低聚體型的淀粉樣蛋白。
[0040]所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的特異性意味著能夠對淀粉樣蛋白與淀粉樣蛋白以外物質進行區分 、并且能夠對淀粉樣蛋白單體與淀粉樣蛋白低聚物進行區分的特異性。此外，所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體也可以具有相對于淀粉樣蛋白纖維的結合性。
[0041]需要說明的是，本說明書中的“核酸適體”表示與特定分子結合的核酸配位體。
[0042]本說明書中的“工序”這一用語不僅為獨立工序，是在無法與其它工序明確區別的情況下，只要可達成本工序所期望的作用，也包含在本術語中。
[0043]此外，本說明書中使用“?”表示的數值范圍表示的是分別含有“?”的前后所記載的數值作為最小值和最大值的范圍。
[0044]此外，在本發明中，在提及組合物中各成分的量的情況下，在組合物中相當于各成分的物質存在有兩種以上的情況下，只要不特別聲明，就意味著組合物中存在的該兩種以上物質的總量。
[0045]下面對本發明進行說明。
[0046]〈淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體〉
[0047]本發明的淀粉樣蛋白結合核酸適體為對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體，其為具有G-四分體結構的多核苷酸，選自由以下多核苷酸組成的組中的至少I種。
[0048](I)由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸；以及
[0049](2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?18的任意之一所表不的喊基序列中有I個或2個以上喊基發生缺失、取代、或者添加而成的喊基序列所構成的多核苷酸；
[0050](3)具有上述(I)或(2)的多核苷酸的多核苷酸，其是至少二聚體以上的多聚體。
[0051]若為這樣的序列，則具有G-四分體結構，能夠特異性識別淀粉樣蛋白低聚物。
[0052]T-S0517:GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG (序列編號 I)
[0053]T-S0606:GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA (序列編號 2)
[0054]T-S0554:CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG (序列編號 3)
[0055]T-S0530:GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG (序列編號 4)
[0056]T-S0552:GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG (序列編號 5)
[0057]T-S0504: CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG (序列編號 6)
[0058]T-S0508:GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG (序列編號 7)
[0059]T-S0602:GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG (序列編號 8)
[0060]2G16: CGAGGGGCGTCTGGGGGGGAGGGA (序列編號 9)
[0061 ] 2G4: CGGGGGGCGTGTGGGAGAGGTCGG (序列編號 10)
[0062]2G13:TGGGGGGCGTAGGGTCGCGAACGA (序列編號 11)
[0063]2G9:CGGGGGGC GTAGGGGAGAGGGGCG (序列編號 12)
[0064]3G4:CGGGGGGCCTGAGGGGGGGAGGGA (序列編號 13)
[0065]3G21:CGGGGCGCATCTGGGGGGGAGGGA (序列編號 14)
[0066]3G16:CGGGGGGCTTGTGGCGGGGAGGGA (序列編號 1δ)
[0067]3G22:CGAGGGGAGTAGGGGGGAGGGGCG (序列編號 16)
[0068]3G14:CGGGGGGCGTCTGGGCGCGAGGGA (序列編號 17)
[0069]3G9:CGGGGGCCGTTGGGGGGGGAGGGA (序列編號 18)
[0070]G-四分體結構為本領域公知的結構。該結構為在鳥苷核苷酸(G)中富含的DNA或RNA中的分子間和分子內的四鏈結構。G-四分體結構中，鳥嘌呤核苷堿基與其相鄰的鳥嘌呤核苷堿基一起形成2個氫鍵，4個鳥嘌呤核苷堿基在環狀Hogsten H結合配置相連，從而形成該結構。最終G-四分體結構相互堆積，取四分子螺旋結構。
[0071]其為具有G-四分體結構的核酸適體這一點可利用公知的測定手段來確認。例如，可使用CD光譜，通過對特定波形進行確認來確認其為具有G-四分體結構的核酸適體。例如，可以將核酸適體溶解在TBS緩沖液(10m MTris-HCl U50mM NaCl、5mMKCl、pH7.4)中，制備試樣液，基于在溫度20°C、波長200nm?320nm、掃描速度IOOnm/分鐘、積分次數10次的條件下進行光譜測定時的條件進行的CD光譜中，通過240nm附近的最小值和260nm附近的最大值的出現來進行確認。
[0072]作為構成核酸適體的核苷酸的種類，只要可根據核苷酸所含有的堿基的種類構成G-四分體結構就沒有特別限制，可以舉出脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等。此外，本發明的核酸適體中的核苷酸中也可以包括肽核酸等核酸類似物(疑似核酸)。此外，所述核苷酸也可以含有修飾核苷酸。作為所述核酸適體，從目標物質反應時立體結構上的柔軟性的方面出發，優選核糖核苷酸、即RNA。
[0073]作為修飾核苷酸，可以舉出例如對RNAase具有耐性的修飾核苷酸、用于熒光檢測的標記化核苷酸等。作為標記，可以舉出能夠在該領域中使用的已知標記，可以舉出FITC等熒光物質、生物素、抗生物素蛋白等。[0074]所述(2)的核酸適體為由下述堿基序列構成的多核苷酸:該序列具有G-四分體結構，至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?18的任意之一所表示的堿基序列中有I個或2個以上的堿基發生缺失、取代、或者添加而成的。只要為這樣的多核苷酸，即可與由所述序列編號I?18的任意之一所表不的堿基序列構成的多核苷酸同樣地具有G-四分體結構、具有對淀粉樣蛋白低聚物的結合性。
[0075]所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的核苷酸長度為20?30，從對淀粉樣蛋白的結合能力的方面出發，優選為23?25。
[0076]所述(2)的核酸適體至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸。此處“至少2個連續的鳥苷核苷酸”是指序列中的鳥苷核苷酸以2個或其以上的數目相連續。此外“至少含有4組”意味著至少2個連續的鳥苷核苷酸在序列中含有4組以上。需要說明的是，例如在4個鳥苷核苷酸連續的情況下，表示2個連續的鳥苷核苷酸以2組相連續。從確實地構成G-四分體結構、確實地識別淀粉樣蛋白低聚物的方面考慮，2個連續以上的鳥苷核苷酸在序列中優選含有4組。此外，從更為確實地識別淀粉樣蛋白低聚物的方面考慮，進一步優選23?25個核苷酸長度、且序列中的鳥苷核苷酸為14?15位的多核苷酸。
[0077]只要可滿足所述(2)的核酸適體中的鳥苷核苷酸數目的條件、可與低聚體型淀粉樣蛋白特異性地結合，本發明中的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體也可以為序列編號I?18的任意之一所表示的堿基序列中有I個或2個以上的堿基發生缺失、取代、或者添加而成的。作為所述的2個以上,例如可為2?5個。
[0078]只要為這樣的淀粉樣蛋白結合核酸適體，即可特異性識別低聚體型淀粉樣蛋白。
[0079]此外，只要可滿足所述(2)的核酸適體中的鳥苷核苷酸的數目的條件、可與低聚體型淀粉樣蛋白特異性地結合，本發明中的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體也可以具有與序列編號I?18的任意之一所 示堿基序列的互補堿基序列在嚴格條件下雜交的序列。
[0080]此處所謂嚴格條件是指形成特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。典型的嚴格條件可以舉出例如在鉀濃度為約25mM?約50mM以及鎂濃度為約1.0mM?約5.0mM下進行雜交的條件。
[0081]對于所述核酸適體，可進行基于SELEX(配體指數級系統進化技術，systemicevolution of ligands by exponential enrichment)法的試驗管內篩選，由無規的多核苷酸文庫中根據與目標物質的結合能力進行篩選。
[0082]此外，對于所得到的核酸適體，可以以相對于低聚體型淀粉樣蛋白的結合能力為指標，進一步對核酸適體的序列進行最佳化，來得到其它核酸適體。作為進行最佳化的方法，可以舉出所謂計算機內進化法(In silico maturation)。計算機內進化法由下述操作組成:在體外(in vitro)進行核酸適體的評價和排序的操作、以及序列的重組、改組以及各種變異導入等的基于計算機上(in silico)的進化模擬算法的新穎序列的制作的操作。這兩個操作合起來稱為第一代，通過反復進行幾代的操作，得到具有目的功能的核酸適體序列(例如，參照 Nucleic Acids Res., (2005) vol.33 (12), pp.el08 ；Biochem BiophysRes Commun., (2006)vol.347(I), pp.226-31 ；Biosens Bioelectron., (2010)vol.15 ；26 (4), pp.1386-91)。
[0083]此外，對于序列已知的核酸適體，也可利用常規方法進行化學合成。
[0084]所得到的核酸適體對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性這一點可通過印跡分析等常規方法進行確認。
[0085]例如，在印跡分析的情況下，按下述方法進行。
[0086]將淀粉樣蛋白低聚物0.5yg?Iyg固定在硝酸纖維素膜上，準備印跡用膜。將作為對象的核酸適體與熒光物質Hf-nFITC)連接，制備試樣核酸適體。
[0087]對于上述印跡用膜，添加以50nM?5μ M的濃度含有所得到的試樣核酸適體的TBS-T 溶液(25mM tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.005M KC1、0.05%Tween20)，在室溫下培養I小時。其后使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2minX2次、IOminX I次)。
[0088]將清洗后的硝酸纖維素膜與用經TBS-T稀釋1000倍的檢測用酶(例如，HRP)修飾的所述熒光物質的抗體(例如，抗FITC抗體)一起在室溫下培養I小時。其后使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(211-11\2次、101-11\1次、5minX2次)。
[0089]接下來添加所述檢測用酶的底物，通過檢測化學發光來評價試樣核酸適體與淀粉樣蛋白低聚物的結合。
[0090]作為淀粉樣蛋白結合核酸適體所能夠識別的淀粉樣蛋白，可以舉出產生了構型變化的淀粉樣蛋白，可以舉出例如α-突觸核蛋白(帕金森氏病相關淀粉樣蛋白)、β淀粉樣肽(阿爾茲海默型認知癥相關淀粉樣蛋白)、感染性蛋白質蛋白質(所謂瘋牛病相關淀粉樣蛋白)、Tau蛋白質(阿爾茲海默型認知癥相關淀粉樣蛋白)、多聚谷氨酰胺肽(多聚谷氨酰胺病相關淀粉樣蛋白)、亨廷頓蛋白(亨廷頓舞蹈癥相關淀粉樣蛋白)等。
[0091]所述淀粉樣蛋白結合核酸適體可以為含有上述(I)或(2)的多核苷酸作為結構單元的多聚體(下面稱為多聚體核酸適體)。與僅為構成多聚體核酸適體的(I)或(2)的多核苷酸(下面稱為結構單元)的核酸適體相比，這樣的多聚體核酸適體可提高與淀粉樣蛋白低聚物的結合力。
[0092]作為這樣的多聚體核酸適體，可以舉出將所述結構單元2個連接而成的二聚體型、3個連接而成三聚體型、3個連接而成的四聚體型，以及5聚體以上、例如由10?30所述結構單元形成的多聚體。此外，多聚體核酸適體可以為二聚體?四聚體程度。若為二聚體以上，則具有提高與淀粉樣蛋白低聚物的結合性的傾向；通過為四聚體程度，具有可得到與所述結構單元數目相應的相對于淀粉樣蛋白低聚物結合性提高的效果的傾向。
[0093]作為所述多聚體核酸適體，所述結構單元可以串聯連接，也可以為樹狀聚體型。在串聯連接的情況下，作為連接的形態，可以舉出結構單元同向連接(即(頭-尾)(頭-尾)型)和反向連接(即(頭-尾)(尾-頭)型)的形態。在樹狀聚體型的情況下，作為核部分，可以舉出乙二胺、1，6-己二胺等。
[0094]在這些多聚體低聚物中的單體單元之間可以含有接頭序列。
[0095]作為接頭序列，可以舉出由鳥苷核苷酸以外的核苷酸、胸苷核苷酸或胞嘧啶核苷酸2個以上相連續而形成的序列等。作為接頭序列的長度，可以為2?15，從提高結合能力的方面考慮，優選為3?10。
[0096]所述淀粉樣蛋白結合核酸適體可以單獨使用，也可將2種以上組合。此外，在多聚體的情況下，也可以為所述結構單元數目不同的核酸適體的組合。
[0097]此外，所述淀粉樣蛋白結合核酸適體在其兩端可以具有附加序列。作為這樣的附加序列，可以舉出由鳥苷核苷酸以外的核苷酸、胸苷核苷酸或胞嘧啶核苷酸2個以上連續而形成的序列等。這樣的附加序列例如是為了保持低聚核苷酸末端標記中的標記物的功能而設置的。作為所述附加序列，可以舉出5個連續的胸苷核苷酸、腺嘌呤核苷酸等。通過設置5個連續的胸苷核苷酸，例如可防止進行熒光標記的情況下熒光強度的降低。
[0098]所述淀粉樣蛋白結合核酸適體可使用已知的方法根據序列進行化學合成，只要為本領域技術人員，即可適宜選擇用于得到淀粉樣蛋白結合核酸適體的合成方法。
[0099]〈淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法〉
[0100]本發明的淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法包含下述工序:使所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與體液試樣接觸(接觸工序)；以及對體液中的淀粉樣蛋白低聚物和所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的復合物進行檢測(檢測工序)。
[0101]上述淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法中，使具有上述特定序列、可與淀粉樣蛋白特異性結合的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與作為目標分子的淀粉樣蛋白低聚物接觸、并對由它們構成的復合物進行檢測，因而可對試樣中的淀粉樣蛋白低聚物進行特異性檢測。
[0102]對于作為淀粉樣蛋白低聚物·的檢測對象的體液試樣，只要為可能存在有淀粉樣蛋白低聚物的待檢試樣就沒有特別限制，可以使用髓液、血清和血漿等體液或其稀釋物。只要這些待檢試樣可由被測物中分離出即可。
[0103]在淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與待檢試樣接觸前，可以設有待檢試樣的制備工序。作為這樣的制備工序，可以舉出:由被測物中的采集；采集試樣的稀釋，使用適當的稀釋液稀釋至適于檢測的濃度；等等。
[0104]關于接觸工序中淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與待檢試樣的接觸沒有特別限制，可以直接應用核酸適體與目標分子的接觸中通常使用的條件。在待檢試樣中存在目標淀粉樣蛋白低聚物的情況下，可在試樣中形成淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與目標淀粉樣蛋白低聚物的復合物。
[0105]在檢測工序中，對于接觸工序中形成的所述復合物進行檢測。需要說明的是，本檢測工序中的術語“檢測”不僅包括試樣中有無所述復合物的檢測，還包括對試樣中的所述復合物進行定量。此外，通過使用校正曲線由所述復合物的檢測或定量來進行試樣中中的目標淀粉樣蛋白低聚物的檢測或定量也可利用常規方法來進行。
[0106]待檢試樣中的目標淀粉樣蛋白低聚物的檢測或定量可利用基于核酸適體的通常公知的方法來進行，例如，利用下述公知方法均可進行:不使用抗體而利用核酸適體的免疫測定法(免疫色譜法或ELISA(酶聯免疫吸附法，Enzyme linked Immunosorbent Assay)；或W02005/049826號或W02007/086403號所記載的測定方法；或核酸適體印跡法(日本特開2008-8237042號)、或者表面等離子共振法(SPR);等等。
[0107]作為可利用本檢測方法進行檢測的淀粉樣蛋白低聚物，可以舉出產生構型變化而得到的淀粉樣蛋白的低聚物。作為這樣的淀粉樣蛋白，可以舉出例如:α-突觸核蛋白(帕金森氏病相關淀粉樣蛋白)、β淀粉樣肽(阿爾茲海默型認知癥相關淀粉樣蛋白)、感染性蛋白質蛋白質(所謂瘋牛病相關淀粉樣蛋白)、Tau蛋白質(阿爾茲海默型認知癥相關淀粉樣蛋白)、多聚谷氨酰胺肽(多聚谷氨酰胺病相關淀粉樣蛋白)、亨廷頓蛋白(亨廷頓舞蹈癥相關淀粉樣蛋白)；以及SODl蛋白、TDP-43蛋白(肌萎縮性側索硬化癥相關蛋白)、胰淀素(7 S U >，II型糖尿病相關蛋白)、血漿淀粉樣A蛋白、溶酶體蛋白(全身性淀粉樣變性相關蛋白)、β 2微球蛋白(透析性淀粉樣變性相關蛋白)等。
[0108]<淀粉樣蛋白低聚物檢測試劑盒>[0109]本發明的淀粉樣蛋白低聚物檢測試劑盒含有所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體。
[0110]如上所述，本試劑盒所含有的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體可特異性地檢測淀粉樣蛋白低聚物，因而通過使用本試劑盒可簡便地檢測淀粉樣蛋白低聚物。
[0111]本試劑盒可以包括:容納所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體的容納部；以及記載了使用所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體檢測淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法的產品說明書。此外還可以包括容納稀釋劑的稀釋劑用容納部，該稀釋劑用于將作為檢測淀粉樣蛋白低聚物的對象的待檢試樣稀釋到適度的濃度；此外，也可不包括該稀釋劑用容納部而包括容納其它試劑的試劑容納部。
[0112]對于本試劑盒中的“容納部”，只要是對于各藥劑不混合而獨立存在為有效的形態就沒有特別限制，例如，可以為容器或個別包裝形態等，也可以是作為以一個片狀獨立區分的區域的形態。
[0113]作為試劑盒可能包括的其它試劑，可以舉出可用于檢測所述復合物的試劑、陽性或陰性對照樣品等。
[0114]〈其它用途〉
[0115]如上所述本發明的一個方式提供了:(I)由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸；(2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?18的任意之一所表不的喊基序列中有I個或2個以上的喊基發生缺失、取代、或者添加而成的堿基序列所構成的多核苷酸；以及(3)含有由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸作為結構單元的多聚體多核苷酸。
[0116]這些多核苷酸或多聚體多核苷酸除上述用途外還可用于各種用途中。
[0117]特別是由于所 述多核苷酸或多聚體多核苷酸作為淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體對淀粉樣蛋白低聚物具有特異結合性，因而可在以淀粉樣蛋白低聚物為目標的各種方式中進行使用。
[0118]例如，所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體可作為與目標淀粉樣蛋白低聚物的種類相對應的疾病的治療劑或預防劑或者治療或預防用醫藥組合物來應用。這樣的治療劑或預防劑含有所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體作為有效成分。此外，治療用或預防用醫藥組合物含有所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體以及作為醫藥能夠容許的載體。作為醫藥能夠容許的載體，可以舉出在該用途中通常使用的各種有機或者無機載體物質。在治療劑或預防劑、或者治療用或預防用醫藥組合物的情況下，所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體可以進一步作為與治療用或預防用的其它有效成分的結合體的形態來含有。
[0119]此外，本發明還包括與目標淀粉樣蛋白低聚物的種類相對應的疾病的治療或者預防方法。本疾病的治療或預防方法含有將有效量的所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體施用至對象。
[0120]對于作為這些的治療或預防對象的疾病，可以舉出與淀粉樣蛋白低聚物相關的疾病。作為這樣的疾病，可以舉出例如:帕金森氏病、感染性蛋白質病(瘋牛病)、多聚谷氨酰胺病、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茲海默型認知癥、路易氏體失智癥、帕金森氏病、多系統萎縮癥、克-雅氏病、牛海綿狀腦病或癢病等感染性蛋白質病、皮克病或進行性核上性麻痺等Tau蛋白病、亨廷頓舞蹈癥等多聚谷氨酰胺病、肌萎縮性側索硬化癥、II型糖尿病、全身性淀粉樣變性或透析性淀粉樣變性等淀粉樣變性等。
[0121]此外，作為給藥對象，只要為可產生淀粉樣蛋白低聚物的累積的生物即可，可以舉出:人、猴子等靈長類；以及牛、馬、羊等家畜動物。
[0122]此外，所述(I)?(3)的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體可以構成具有所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體與可通過高頻感應加熱而發熱的導電性顆粒的核酸適體-導電性顆粒結合體的一部分。
[0123]此處“高頻感應加熱”是指在高頻頻率、高頻電壓等加熱條件下設定為特定溫度進行加熱。
[0124]由于所述核酸適體-導電性顆粒結合體含有所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體部分，因而可藉由核酸適體部分與淀粉樣蛋白低聚物特異性結合；并且由于含有所述導電性顆粒，因而通過高頻感應加熱，導電性顆粒可發熱而產生熱。通過使用該核酸適體-導電性顆粒結合體，可以僅對照射了高頻交流磁場的區域進行局部加熱，通過調整所產生的熱，從而可破壞與核酸適體結合的目標物質。由此，可破壞目標淀粉樣蛋白低聚物、預防或消除淀粉樣蛋白低聚物的累積，可以減輕淀粉樣蛋白低聚物的累積所致的各種癥狀、或預防其發病。
[0125]作為導電性顆粒的原料，只要為通過高頻感應加熱而發熱的材料就沒有特別限定，可以舉出例如金屬、導電性聚合物。作為金屬，例如優選金、鋁、銅、銀等過渡金屬，特別優選金。
[0126]作為導電性顆粒使用金顆粒的情況下，可以使用金納米顆粒復合物。作為金納米顆粒復合物，可以使用例如NAN0G0LD(商標)(納米探針社(Nanoprobes, Inc.))等市售的金納米顆粒復合物。金納米顆粒具有可放大基于銀離子的光學信號、并且具有能夠構建對聚集所致的顏色變化進行觀察的檢測法的優點。因此，通過將金納米顆粒與核酸適體結合，能夠達成高靈敏度的蛋白質 檢測。
[0127]此外，也可不使用導電性顆粒而使用磁性顆粒。此處，磁性顆粒可以含有例如Fe2O3或Fe3O4等材料。
[0128]核酸適體-導電性顆粒結合體的制造方法可以直接應用為了使無機材料與核苷酸等結合而通常應用的手段，例如可以舉出使硫醇修飾核酸適體與含有馬來酰亞胺的金顆粒發生反應的方法等。
[0129]高頻感應加熱例如可利用下述裝置實現，在該裝置中，在特定的電氣控制電路中增大由信號發生器產生的輸出功率、增加用于供給至電磁場照射線圈的阻抗匹配電路。
[0130]所述核酸適體-導電性顆粒結合體例如可如下制作。
[0131]向金納米顆粒(直徑1.4nm) 30nmol中添加100 μ I異丙醇得到混合物,將該混合物利用Milli Q稀釋至1/10，使總量為ΙΟΟΟμ I (金納米顆粒溶液)。接下來，將所述淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體3nmol添加至金納米顆粒溶液中，在4°C培養24小時。接著，對于所得到的混合溶液，使用利用5mM的NaH2P04、150mM的NaCl、pH6.5進行了平衡化的凝膠過濾柱(Suplex 7516/60)來進行凝膠過濾色譜。接下來，將利用凝膠過濾色譜得到的級分脫鹽，進行冷凍干燥，從而制備出核酸適體.金顆粒復合物。
[0132]實施例
[0133]下面對本發明的實施例進行說明，但本發明并不限于此。需要說明的是，只要不特別聲明，“ ％”為質量基準。
[0134][實施例1]
[0135]〈 α -突觸核蛋白低聚物特異的核酸適體的制作>
[0136](I) α -突觸核蛋白試樣的制備
[0137](1-1)單體的制備
[0138]將具有加入了 α-突觸核蛋白基因的質粒的大腸桿菌BL21(DE3)/pET_28a(+)α -突觸核蛋白利用含有最終濃度為30μ g/ml的卡那霉素的LB培養基進行培養，通過添加IPTG誘導α-突觸核蛋白的表達。將所得到的濕菌體懸浮后進行破碎，進行離心分離(15，000g、4°C、20min)，回收上清。將所得到的上清在沸騰的熱水中加熱20分鐘。加熱后進行離心分離(15，000g、4°C、15min)，除去熱所致的變性?聚集的蛋白質。將所得到的上清利用20mM Tris-HCl (pH8.0)透析一夜。透析后進行微量超離心(150，000g、4°C、20min)，使用陰離子交換柱RESOURSE Q (GE Healthcare社)6ml利用FPLC對所得到的上清進行精制。緩沖液中使用 buffer A(20mM Tris_HCl、pH8.0)和 buffer B(20mM Tris_HCl、pH8.0、IM NaCl)這兩種。設定階梯梯度，結合說明書、柱容量設定流速、級分容量等，進行精制。
[0139]對于所得到的峰級分，利用Lowry法進行蛋白質濃度測定。其后進行SDS-PAGE確認精制度。精制度確認后，利用MiliQ或PBS(8.1mM Na2HPO4U.4mM KH2PO4,37mM NaCl,2.7mMKCl、pH7.3)進行透析。所得到的試樣為α-突觸核蛋白單體。
[0140](1-2)低聚物的制備
[0141]利用MiliQ對重組表達和精制后的α -突觸核蛋白進行透析，將透析后的α -突觸核蛋白以每4mg?6mg進行分注,進行冷凍干燥。其后使用MiliQ對冷凍干燥后的試樣進行復水使其濃度為30m g/ml，通過攪拌30?60分鐘左右使其充分溶解后，再次進行冷凍干燥。將該試樣使用PBS緩沖液進行復水使其濃度為30mg/ml，進行30?60分鐘左右的攪拌使其充分溶解。通過使用Superdex200 10/300colunm(GE Healthcare社)對所得到的試樣進行凝膠過濾色譜來進行精制。緩沖液使用PBS緩沖液，在流速0.5ml/min下進行分離。分離后回收認為含有低聚物的級分，使用超濾過濾器(MWCOlOOkDa)進行濃縮。濃縮后加入疊氮化鈉使其最終濃度為0.02%，在4°C保存。所得到的試樣為α -突觸核蛋白低聚物試樣。
[0142](1-3)纖維試樣的制備
[0143]將以lmg/ml?2mg/ml溶解在PBS緩沖液中的α -突觸核蛋白單體在37°C振蕩培養，促進纖維形成。以與淀粉樣纖維結合的突光色素Thioflavin T (硫磺素T,TfT) (Sigma社)的熒光為指標來制備α-突觸核蛋白的纖維試樣。一邊對TfT的熒光強度進行測定一邊進行培養，在TfT的熒光飽和時停止培養。對培養試樣進行離心(10，000g、20°C、IOmin)，回收上清。
[0144]向顆粒中加入400μ I的PBS緩沖液，進行良好的漩渦攪拌。其后再次在相同條件下進行離心，同樣地對顆粒進行清洗。該操作進行3次，將最終得到的顆粒懸浮在50 μ I的PBS緩沖液中。將其作為α-突觸核蛋白纖維試樣。對回收上清的蛋白質濃度進行測定來計算出纖維試樣的蛋白質濃度，算出α-突觸核蛋白纖維試樣的濃度。
[0145]需要說明的是，由于纖維試樣未精制，因而估計會少量混有α -突觸核蛋白低聚物。[0146](2) α -突觸核蛋白低聚物特異的核酸適體的制備
[0147](2-1)低聚核苷酸的合成
[0148]分別設計下述(a)?(e)所示的隨機文庫和引物(序列編號19?23)，合成各種低聚核苷酸。對于隨機文庫和正向引物，在5’末端附加FITC序列(下述堿基序列中表示為“FITC”。)；對于反向引物，在3’末端附加生物素序列(下述堿基序列中表示為“Biotin”。)，分別構建經FITC或生物素修飾的序列。此外，關于3’末端側引物區域的互補鏈，分別制作在5’末端具有FITC修飾序列的序列與未修飾的序列。
[0149](a)隨機文庫(序列編號19)
[0150]5’ -FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA TTT (N24) TTT AGA TAT CAG CAT GTGTCA-3’
[0151](b)5’末端側引物區域的互補鏈(序列編號20)
[0152]5’ -TGA AAT GAA TGG CAG TAT-3’
[0153](c) 3’末端側引物區域的互補鏈(序列編號21)
[0154]5’ -TGA CAC ATG CTG ATA TCT-3’ [0155](d)正向引物(序列編號22)
[0156]5’ -FITC-ATA CTG CCA TTC ATT TCA-3’
[0157](e)反向引物(序列編號23)
[0158]5’ -TGA CAC ATG CTG ATA TCT-Biotin-3’
[0159](2-2)使用凝膠阻滯分析的篩選(第1、2輪)
[0160]使用凝膠阻滯分析對所得到的低聚核苷酸進行篩選。篩選反復進行以下的(i)?(iv)的全部操作2次。
[0161](i)與α -突觸核蛋白低聚物結合的ssDNA的選擇與ssDNA文庫的結合確認
[0162]將5’末端FITC修飾的DNA文庫與引物區域的互補鏈DNA按每等摩爾量進行混合，在 TBS 緩沖液(IOmM Tris-HCl, 150mM NaCl, 5mM KCl、pH7.4)中使其折疊后，將 α -突觸核蛋白低聚物與DNA混合，利用高速振蕩機在攪拌下室溫培養I小時。折疊是通過在95°C加熱3分鐘后，利用30分鐘將溫度降至25 °C來進行的。
[0163]其后，使用3%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中對該混合溶液進行電泳。通過利用可變圖像分析儀Tyhoon8600 (GE Healthcare社、以下相同)進行FITC的突光檢測來確認低聚物與DNA的結合。其后對凝膠進行CBB染色，確認蛋白質的位置。
[0164](ii)與α -突觸核蛋白低聚物結合的ssDNA的提取
[0165]對于上述(i)中使用的進行了 α-突觸核蛋白低聚物與DNA的混合溶液的電泳的凝膠，利用醇進行清洗，使用燒熱的刀片和鑷子切取蛋白質部分的凝膠進行回收。
[0166]使用MERmaid kit (Q-biogene社)，由該凝膠對與α _突觸核蛋白低聚物結合的DNA進行提取。實驗操作按照常規方案進行。最終使DNA溶出到IXTE緩沖液(IOmMTris-HClUmM EDTA)中，作為下述文庫的模板。
[0167](iii)所提取的ssDNA的擴增
[0168]將提取的ssDNA作為模板進行PCR。制備30份含有FITC修飾5’引物(最終濃度
0.4 μ M)、生物素修飾3’引物(最終濃度0.4 μ Μ)、dNTP (最終濃度0.2mM)、5U/ μ I的TaqDNA聚合酶、5 μ I的模板DNA的PCR反應液100 μ I。
[0169]利用熱循環儀在95°C加熱3分鐘后，以95°C I分鐘、52°C I分鐘、72°C I分鐘為I循環，反復進行30循環。各PCR產物在TAE緩沖液中使用3%瓊脂糖21凝膠進行電泳，確認到作為模板的DNA發生擴增。
[0170](iv)擴增的dsDNA的單鏈化
[0171]將抗生物素蛋白固定化瓊脂糖120 μ I利用5倍量的上柱緩沖液(30mM HEPES,500mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)進行2次清洗。其中，在PCR產物中添加其1/10倍量的X50TE緩沖液和1/5倍量的5M NaCl，將該溶液添加至清洗后的抗生物素蛋白固定化瓊脂糖中，進行30分鐘培養。
[0172]培養后去除上清，利用5倍量的上柱緩沖液對瓊脂糖進行2次清洗后，加入瓊脂糖
1.5倍量的0.15M NaOH進行10分鐘攪拌，回收上清后，再次向瓊脂糖中加入同量的0.15MNaOH進行10分鐘攪拌，使ssDNA溶出，回收上清。將含有ssDNA的上清利用2M HCl中和，利用乙醇沉淀回收ssDNA。
[0173]將所得到的顆粒利用60 μ 1的TE緩沖液溶解，使用分光光度計測定260nm的吸收，從而計算出DNA濃度。需要說明的是，操作全部在室溫下進行。
[0174](2-3)使用核酸適體印跡的競爭性篩選(第3、4、5輪)
[0175]反復進行下述(V)-(viii)的操作，進行全部3輪的使用核酸適體印跡的競爭性篩選。
[0176](V)與α -突觸核蛋白低聚物結合的ssDNA的選擇
[0177]將制備為硝酸纖維素膜的各種量的α-突觸核蛋白單體、低聚物和纖維分別固定、干燥后，將膜與利用 TBS-T(25mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.005M KCl,
0.05%Tween20)制備的4%脫脂乳在室溫下培養I小時培養來進行封閉。
[0178]其后使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2min*2次、10min*1次)。與上述⑴同樣地進行5’末端FITC修飾的DNA文庫的折疊，將DNA與膜在室溫下培養I小時后，使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2min*2次、10min*1次、5minX2次)。
[0179](vi)與α -突觸核蛋白低聚物結合的ssDNA的提取
[0180]將進行了低聚物固定化的部分的硝酸纖維素膜剪下，添加200μ I的SM脲和600 μ 1的苯酚氯仿，攪拌3分鐘后，在室溫下靜置30分鐘。向其中加入MilliQ 100 μ 1，攪拌3分鐘,進行離心分離(12000rpm、10°C-20°C )，將得到的上清轉移到新的Eppendorf管中。進一步加入與上清同等量的氯仿，攪拌3分鐘后，進行離心分離(12000rpm、l(TC-200C )，將上清轉移到新的Eppendorf管中，將其中所含有的ssDNA分子通過乙醇沉淀進行回收，將回收后得到的顆粒利用30μ I的TE緩沖液(10mM TrisUmMEDTA)溶解。
[0181](vii)提取的ssDNA的擴增
[0182]與上述(iii)同樣地操作。
[0183](viii)擴增的dsDNA的單鏈化
[0184]與上述(iv)同樣地操作。
[0185](2-4)所得到的文庫的序列解析
[0186]將上述第4輪或第5輪篩選中提取出的DNA作為模板，使用未修飾的引物進行PCR0使用3%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中對所得到的PCR產物進行電泳，之后剪下目的大小的條帶，使用MERmaid kit進行凝膠精制。
[0187]精制后，將試樣用于TA克隆化，將其與pGEM-T連接。TA克隆化使用pGEM_T載體系統進行。加入精制后的SSDNA溶液3 μ 1、以及5 μ I快速連接緩沖液、I μ I的pGEM_T載體(50ng)、ly I的T4DNA連接酶，制備成總量為10 μ I后，在室溫下進行I小時連接。
[0188]使用連接樣品轉化大腸桿菌DH5CI，利用振蕩機進行I小時前培養后，涂覆在含有100 μ g/ml氨芐西林、0.1mM IPTG、40 μ g/ml X-gal的LB培養基的培養板上。將其在37°C進行主要培養，通過顏色選擇來選擇含有插入了目的DNA的質粒的菌落。
[0189]利用Iml的LB液體培養基(Amp 100 μ g/ml)對含有目的質粒的大腸桿菌DH5 α進行培養后進行集菌，利用堿-SDS法進行質粒提取。使用提取出的質粒進行序列分析。
[0190](2-5)基于核酸適體印跡的結合分析
[0191]將α-突觸核蛋白單體、低聚物、纖維Iyg固定在硝酸纖維素膜上，干燥后，將膜與利用 TBS-T (25mMTris-HClpH7.4,0.15M NaCl、0.005M KC1、0.05%Tween_20)制備的4%脫脂乳在室溫下培養I小時來進行封閉。其后使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2min×1\2次、1min×1\1次)。對于在5’末端進行FITC修飾而得到的2個以上的低聚核苷酸(f.c.1OOnM)進行折疊，將DNA與膜在室溫下培養I小時后，使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2min×1\2次、1min×1\1次、5minX2次)。其后將利用TBS-T進行1000倍稀釋后的HRP修飾抗FITC抗體與膜在室溫下培養I小時，之后使用充分量的TBS-T對膜進行清洗(2min×1\2次、10min×1\1 次、5minX2 次)。向膜中添加 ECL Plusffestern 印跡檢測系統(GEHealthcare社)，利用Typhoon 8600檢測HRP的化學發光,從而觀察DNA與蛋白質的結合。
[0192]該結果見圖1。
[0193]如圖1所示，確認得到了不與α-突觸核蛋白單體結合、而與低聚物強結合的下述8種α-突觸核蛋白低聚物結合核酸適體。
[0194]T-S0517:GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACG (序列編號 I)
[0195]T-S0606:GGGTCGGCTGTCCGTGGGTGGGGA (序列編號 2)
[0196]T-S0554:CGAGGGGCGTCTGGGAGTGGTCGG (序列編號 3)
[0197]T-S0530:GGTGCGGCGGGACTAGTGGGTGTG (序列編號 4)
[0198]T-S0552:GCGTGTGGGGCTTGGGCAGCTGGG (序列編號 5)
[0199]T-S0504: CAGGGGTGGGCAAAGGGCGGTGGTG (序列編號 6)
[0200]T-S0508:GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG (序列編號 7)
[0201 ] T-S0602:GCGGTAGGGTGTGAGCGGAAGGGG (序列編號 8)
[0202]另外，使用CD光譜對所得到的α -突觸核蛋白低聚物結合核酸適體具有G-四分體結構的情況進行確認。
[0203]S卩，利用 TBS 緩沖液(IOmM Tris-HClU50mM NaCl、5mM KCl、pH7.4)將核酸適體制備為20μΜ，進行折疊。其后使用圓二色性分散計J-720測定⑶光譜。測定在溫度20°C、波長200?320nm、掃描速度100nm/min、積分次數10次的條件下進行。
[0204]其結果，由于存在240nm附近的最小值和260nm附近的最大值,可知上述α -突觸核蛋白低聚物結合核酸適體具有G-四分體結構。
[0205](3) α -突觸核蛋白低聚物結合核酸適體的特異性的確認
[0206]在上述得到的8種核酸適體之中，對T-S0517和T-S0606與抗α -突觸核蛋白低聚物抗體All(Life technologies社)的結合性進行比較。
[0207]在同樣的硝酸纖維素膜上固定各為5pmol的以PQQ為輔酶的葡萄糖脫氫酶(PQQGDH)(國際試劑社)、C反應性蛋白質(CRP) (Polyscience社)、熒光素酶、IgG抗體(Sigma社)，以及0.5 μ g的α -突觸核蛋白低聚物,使用該膜,利用核酸適體印跡法進行特異性的評價。
[0208]此外，使用抗低聚物抗體All同樣地對特異性進行評價。操作按照常規方案進行。需要說明的是，熒光素酶使用的是利用采用大腸桿菌的重組生產而制備出的熒光素酶。
[0209]其結果見圖2。需要說明的是，PQQGDH、CRP、熒光素酶、IgG抗體和α -突觸核蛋白低聚物均為富含β結構的蛋白質。
[0210]如圖2所示，All抗體不僅對α -突觸核蛋白低聚物、而且對富含β結構的其它蛋白質也顯示出結合性；與此相對，對于實施例1中得到的T-S0517和T-S0606，確認到對其它蛋白質不顯示出結合性、而對α-突觸核蛋白低聚物具有高特異性。
[0211](4)相對于β淀粉樣肽的結合性
[0212]如下確認上述得到的8種核酸適體相對于β淀粉樣肽的結合性。
[0213](4-1) β淀粉樣肽A β H。的制備
[0214]作為β 淀粉樣肽，使用 A β H。(Peptide Institute, Inc 社)。
[0215]將利用六氟異丙醇(HFIP)稀釋至最終濃度為2.5mg/ml的100 μ L的A β .40溶液與900 μ L的MilliQ混合，在室溫下攪拌后進行離心(14，000g、室溫、15min)，回收上清。在上清中進行Ar氣體鼓泡后，使用高速振蕩機進行24小時攪拌(800rpm、室溫)。其后對試樣進行離心(14，000g、4°C、20min)，利用超濾過濾器(MWCOdOkDa)對回收的上清進行濃縮。將其作為A β !_40低聚物試樣。
[0216]需要說明的是，對于A β !_40單體試樣，直接使用上述制備的A β H0溶液。
[0217]如下制備Aβ _纖維試樣。首先，將Αβ L溶解在DMSO中，使最終濃度為4.33mg/ml，來制作貯存液。將其利用PBS稀釋至50 μ M，在37°C攪拌9天左右。其后在14，000G、4°C離心20分鐘，回收顆粒。在顆粒中加入500 μ L的PBS，進行攪拌.離心，反復進行2次該操作，對顆粒進行清洗。與上述同樣地對各操作中得到的上清在280nm的吸光度進行測定，計算出顆粒中殘留的蛋白質量。其后利用PBS將顆粒復水至所期望的濃度，作為纖維試樣用于實驗中。
[0218](4-2)核酸適體印跡分析
[0219]將12.5pmol的Αβ卜4(|單體.低聚物?纖維在相同的硝酸纖維素膜上進行固定化，使用500ηΜ的各核酸適體通過核酸適體印跡評價結合特異性。作為對照使用All，進行同樣的實驗。
[0220]將各為3μ L、2y L、ly L、0.5μ L的A β卜4(|低聚物試樣、以及各為300ng、200ng、100ng、50ng的a -Syn低聚物分別固定在硝酸纖維素膜上,使用All進行斑點印跡。
[0221]對固定有a-Syn低聚物的位置的斑點強度進行分析，通過制作校正曲線來估算出Αβ卜4(|低聚物試樣所含有的低聚物濃度。其后按照All的斑點強度為同等程度將A
低聚物固定在硝酸纖維素膜上，使用500ηΜ的各核酸適體進行核酸適體印跡。作為對照使用All，進行同樣的實驗。
[0222]結果見圖3。
[0223]如圖3所示，實施例1中得到的8種淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體均可識別A β !_40低聚物，但在A β L單體或纖維中未顯示出結合性。[0224]由此可知，本實施例的淀粉樣蛋白低聚物結合核酸適體可特異性識別α-突觸核蛋白低聚物、Aii1,低聚物。
[0225][實施例2]
[0226]< 二聚體型核酸適體的結合性1>
[0227]將實施例1中得到的核酸適體T-S0504的序列利用5mer的胸腺嘧啶脫氧核苷(t)核苷酸連接，合成核酸適體二聚體(504W)。
[0228]此外，作為比較對照，還同樣地合成從T-S0504的堿基序列中削除5 ’末端側的3堿基和3’末端側的8堿基而成的多核苷酸504M1 (GGGTGGGCAAAGGG:序列編號24)、從T-S0504的堿基序列削除5’末端側的7堿基和3’末端側的8堿基而成的多核苷酸504M2 (GGGCAAAGGG:序列編號 25)。
[0229]此外，對于各多核苷酸，為了緩和抗FITC抗體結合中的立體障礙以及防止鳥嘌呤所致的FITC的消光，分別在5’末端側附加5mer的腺嘌呤核苷(a)核苷酸(對于T-S0504附加胸腺嘧啶(t)核苷酸:tT-S0504)，進一步進行FITC修飾。需要說明的是，在504M1和504M2中，為了進一步防止多聚體形成，在3’末端側附加2mer的腺嘌呤核苷核苷酸。
[0230]所得到的各核酸適體的序列列于表I。表I中，小寫字母(t或a)意味著上述的附加序列。
[0231]【表I】
[0232]
【權利要求】
1.一種對淀粉樣蛋白低聚物具有結合性的核酸適體，該核酸適體具有G-四分體結構、且為選自由下述多核苷酸組成的組中的至少I種: (1)由序列編號I?序列編號18的任意之一所表示的堿基序列構成的多核苷酸； (2)由至少含有4組至少2個連續的鳥苷核苷酸、且是序列編號I?序列編號18的任意之一所表不的喊基序列中有I個或2個以上喊基發生缺失、取代或者添加而成的喊基序列所構成的多核苷酸；以及 (3)多核苷酸，其是含有所述(I)或(2)的多核苷酸作為結構單元的多聚體。
2.如權利要求1所述的核酸適體，其中，所述(3)的多核苷酸具有所述(I)或(2)的多核苷酸與將各(I)或(2)的多核苷酸間連接起來的接頭序列。
3.一種淀粉樣蛋白低聚物檢測試劑盒，其含有權利要求1或權利要求2所述的核酸適體。
4.一種淀粉樣蛋白低聚物的檢測方法，該方法包括以下步驟: 使權利要求1或權利要求2所述的核酸適體與待檢試樣接觸；以及 對所述待檢試樣中的淀粉樣蛋白低聚物和所述核酸適體的復合物進行檢測。
5.如權利要求4所述的淀粉樣蛋白低聚物檢測方法，其中，所述待檢試樣為選自由髓液、血清、血漿和它們的稀釋物組成的組中的至少I種。
6.—種多核苷酸,其由序列編號I?序列編號18的任意之一所表不的堿基序列構成。
7.—種多核苷酸,其是含有由序列編號I?序列編號18的任意之一所表不的堿基序列構成的多核苷酸作為結構單元的多聚體。
【文檔編號】G01N33/53GK103443277SQ201280008801
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年2月20日 優先權日:2011年2月18日
【發明者】池袋一典, 塚越香, 早出廣司 申請人:國立大學法人東京農工大學