一種s-腺苷甲硫氨酸分子印跡傳感器的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，其特征是：首先將玻碳電極用納米金和碳納米管修飾，溶膠-凝膠印跡技術、層層自組裝法和電聚合法相結合，在納米金和碳納米管修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的印跡電化學傳感器，本發明制備的SAM分子印跡傳感器的響應大大提高。該印跡傳感器對SAM表現出較高的親和性和選擇性。該SAM分子印跡傳感器與電化學工作站連接構成能夠專一模板分子識別傳感器。本發明制得的傳感器成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速，可反復使用。
【專利說明】一種S-腺苷甲硫氨酸分子印跡傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測應用【技術領域】，特別涉及一種S-腺苷甲硫氨酸分子印跡傳感器的制備方法，具體是基于分子印跡特異性識別作用，用于檢測藥品、生物樣品中的S-腺苷甲硫氨酸技術。
【背景技術】
[0002]細胞內的甲基化反應存在通用甲基供體一S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine, AdoMet, SAM), SAM含有活性甲基,細胞內幾乎所有用于甲基化修飾的甲基都來自SAM甲硫高能鍵。由于甲基化反應的廣泛性，可以說，SAM是細胞內參加反應的重要性僅次于ATP的一種輔酶，細胞內SAM濃度的微小改變，便會對細胞的生長、分化和功能產生重大影響。SAM在細菌體內主要是由SAM合成酶(MetK)通過甲硫氨酸(Met)和ATP來合成。當疋coli的SAM合成酶水平下降，造成細胞內甲基供體SAM缺乏時，細胞就不會正常分裂。如果將來自T3噬菌體的AdoMet水解酶基因導入疋coli菌體細胞，使胞內SAM水平下降時，大腸埃希氏菌也形成了不分裂的長絲狀菌體。進一步研究表明，絲狀菌體中，引發疋細胞分裂的Z環復合體裝配可以正常起始，但不會完成，而當亮氨酸調節的SAM合成酶水平恢復正常，細胞內甲基供體SAM不再缺乏時，細胞分裂也隨即恢復正常。很明顯，細菌細胞的生長分裂與胞內SAM濃度是密切相關的。
[0003]通用甲基供體SAM受甲基轉移酶催化去甲基后，生成的通用產物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein, SAH), SAH被發現對胞內蛋白質和核酸的甲基化過程具有普遍的反饋抑制作用，是轉甲基化反應的有效競爭性抑制劑。在哺乳動物細胞內，SAH通過SAH水解酶(SAH hydrolase, SAHH)催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸(Parveen，N.;Cornell, K.A..MethyIthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, acritical enzyme for bacterial metabolism.Mol Microbiol, 20117,9(I):7-20,),而在大多數病原微生物的細胞內，SAH的代謝則采用完全不同的方式——通過S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocystein nucleosidase, SAHN)催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH進一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和 4，5 二輕-2, 3-乙酰基丙酮(4，5-dihydroxy-2, 3-pentanedione, DPD),高半胱氨酸最后通過幾種甲硫氨酸合成酶(MetH、MetE)重新生成SAM的前體——甲硫氨酸，或者經過多步酶催化生成半胱氨酸。
[0004]目前，已報道的測定SAM的方法有HPLC、分光光度法。都依賴甲基轉移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用將SAM分解為高半胱氨酸，再對高半胱氨酸顯色反應，操作比較繁瑣，準確度也不理想。由于樣品的基質比較復雜，給檢測帶來了困難，因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡便、快速的檢測SAM的方法十分重要的意義。
[0005]分子印跡技術是當前開發具有分子識別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過在模板分子周圍形成一個高度交聯的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網絡結構中留下具有結合能力的識別位點，對模板分子表現出高選擇識別性能的一種技術。這項技術以其構效預定性和特異識別性越來越受到人們的關注，已經成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細管電泳及傳感器等領域。
[0006]依據此技術制備的分子印跡傳感器，應用于藥物分析、環境保護及生命科學研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學傳感器成為分析科學工作者努力探索的課題。但是傳統的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯度使得電子傳遞速度和響應慢、檢測下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術在電化學傳感器中的應用。因此，建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高、重復性好經濟使用的檢測方法，對研究人員、生產企業、質控人員、進出口商檢、政府管理部門等的迫切需要的，對食品、藥品、環境安全中的SAM含量準確定量測定十分必要，對于SAM生產和藥理研究也具有重要的意義。
[0007]
【發明內容】
[0008]本發明的目的是將分子印跡與電化學傳感器相結合，提供了一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，主要是以SAM為模板，在玻碳電極表面通過Y -巰丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、碳納米管及金納米粒子之間的電化學作用而制備的分子印跡傳感 器。
[0009]儀器與試劑
CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)，實驗采用三電極體系:鉬絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極(SCE )，玻碳電極(GCE )為工作電極；KQ_250E型超聲波清洗器(坤峰超聲儀器有限公司)。
[0010]碳納米管(孔徑2~50nm); Y-巰丙基三乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷；2_乙氧基乙醚，N, N- 二甲基甲酰胺(DMF);氯金酸；SAM ;高錳酸鉀、硫酸、硝酸鈉、磷酸緩沖溶液，所用試劑均為分析純。
[0011]本發明的目的通過如下技術方案實現。
[0012]一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，特征在于該方法具有以下工藝步驟:
(1)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加5~10 μ L碳納米管的N，N-二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡2(T30h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極；
(2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，按如下組成質量百分濃度加入39飛2%濃硫酸，
0.5~3.0%碳納米管，1.0-8.0%高錳酸鉀，超聲分散6(T90min，緩慢加入30~55%去離子水，各組分含量之和為百分之百，然后在8(T90°C攪拌反應6~8 h，冷卻至室溫，過濾，用I mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管；
(3)印跡溶膠的制備:在反應器中，按如下組成質量百分濃度加入，Y-巰丙基三乙氧基硅烷:7~18%，甲基三甲氧基硅烷:1.0~4.0%，2_乙氧基乙醚:55~78%，0.1 mol/LHCl:8~18%，去離子水:1.0-8.0%，攪拌廣2 h，再加入SAM:0.05^1.0%，各組分含量之和為百分之百，繼續攪拌2(T30min，即得印跡溶膠；
(4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(1)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.2(T0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描20-30圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
[0013]本發明的優點及效果是:
本發明將溶膠-凝膠印跡技術、納米金粒子、層層自組裝法和電聚合法相結合，在碳納米管修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的印跡電化學傳感器。通過與無碳納米管修飾的分子印跡電極那個的響應進行比較，本發明制備的SAM分子印跡傳感器的響應大大提高。該印跡傳感器對SAM表現出較高的親和性和選擇性，響應電流與SAM的濃度在3.0X 10_7~2.0X 10_4mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為3.69 X10^8moI/L將本發明制備的SAM分子印跡傳感器成功用于藥品、食品中SAM的檢測中，回收率在96.12~104.8%之間，因此本發明制備的分子印跡傳感器可廣泛應用于化工、生物醫藥、食品、環保檢測等相關領域。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
(1)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加7 μ L碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡24h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極；
(2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，分別加入IOmL濃硫酸，0.5g碳納米管，2.0g高錳酸鉀，超聲分散80min，緩慢加入19mL去離子水，然后在85°C攪拌反應7 h，冷卻至室溫，過濾，用I mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管；
(3)印跡溶膠的制備:在反應器中，分別加入，12mLy-巰丙基三乙氧基硅烷，1.2mL甲基三甲氧基硅烷，70mL2_乙氧基乙醚，IOmL0.1 mol/LHCl, 6.5mL去離子水,攪拌1.5 h,再加入0.3g SAM,繼續攪拌25min，即得印跡溶膠；
(4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(1)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.2(T0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描25圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
[0015]實施例2
(I)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加5 μ L碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡30h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極； (2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，分別加入20mL濃硫酸，1.5g碳納米管，2.0g高錳酸鉀，超聲分散60min，緩慢加入20mL去離子水，然后在80°C攪拌反應8h，冷卻至室溫，過濾，用I mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管；
(3)印跡溶膠的制備:在反應器中，分別加入，5mL Y-巰丙基三乙氧基硅烷，0.5mL甲基三甲氧基娃燒，50mL2_乙氧基乙醚,5.0mL0.1 mol/LHCl, 2.0mL去離子水,攪拌I h,再加入0.1g SAM,繼續攪拌30min，即得印跡溶膠；
(4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(I)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.2(T0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描20圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
[0016]實施例3
(1)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加10 μ L碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡20h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極；
(2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，分別加入15mL濃硫酸，0.5g碳納米管，3.0g高錳酸鉀，超聲分散90min，緩慢加入22mL去離子水，然后在90°C攪拌反應6h，冷卻至室溫，過濾，用I mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管；
(3)印跡溶膠的制備:在反應器中，分別加入，10mL Y-巰丙基三乙氧基硅烷，1.0mL甲基三甲氧基娃燒，35mL2-乙氧基乙醚,7.0mL0.1 mol/LHCl, 2.0mL去離子水，攪拌2h,再加入0.2g SAM,繼續攪拌20min，即得印跡溶膠；
(4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(I)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.2(T0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描30圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
[0017]實施例4
(1)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加8 μ L碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液(0.5g/L)，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡28h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極；
(2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，分別加入IOmL濃硫酸，1.0g碳納米管，4.0g高錳酸鉀，超聲分散70min，緩慢加入24mL去離子水，然后在85°C攪拌反應7h，冷卻至室溫，過濾，用I mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管；
(3)印跡溶膠的制備:在反應器中，分別加入，10mLy-巰丙基三乙氧基硅烷，1.2mL甲基三甲氧基娃燒，35mL2_乙氧基乙醚,8.0mL0.1 mol/LHCl, 2.0mL去離子水，攪拌2h,再加入0.1g SAM，繼續攪拌20min，即得印跡溶膠；
(4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(I)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.2(T0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描25圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
[0018]實施例5
將上述實施例1~4所制備的SAM分子印跡傳感器，用于SAM的檢測，步驟如下:
(1)標準溶液配制:配制一組包括空白標樣在內的不同濃度的SAM標準溶液，底液為pH
6.5的磷酸鹽緩沖溶液；
(2)工作曲線繪制:將Ag/AgCl為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，本發明制備的電極為工作電極組成三電極系統，連接CHI660B電化學工作站，在KJFe(CN)6]溶液中，采用循環伏安法在-0.2(T0.4V電位范圍內進行檢測，空白標樣的響應電流記為10，含有不同濃度的SAM標準溶液的響應電流即為Ji，響應電流降低的差值為Zl I=10-1i,^ I與SAM標準溶液的質量濃度c之間呈線性關系，繪制Zl I~c工作曲線；
(3)SAM的檢測:用待測樣品代替步驟(1)中的SAM標準溶液，按照步驟(2)的方法進行檢測，根據響應電流降低的差值Zl J和工作曲線，得到待測樣品中SAM的含量；
所述K3[Fe (CN)6]溶液的濃度為5mmol/L ； 所述pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在70mmol/L。
[0019]響應電流與SAM的濃度在3.0Χ10-~2.0Xl(T4mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為3.69X 10_8mol/L將本發明制備的SAM分子印跡傳感器成功用于藥品、食品中SAM的檢測中，回收率在96.12^104.8%之間，因此本發明制備的分子印跡傳感器可廣泛應用于化工、生物醫藥、食品、環保檢測等相關領域。
【權利要求】
1.一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，其特征是:在于該方法具有以下工藝步驟: (1)納米金和碳納米管修飾玻碳電極制備:將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ mAl203粉末進行表面拋光，然后用高純水超聲清洗，用氬氣吹干，在玻碳電極表面滴加5~10 μ L碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發干溶劑后，放入0.lmol/L氯金酸溶液浸泡20-30h，取出后用去離子水洗滌，自然干燥，即得納米金和碳納米管修飾玻碳電極； (2)氧化碳納米管的制備:在反應器中，按如下組成質量百分濃度加入39-62%濃硫酸，0.5~3.0%碳納米管，1.0-8.0%高錳酸鉀，超聲分散60-90min，緩慢加入30~55%去離子水，各組分含量之和為百分之百，然后在80-90°C攪拌反應6~8 h，冷卻至室溫，過濾，用1 mol/LHCl洗滌，再用去離子水反復洗滌至濾液為中性，干燥，得到氧化碳納米管； (3)印跡溶膠的制備:在反應器中，按如下組成質量百分濃度加入，Y-巰丙基三乙氧基硅烷:7~18%，甲基三甲氧基硅烷:1.0~4.0%，2_乙氧基乙醚:55~78%，0.1 mol/LHCl:8~18%，去離子水:1.0-8.0%，攪拌1-2 h，再加入SAM:0.05^1.0%，各組分含量之和為百分之百，繼續攪拌20-30min，即得印跡溶膠； (4)SAM分子印跡傳感器的制備方法:取步驟(3)的印跡溶膠于小燒杯中，將步驟(1)制備的碳納米管修飾玻碳電極放入其中，在-0.20-0.4V電位范圍內，掃描速率為50mV/s，采用循環伏安法掃描20-30圈至掃描曲線穩定，再將該電極用去離子水反復浸泡，洗脫模板分子，即得檢測SAM的分子印跡傳感器。
2.根據權利要求1所述的一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，其特征是:步驟(1)中所述的碳納米管的N，N- 二甲基甲酰胺分散液的質量體積濃度為0.5g/L。
3.根據權利要求1中所述的一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，其特征是:步驟(3)中所述的Y-巰丙基三乙氧基硅烷與甲基三甲氧基硅烷體積比為10:1。
4.根據權利要求1中所述的一種SAM分子印跡傳感器的制備方法，其特征是:所制備的檢測SAM的分子印跡傳感器應用于SAM的檢測，其檢測步驟如下: (1)標準溶液配制:配制一組包括空白標樣在內的不同濃度的SAM標準溶液，底液為pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液； (2)工作曲線繪制:將Ag/AgCl為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，本發明制備的電極為工作電極組成三電極系統，連接CHI660B電化學工作站，在KJFe(CN)6]溶液中，采用循環伏安法在-0.20-0.4V電位范圍內進行檢測，空白標樣的響應電流記為10，含有不同濃度的SAM標準溶液的響應電流即為Ji，響應電流降低的差值為Zl I=10-1i,^ I與SAM標準溶液的質量濃度c之間呈線性關系，繪制Zl I~c工作曲線； (3)SAM的檢測:用待測樣品代替步驟(1)中的SAM標準溶液，按照步驟(2)的方法進行檢測，根據響應電流降低的差值Zl J和工作曲線，得到待測樣品中SAM的含量； 所述K3[Fe (CN)6]溶液的濃度為5mmol/L ； 所述pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在70mmol/L。
【文檔編號】G01N27/48GK103954675SQ201410186337
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】李慧芝, 許崇娟, 宋桂蘭 申請人:濟南大學