一種定性定量檢測植物激素活性赤霉素的方法及其專用芯片的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種定性定量檢測植物激素活性赤霉素的方法及其專用芯片。本發明公開的一種輔助定性檢測待測樣品中是否含有活性赤霉素的方法，是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟：將待測樣品溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值A；將蛋白溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測對照響應值；若響應值A顯著大于對照響應值，則判定待測樣品候選為含有活性赤霉素的樣品。本發明從多肽水平出發，構建了一種可批量化生產的穩定高效的M37偶聯的SA芯片，利用表面等離子共振技術，可以實現對赤霉素的定性定量分析，從而為赤霉素的檢測提供一種高效、靈敏的新方法。
【專利說明】ー種定性定量檢測植物激素活性赤霉素的方法及其專用芯片
【技術領域】
[0001]本發明涉及ー種定性定量檢測植物激素活性赤霉素的方法及其專用芯片。
【背景技術】
[0002]赤霉素(Gibberellin，GA)是廣泛存在的ー類植物激素，種類非常復雜，目前已鑒定出136種。赤霉素按功能有活性和非活性之分，其中具有活性的GA數目較少，有GA1、GA3、GA4 等。
[0003]赤霉素的化學結構十分類似，多為差向異構，結構差異大的赤霉素也僅存在雙鍵、羥基數目或位置的不同，因此，赤霉素的分析檢測具有很大的挑戰性。國際上對赤霉素的分析研究早已開展，至少可以追溯到20世紀60年代甚至更早，但到目前為止，真正可用的赤霉素的分析檢測方法并不多。早期的赤霉素測定以免疫反應為基礎，通過制備半抗原，免疫動物來制備抗體，從而實現了免疫親和色譜提純，放射免疫測定以及后來發展起來的酶聯免疫吸附測定。免疫測定的優點是反應條件溫和，能保持生物活性，適合生物學效應研究，但缺點是需要制備半抗原和抗體，工作量大，測定周期長，成本高且難以自動化操作，而且測定效果和重現性也不甚理想。20世紀80年代后，質譜(MS)檢測成為赤霉素檢測的主力工具，通過與分離裝置，如氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，毛細管電泳(CE)等聯用進行分析，這些方法具有較高的自動化程度，能同時實現定性定量分析，但是在用MS進行檢測時，需要穩定同位素標記的赤霉素標準樣品作為內參，然而一些標準樣品在國內很難購買到，且價格昂貴。因此，赤霉素的檢測仍然非常困難。
[0004]表面等離子共振(Surface plasmon resonance, SPR)技術是近年來國際上迅速發展的光學生物檢測技術，它具有檢測過程方便快捷、樣品無需標記、實時檢測、應用范圍廣、檢測靈敏度高、高通量分析等優點，因此可以廣泛應用于生物分子相互作用的研究。
【發明內容】
[0005]本發明的ー個目的是提供一種輔助定性檢測待測樣品中是否含有活性赤霉素的方法，該方法是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟:
[0006]將待測樣品溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值A;將蛋白溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作對照響應值；若響應值A顯著大于對照響應值，則判定所述待測樣品候選為含有活性赤霉素的樣品。
[0007]所述待測樣品溶液由待測樣品、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0008]所述蛋白溶液由SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0009]所述生物傳感器芯片是在適于表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ IDN0.1所示多肽得到的。
[0010]本發明的另ー個目的是提供ー種輔助比較活性赤霉素活性大小的方法，該方法是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟:[0011]將蛋白溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作對照響應值；將赤霉素I的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值I ;將赤霉素II的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值II ;若響應值I和響應值II均顯著大于對照響應值、且響應值I顯著大于響應值II，則判定赤霉素I的活性候選高于赤霉素II。
[0012]所述蛋白溶液由SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0013]所述赤霉素I的溶液由赤霉素1、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0014]所述赤霉素II的溶液由赤霉素I1、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0015]所述生物傳感器芯片是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
[0016]本發明的另ー個目的是提供ー種定量檢測活性赤霉素的方法，該方法是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟:
[0017]分別將不同濃度的活性赤霉素標準品的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記錄各個不同濃度的溶液進樣完畢時對應的響應值，以各響應值為縱坐標，以各濃度的自然對數為橫坐標，制作標準曲線。
[0018]將待測赤霉素溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢時，檢測響應值，將該響應值代入標準曲線，即得出待測樣品溶液中赤霉素的濃度。
[0019]所述赤霉素標準品的溶液由赤霉素標準品、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0020]所述待測赤霉素溶液由待測赤霉素、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成。
[0021]所述不同濃度的活性赤霉素標準品的溶液中活性赤霉素標準品的濃度為100 μ Μ，10 μ Μ, 1 μ Μ,Ο.1 μ Μ,Ο μ Μ。
[0022]所述生物傳感器芯片是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
[0023]所述待測赤霉素與赤霉素標準品為同一種赤霉素。
[0024]上述任一所述方法中，所述緩沖液為含體積百分含量0.005%的TWeen20的ρΗ7.4的PBS緩沖液。
[0025]上述任一所述方法中，所述待測樣品的進樣量為50μ L，進樣流速為30μ L/min。
[0026]上述任一所述方法中，所述的SEQ ID N0.1所示多肽通過生物素和芯片上的鏈霉親和素與芯片連接。
[0027]上述任一所述方法中，所述活性赤霉素為GA3或GA4。
[0028]本發明的另ー個目的是提供ー種利用表面等離子共振技術檢測活性赤霉素中使用的生物傳感器芯片，該芯片是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
[0029]上述生物傳感器芯片中，所述的SEQ ID N0.1所示多肽通過生物素和芯片上的鏈霉親和素與芯片連接。
[0030]本發明的另ー個目的是提供一種多肽，為如下(1)或(2)所示:
[0031](1) SEQ ID N0.1 所示的多肽；
[0032](2)將SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。[0033]上述多肽在輔助定性和/或定量檢測樣品中活性赤霉素中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0034]本發明從多肽水平出發，通過合成包含DELLA結構域的多肽M37，基于受體蛋白GIDla與DELLA蛋白相互作用依賴于活性GA濃度的機理，構建了一種可批量化生產的穩定高效的M37偶聯的SA芯片，利用表面等離子共振技術，可以實現對赤霉素的定性定量分析，從而為赤霉素的檢測提供一種高效、靈敏的新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1為GIDla-GST蛋白的鑒定。
[0036]圖2為M37多肽芯片的特異性分析。
[0037]圖3為M32多肽芯片的特異性分析。
[0038]圖4為M37多肽芯片的赤霉素活性分析。
[0039]圖5為M32多肽芯片的赤霉素活性分析。
[0040]圖6為活性赤霉素濃度分析。
[0041]圖7為活性赤霉素含量標準曲線。
【具體實施方式】
[0042]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044]下述實施例中使用的實驗材料及其來源如下:
[0045]活性赤霉素GA3購自Sigma公司，貨號為G7645。
[0046]活性赤霉素GA4購自Sigma公司，貨號為G7276。
[0047]IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)購自Merck，產品目錄號為CB420322。GSTrapFF親和柱購自GE公司。
[0048]Superdex20010/300GL 純化柱購自 GE 公司。
[0049]GST單克隆抗體購自Novagen公司，產品目錄號為71097。
[0050]非活性赤霉素GA2(i，由中國科學院化學研究所陳義實驗室提供。
[0051]重組菌株Rosetta? (DE3)pLysS/pGEX-KG_GIDla 在文獻“周敏，趙卓亞，徐文忠，肖浪濤，王若仲.擬南芥赤霉素受體AtGIDla原核表達條件的優化研究。2011.20(1)，103-107”中公開過，公眾可從中國科學院植物研究所麻密實驗室獲得。
[0052]表面等離子共振技術中的SA芯片購自GE公司，產品目錄號為BR-1000-32。
[0053]PBS 緩沖液(pH7.4):137mM NaCl，2.7mM KC1, lOmM Na2HP04, 2mM KH2P04。
[0054]實施例1、多肽偶聯的SA芯片的制備
[0055]一、多肽M37和M32的序列及制備
[0056](1)人工合成多肽M37，并對其N-末端進行生物素標記。
[0057]合成的M37 的序列為:NEEDDGNGMDELLAVLGYKVRSSEMADVAQKLEQLEV(SEQ ID N0.1)；
[0058]N-末端生物素標記的M37序列為:
[0059]Biotin-NEEDDGNGMDELLAVLGYKVRSSEMADVAQKLEQLEV ；
[0060](2)人工合成多肽M32，并對其N-末端進行生物素標記。[0061]合成的M32 的序列為:NEEDDGNGMVLGYKVRSSEMADVAQKLEQLEV (SEQ ID N0.2)；
[0062]N-末端生物素標記的M32序列為:
[0063]Β i ο t i n-NEEDDGNGMVLGYKVRSSEMADVAQKLEQLEV?
[0064]ニ、多肽連接到SA芯片上
[0065]SA芯片是表面等離子共振生物傳感器中使用的芯片。在生物大分子相互作用分析儀Biacore3000上進行如下操作:用50mM NaOH (含1M NaCl)以10 μ L/min的流速沖洗SA芯片三次，每次lmin ;用pH7.4的PBS緩沖液分別稀釋多肽M37和M32至50 μ g/mL,將多肽溶液分別以10 μ L/min的流速流經SA芯片，使多肽與芯片表面的鏈霉親和素結合，直至達到預定的偶聯水平，約為1000RU，得到M37偶聯的SA芯片和M32偶聯的SA芯片。
[0066]實施例2、受體蛋白GIDla的純化與鑒定
[0067]一、重組菌株Rosetta?(DE3)pLysS/pGEX-KG-GIDla接種在LB培養基中培養，經過二次培養在0D值為0.6-0. 8時，加入IPTG至終濃度為0.1mM誘導，在16°C，200rpm下培養12h, 5000g離心，收集菌體。
[0068]ニ、用PBS緩沖液(pH7.4)重懸菌體后低溫超聲破碎。
[0069]三、在4°C條件下，10000g離心40min，取上清。
[0070]四、將上清用0.45 μ m濾膜過濾。
[0071]五、蛋白純化。pGEX-KG-GIDla質粒表達的GIDla蛋白帶GST標簽，因此純化時優先選擇親和色譜純化。
[0072](一)將上清用GSTrapFF親和柱進行初次純化。
[0073](ニ)用Superdex20010/300GL純化柱在AKTApurifier上對經親和純化后的GIDla-GST蛋白進行二次純化。
[0074]六、收集純化樣品進行12%SDS_PAGE電泳檢測。
[0075]電泳結果如圖1A所示。
[0076]圖1A中的GIDla為帶有GST標簽的GIDla。
[0077]GIDla的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0078]GIDla-GST的分子量理論值為66.6kD，純化后的樣品條帶大小與目的蛋白GIDla-GST的大小一致。
[0079]七、純化樣品的Western blot檢測
[0080]根據GIDla蛋白與GST構成融合蛋白的特點，利用GST的單克隆抗體對純化后的蛋白樣品進行Western blot檢測。
[0081]將純化的蛋白樣品經SDS-PAGE分離后濕轉至PVDF膜上，并進行免疫雜交，GST的單克隆抗體的稀釋比為1:4000。
[0082]雜交結果如圖1B所示。
[0083]圖1B中的GIDla為帶有GST標簽的GIDla。
[0084]圖1B表明蛋白樣品與GST的單克隆抗體有雜交信號，且雜交條帶的大小與目的蛋白GIDla-GST的大小一致，證明純化后的蛋白樣品即為GIDla-GST蛋白。
[0085]實施例3、樣品的表面等離子共振(SPR)分析
[0086]一、通入PBS緩沖液(含體積百分含量為0.005%的Tween20)，沖洗芯片表面。
[0087]ニ、當RU值平穩時，用PBS緩沖液(含體積百分含量為0.005%的Tween20)配制待測樣品，樣品以30μ L/min的流速進行檢測，進樣量為50μし
[0088]三、分析比較進樣結束時(95s)的響應值情況。
[0089]四、通入PBS緩沖液(含體積百分含量為0.005%的Tween20) 2min,使分析物從芯
片表面解離。
[0090]五、通入5 μ LlOmM的NaOH再生芯片。
[0091]實施例4、多肽偶聯的SA芯片的特異性分析
[0092]一、設置四個負對照樣品。BSA 蛋白溶液(7.5yM)，GA4 (lOOyM^PBSA (7.5 μ Μ)的混合溶液，以及為了排除GIDla-GST融合蛋白中GST標簽的干擾設置的GST蛋白溶液(7.5μΜ), GA4 (100 μ Μ)和 GST (7.5 μ M)的混合溶液。
[0093]二、對Μ37偶聯的SA芯片和Μ32偶聯的SA芯片分別進行SPR分析。具體步驟同實施例3。
[0094]M37偶聯的SA芯片的SPR分析結果如圖2所示。
[0095]圖2中:Aa:分析物為GA4 (100 μ Μ)和BSA (7.5 μ Μ)的混合溶液；Ab:分析物為BSA蛋白溶液(7.5 μ M)；Ba:分析物為GA4 (100 μ Μ)和GST (7.5 μ Μ)的混合溶液；Bb:分析物為GST蛋白溶液(7.5 μ Μ)。
[0096]圖2結果顯示，四種蛋白樣品進樣前后，響應值均沒有發生變化，即蛋白樣品與芯片表面的多肽Μ37沒有發生相互作用。結果表明芯片的特異性良好，可以用于與受體蛋白GIDla的相互作用分析。
[0097]M32偶聯的SA芯片的SPR分析結果如圖3所示。
[0098]圖3中:Aa:分析物為GA4 (100 μ Μ)和BSA (7.5 μ Μ)的混合溶液；Ab:分析物為BSA蛋白溶液(7.5 μ M)；Ba:分析物為GA4 (100 μ Μ)和GST (7.5 μ Μ)的混合溶液；Bb:分析物為GST蛋白溶液(7.5 μ Μ)。
[0099]圖3結果顯示，四種蛋白樣品進樣前后，響應值均沒有發生變化，即蛋白樣品與芯片表面的多肽Μ32沒有發生相互作用。結果表明芯片的特異性良好，可以用于與受體蛋白GIDla的相互作用分析。
[0100]實施例5、多肽偶聯的SA芯片對赤霉素的定性檢測
[0101]一、M37偶聯的SA芯片對赤霉素的定性檢測
[0102](一)相同濃度的受體蛋白GIDla中加入相同濃度的不同GA樣品，分別為活性最高的GA4，活性次之的GA3，沒有活性的GA2(I，此外，設置ー個不加GA的對照。
[0103]四個檢測樣品為:
[0104]GA4 (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA3 (1 μ M)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GA2Q (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GIDla 溶液(7.5 μ Μ)。
[0105](二)對Μ37偶聯的SA芯片進行SPR分析。具體步驟同實施例3。
[0106]Μ37偶聯的SA芯片的SPR分析結果如圖4所示。
[0107]圖4中:a_d對應的分析物依次為:GA4 (1 μ Μ)和GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA3 (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA20 (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GIDla (7.5 μ Μ)溶液。
`[0108]圖4結果顯示，受體蛋白GIDla中加入沒有活性的GA2。后，與多肽M37相互作用的響應值與不加GA時的GIDla響應值ー樣大(56RU);受體蛋白GIDla中加入GA3和GA4后，與多肽M37相互作用的響應值顯著大于不加GA和加入GA2(i的GIDla樣品的響應值，且加入GA4時的響應值(97RU)要顯著大于加入GA3時的響應值(69RU)。
[0109]實驗重復三次，結果均與上述結論一致。因此，可以通過比較檢測樣品響應值是否顯著大于GIDla溶液的響應值，判斷所檢測的樣品是否為含有活性赤霉素的候選樣品，并且在檢測樣品響應值顯著大于GIDla溶液的響應值的情況下，可進ー步判斷樣品所含活性赤霉素的活性大小。
[0110]ニ、M32偶聯的SA芯片對赤霉素的定性檢測
[0111](一)兩個檢測樣品為:
[0112]GA4 (100 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液和 GIDla 溶液(7.5 μ Μ)。
[0113](ニ)對Μ32偶聯的SA芯片進行SPR分析。具體步驟同實施例3。
[0114]Μ32偶聯的SA芯片的SPR分析結果如圖5所示。
[0115]圖5 中:a:GA4 (100 μ Μ)和 GIDla (7.5μΜ)的混合溶液，b:GIDla (7.5μΜ)溶液。
[0116]圖5顯示，通入GIDla (7.5 μ Μ)溶液，響應值沒有改變，即GIDla沒有與芯片表面的M32發生相互作用。通入含100 μ M GA4的受體蛋白GIDla (7.5 μ Μ)樣品，同樣沒有與芯片表面的Μ32發生相互作用。
[0117]圖4和圖5對比可以發現，GIDla與Μ37在不加活性GA4和加入6ム4時均有明顯的響應值増大，說明M37偶聯的SA芯片可以用于赤霉素的檢測。而GIDla與M32在不加活性GA4和加入GA4時響應值與進樣前的響應值相比均沒有明顯變化，表明M32不能與受體蛋白GIDla識別，說明M32偶聯的SA芯片不能用于赤霉素的檢測。
[0118]實施例6、M37偶聯的SA芯片對赤霉素的定量檢測
[0119]一、相同濃度的受體蛋白GIDla中加入不同濃度的GA4樣品，活性GA4樣品的濃度分別為:100μΜ，10μΜ，1μΜ，0.1 μ Μ,Ο μ Mo
[0120]五個檢測樣品為:
[0121]GA4 (100 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (10 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (0.1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GIDla溶液(7.5 μ Μ)。
[0122]ニ、對Μ37偶聯的SA芯片進行SPR分析。具體步驟同實施例3。
[0123]結果如圖6所示。
[0124]圖6中:a-e對應的分析物依次為:GA4 (100 μ Μ)和GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (10 μ M)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GA4 (1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GA4 (0.ΙμΜ)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GIDla 溶液(7.5 μ Μ)。
[0125]結果顯示，隨著6ム4濃度的降低，GIDla與芯片表面Μ37多肽相互作用的響應值呈減小趨勢(依次為:159冊，142冊，109冊，82冊)，且響應值均大于沒有加6ム4時的響應值(80RU)。
[0126]三、活性赤霉素含量標準曲線的制作
[0127](一)五個檢測樣品為:
[0128]GA4 (100 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (10 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ Μ)的混合溶液，GA4 (ΙμΜ)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GA4 (0.1 μ Μ)和 GIDla (7.5 μ M)的混合溶液，GIDla溶液(7.5 μ Μ)。
[0129](ニ)進行SPR分析。具體步驟同實施例3。
[0130](三)將含0.1 μ M GA4的樣品與M37作用時的響應值設為0RU，其他樣品的響應值相應折算(分別為77RU，60RU, 27RU)。以GA4濃度的自然対數值為橫坐標，折算后的響應值為縱坐標作圖。結果如圖7所示，方程為:y=ll.461η(x)+186.2，R2=0.986。
[0131]實驗重復三次，結果均與上述結論一致。因此，確定在0.ΙμΜ-ΙΟΟμΜ范圍內，可以通過響應值的大小分析活性赤霉素ga4的相對含量，響應值越大，含量越高，響應值越小，含量越低。
【權利要求】
1.一種輔助定性檢測待測樣品中是否含有活性赤霉素的方法，是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟: 將待測樣品溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值A ;將蛋白溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作對照響應值；若響應值A顯著大于對照響應值，則判定所述待測樣品候選為含有活性赤霉素的樣品； 所述待測樣品溶液由待測樣品、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述蛋白溶液由SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述生物傳感器芯片是在適于表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
2.ー種輔助比較活性赤霉素活性大小的方法，是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟: 將蛋白溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作對照響應值；將赤霉素I的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值I ;將赤霉素II的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記作響應值II ;若響應值I和響應值II均顯著大于對照響應值、且響應值I顯著大于響應值II，則判定赤霉素I的活性候選高于赤霉素II ； 所述蛋白溶液由SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述赤霉素I的溶液由赤霉素1、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述赤霉素II的溶液由赤霉素I`1、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述生物傳感器芯片是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
3.ー種定量檢測活性赤霉素的方法，是利用表面等離子共振技術進行檢測的，包括如下步驟: 分別將不同濃度的活性赤霉素標準品的溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢后，檢測響應值，記錄各個不同濃度的溶液進樣完畢時對應的響應值，以各響應值為縱坐標，以各濃度的自然對數為橫坐標，制作標準曲線； 將待測赤霉素溶液流經生物傳感器芯片，進樣完畢時，檢測響應值，將該響應值代入標準曲線，即得出待測樣品溶液中赤霉素的濃度； 所述赤霉素標準品的溶液由赤霉素標準品、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述待測赤霉素溶液由待測赤霉素、SEQ ID N0.3所示蛋白和緩沖液組成； 所述不同濃度的活性赤霉素標準品的溶液中活性赤霉素標準品的濃度為100 μ M，10 μ Μ, 1 μ Μ,Ο.1 μ Μ,Ο μ Μ ； 所述生物傳感器芯片是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述緩沖液為含體積百分含量0.005% 的 Tween20 的 ρΗ7.4 的 PBS 緩沖液。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:進樣量為50μ L，進樣流速為30 μ L/min。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:SEQID N0.1所示多肽通過生物素和芯片上的鏈霉親和素與芯片連接。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述活性赤霉素為GA3或GA4。
8.ー種利用表面等離子共振技術檢測活性赤霉素中使用的生物傳感器芯片，是在表面等離子共振技術中使用的芯片上連接SEQ ID N0.1所示多肽得到的； 所述SEQ ID N0.1所示多肽通過生物素和芯片上的鏈霉親和素與芯片連接。
9.一種多肽，為如下(1)或(2)所示: (1)SEQ ID N0.1所示的多肽； (2)將SEQID N0.1所示的氨基酸序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。
10.權利要求 9所述的多肽在輔助定性和/或定量檢測樣品中活性赤霉素中的應用。
【文檔編號】G01N21/41GK103454245SQ201310381641
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】徐文忠, 麻密, 趙卓亞 申請人:中國科學院植物研究所