一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法【專利摘要】本發明公開了一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法包括以下步驟：唾液標本的收集和處理；采用WCX磁珠處理唾液樣品；點樣及質譜分析；據統計學分析；該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個唾液蛋白峰組成。本發明通過由人唾液蛋白中質荷比(m/z)由5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個蛋白峰建立的分類預測模型，將檢測人唾液中相應的蛋白質的m/z與模型進行分析，可以初步用于慢性胃炎的診斷，識別率為91.67％，預測能力73.33％。本發明的模型準確率為90.63％(29/32)，靈敏度為100％(14/14)，特異度為83.33％(15/18)。本發明的構建方法簡單，合理可行，操作簡便，可批量處理的特點。【專利說明】一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬于唾液蛋白診斷【
技術領域：
】，尤其涉及一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法。【
背景技術：
】[0002]唾液是人體不可缺少的一種重要體液，血液成分如多種激素、氨基酸、電解質、免疫球蛋白、肌酐等均可通過毛細血管壁的唾液血液屏障進入唾液。作為人體體液的一部分，其成分含量的變化，受體內各種病理生理變化的影響。研究發現唾液成分與血清相關，特別是研究證實作為唾液主要成分的蛋白質與血清成正相關。隨著科學技術的發展，人們對于臨床診斷指標的要求不斷提高，不僅要求正確、敏感，而且要求無創、簡便，唾液不僅取材方便，無創傷性，可隨時進行動態觀察，且實驗結果穩定，方法靈敏度高，重復性好。隨著生化微量分析技術的進步，使人們開始考慮用唾液代替血液作為診斷指標。唾液研究方面走在前列的美國現正致力于開展一項重點研究計劃--創立唾液診斷學(salivarydiagnostics)，即在研究正常人唾液中的全部蛋白質組分的基礎上，創建以唾液為研究對象、快速實時(real-time)反映機體狀態的、可檢測各種系統性疾病和口腔疾病的蛋白質研究體系，如蛋白質芯片等。基于唾液的檢驗診斷技術將會對臨床醫學及腫瘤學、分子生物學、內分泌學、病毒學、細胞生物學、免疫學、微生物學、流行病學、法醫學、生物芯片以及生物信息學等多個學科的基礎研究產生深遠的影響。[0003]隨著蛋白質組學研究范圍的不斷拓展，唾液蛋白質組學(Salivaryproteomics)作為一個年輕的新興的研究領域，加上蛋白質組學技術的全面推廣[0004]和提聞，其自動化、聞通量、聞靈敏度和可重復的特點，正在逐漸引起人們的廣泛關注。唾液蛋白質組的分析精度提高，技術難度降低，從而使得口腔內唾液蛋白的研究轉移到提高蛋白組的全表達譜研究和疾病生物標記確立，生物靶向治療應用研究中去，使其能夠更好的為臨床診斷服務，為人類疾病治療做貢獻。唾液蛋白質組學旨在以“組學”的研究思路尋找、發現和鑒定唾液中與疾病過程和治療過程相關的生物標志物(蛋白質、多肽)，致力進行唾液蛋白質組比較檢測，全譜檢測的一門科學.它的發展直接影響了唾液分析在臨床診斷中的地位和水平。國外唾液蛋白質組學研究已經引起廣泛關注。長期以來，由于原有的技術限制了口腔唾液蛋白的通量分析和精確測定，使大多數唾液蛋白的生物功能處于未知狀態，唾液在人體疾病中的診斷和預后判斷中的潛在作用并未顯現。隨著高通量、高精度的蛋白質組學的應用，使得唾液蛋白中生物標記用于疾病的早期診斷預防、生物蛋白靶向治療、預后監測判斷等均已成為可能。近幾十年來利用唾液作為檢測人體疾病的手段，用來診斷感染性疾病、免疫性疾病、內分泌疾病及腫瘤等眾多疾病方面均已取得不少成果。目前國內對開展唾液蛋白組學的研究僅限于口腔疾病及糖尿病。[0005]基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALD1-T0F-MS)是近年來發展起來的一種軟電離新型有機質譜，通過引入基質分子，使待測分子不產生碎片，解決了非揮發性和熱不穩定性生物大分子解吸離子化的問題，是分析難揮發的有機物質的重要手段之一，并于2002年獲得諾貝爾化學獎。從此，MALD1-TOFMS在世界范圍內得到了突飛猛進的發展，并廣泛應用于生物技術和制藥企業的藥物開發、科研領域的生物分析和化學檢測以及安全部門的核輻射、化學物質和生物病原體的監測等。[0006]慢性胃炎系指各種病因引起的慢性胃黏膜炎性病變，是一種消化系統常見病，其發病率在各種胃病中居首位。目前慢性胃炎的確診主要依賴于胃鏡檢查和胃黏膜活檢，存在一定的局限性和損傷性，患者不容易接受。因此從唾液蛋白來探索慢性胃炎的診斷模型是無創傷、無痛苦、簡便易行、重復性好的一種診斷模式，故較內窺鏡和X線鋇餐更易為病人接受。【
發明內容】[0007]本發明實施例的目的在于提供一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法，旨在解決現有的慢性胃炎檢測存在的缺少診斷模型和局限性的問題。[0008]本發明實施例是這樣實現的，一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法包括以下步驟:[0009]步驟一，唾液標本的收集和處理，每個唾液樣本采集量為2ml?5ml，所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉送實驗室，4°C冰箱過夜后離心，分裝后于-80°C冰箱保存，實驗時由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復凍融；[0010]步驟二，采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存-20°C，24小時之內質譜分析；[0011]步驟三，點樣及質譜分析，將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點靶，室溫下干燥后，再各點基質溶液，然后將制備好的點樣板置于MALD1-TOF質譜儀上進行分析，應用線性模式；[0012]步驟四，據統計學分析，用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統計學檢驗方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN建立分類預測模型；[0013]建立分類預測模型的具體方法為:[0014]首先使用遺傳算法，設變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率用隨機抽樣方法，隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次，驗證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統計學意義。[0015]進一步，在步驟三中，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa，激光能量為20%，累計400shots，質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖。[0016]進一步，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法的步驟為:[0017]第一步，唾液收集時間為6:00AM?8:00AM，收集前一晚睡前不再進食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚，吐入置于經過冰浴預冷的50ml離心管內，每個唾液樣本采集量為2ml?5ml,米集時間為20min?30min,每個樣本米集完立即放入冰盒內；[0018]第二步，標本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉送實驗室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以lOOOOr/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實驗時由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復凍融；[0019]第三步，磁珠選擇:選擇WCX磁珠進行實驗；[0020]第四步，磁珠處理步驟:[0021]步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下搖動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；[0022]步驟二，取出IOul磁珠結合緩沖液加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；[0023]步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；[0024]步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；[0025]步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；[0026]步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0027]步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液；[0028]步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復移動樣品管10次；[0029]步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；[0030]步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0031]步驟十一，重復步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時，要保證懸浮液完全被吸走；[0032]步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液，混勻貼壁的磁珠，反復吸打10次，吹打過程中應避免起泡；[0033]步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；[0034]步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩定緩沖液，用加樣槍吸打混勻；[0035]步驟十五，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存_20°C，24小時之內質譜分析；[0036]第五步，點樣及質譜分析[0037]將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點靶，室溫下干燥后，再各點Iul濃度為0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點樣板置于MALD1-T0F質譜儀上進行分析，應用線性模式，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa，激光能量為20%，累計400shots，質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖；[0038]第六步，數據統計學分析[0039]使用儀器上配置的由Bruker公司開發的數據分析系統，系統包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinPr0T00ls2.1中的統計學檢驗方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN建立分類預測模型，首先使用遺傳算法，設變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率，用隨機抽樣方法，隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次，驗證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統計學意義。[0040]本發明實施例的另一目的在于提供一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個唾液蛋白峰組成。[0041]本發明提供的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構建方法，通過由人唾液蛋白中質荷比(m/z)由5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個蛋白峰建立的分類預測模型，將檢測人唾液中相應的蛋白質的m/z與模型進行分析，可以初步用于慢性胃炎的診斷，識別率為91.67%，預測能力73.33%。本發明的模型準確率為90.63%(29/32)，靈敏度為100%(14/14)，特異度為83.33%(15/18)。本發明的構建方法簡單，合理可行，操作簡便，可批量處理的特點。【專利附圖】【附圖說明】[0042]圖1是本發明實施例提供的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法流程圖。【具體實施方式】[0043]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。[0044]下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。[0045]一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型主要由人唾液蛋白中質荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個唾液蛋白峰組成。[0046]如圖1所示，本發明實施例的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法包括以下步驟:[0047]SlOl:唾液標本的收集和處理:每個唾液樣本采集量為2ml?5ml，所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉送實驗室，4°C冰箱過夜后離心，分裝后于-80°C冰箱保存，實驗時由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復凍融；[0048]S102:采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存_20°C，24小時之內質譜分析；[0049]S103:點樣及質譜分析:將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點靶，室溫下干燥后，再各點基質溶液，然后將制備好的點樣板置于MALD1-TOF質譜儀上進行分析，應用線性模式；[0050]S104:據統計學分析:用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統計學檢驗方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN建立分類預測模型；[0051]在步驟S103中，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa。激光能量為20%，累計400shots。質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖(PMF)；[0052]在步驟S104中，建立分類預測模型的具體方法為:[0053]首先使用遺傳算法，設變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率用隨機抽樣方法，隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次，驗證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統計學意義。[0054]以下結合本發明的具體實施例對本發明做進一步的說明:[0055]第一步，唾液收集時間為6:00AM?8:00ΑΜ，收集前一晚睡前不再進食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚至一定量后，吐入置于經過冰浴預冷的50ml離心管內，每個唾液樣本采集量大約2ml?5ml，采集時間為20min?30min，每個樣本采集完立即放入冰盒內；[0056]第二步，標本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉送實驗室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以10000r/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實驗時由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復凍融；[0057]第三步，磁珠選擇:為選擇最適合的磁珠類型，使用三種不同磁珠(離子交換型WCX(弱陽離子)磁珠、疏水型HIC-8磁珠、銅螯合型IMAC-Cu磁珠)對樣品進行檢測分析，經比較發現唾液樣品用WCX磁珠磁珠富集后的峰較多P值較小，說明WCX找到的峰差異較顯著，所以最終選擇WCX磁珠進行實驗；[0058]第四步，磁珠處理步驟:[0059]步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下搖動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；[0060]步驟二,取出IOul磁珠結合緩沖液(bindingsolution,BS)加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；[0061]步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；[0062]步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；[0063]步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；[0064]步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0065]步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液(washingsolution,WS)；[0066]步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復移動樣品管10次(注意磁珠在管中的運動)；[0067]步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；[0068]步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0069]步驟十一，重復步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時，要保證懸浮液完全被吸走；[0070]步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液(elutingsolution,ES),混勻貼壁的磁珠,反復吸打10次,吹打過程中應避免起泡；[0071]步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；[0072]步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩定緩沖液(Stablesolution,SS),用加樣槍小心吸打混勻；[0073]步驟十五，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存-20°C，24小時之內質譜分析；[0074]第五步，點樣及質譜分析[0075]將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點靶，室溫下干燥后，再各點Iul濃度為0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點樣板置于MALD1-TOF質譜儀上進行分析，應用線性模式，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%,累計400shots，質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖(PMF)；[0076]第六步，數據統計學分析[0077]使用儀器上配置的由Bruker公司開發的數據分析系統，系統包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinProTools〗.1中的統計學檢驗方法(參數T-Test和非參數方法WilcoxonTest)尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN(k-nearestneighboure,k=I,3,5，7)建立分類預測模型,首先使用遺傳算法,設變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率，用隨機抽樣方法(隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次)，驗證模型的有效性(平均特異性、靈敏性及平均正確率)，P<0.05為差異有統計學意義。[0078]結合以下結果和份系對本發明的使用效果做補充說明:[0079]結果:通過正常對照組與慢性胃炎組比較，除算法選擇問題被排除的樣本共32例，對樣本檢測質譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質峰為74個，其中通過遺傳算法找到5個有統計差異顯著的蛋白峰(P<0.05)，通過WCX磁珠富集之后，ClinProTools得出了最適宜的區分模式模型，選擇質荷比(m/z):5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da這3個相關峰，通過分析這些差異蛋白峰表達譜，建立了分類預測模型，識別率為91.67%，預測能力73.33%，臨床回代檢驗結果，對研究中14例慢性胃炎患者全部被準確檢出，18例正常組對照者，15例被正確檢出，該模型的準確率為90.63%(29/32)，靈敏度為100%(14/14)，特異度為83.33%(15/18)，(表1，2)。[0080]表1慢性胃炎唾液蛋白質組診斷模型的臨床符合率【權利要求】1.一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法包括以下步驟:步驟一，選擇慢性胃炎和健康對照組，唾液標本的收集和處理，每個唾液樣本采集量為2ml~5ml,所有收集的樣品放入冰盒后,立即轉送實驗室,4C冰箱過夜后尚心，分裝后于_80°C冰箱保存，實驗時由_80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復凍融；步驟二，采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存_20°C，24小時之內質譜分析；步驟三，點樣及質譜分析，將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點靶，室溫下干燥后，再各點基質溶液，然后將制備好的點樣板置于MALD1-TOF質譜儀上進行分析，應用線性模式；步驟四，據統計學分析，用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統計學檢驗方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN建立分類預測模型；建立分類預測模型的具體方法為:首先使用遺傳算法，設變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率用隨機抽樣方法，隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次，驗證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P小于0.05為差異有統計學意義。2.如權利要求1所述的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法，其特征在于，在步驟三中，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%，累計400shots，質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖。3.如權利要求1所述的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構建方法的步驟為:第一步，唾液收集時間為6:00AM~8:00AM，收集前一晚睡前不再進食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚，吐入置于經過冰浴預冷的50ml離心管內，每個唾液樣本采集量為2ml~5ml,米集時間為20min~30min,每個樣本米集完立即放入冰盒內；第二步，標本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉送實驗室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以10000r/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實驗時由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復凍融；第三步，磁珠選擇:選擇WCX磁珠進行實驗；第四步，磁珠處理步驟:步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下搖動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；步驟二,取出IOul磁珠結合緩沖液加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液；步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復移動樣品管10次；步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應清澈；步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；步驟十一，重復步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時，要保證懸浮液完全被吸走；步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液，混勻貼壁的磁珠，反復吸打10次，吹打過程中應避免起泡；步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩定緩沖液,用加樣槍吸打混勻；步驟十五，加入穩定緩沖液的洗脫液可以用來直接質譜分析或凍存_20°C，24小時之內質譜分析；第五步，點樣及質譜分析將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點靶，室溫下干燥后，再各點Iul濃度為.0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點樣板置于MALD1-TOF質譜儀上進行分析，應用線性模式，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%，累計400shots，質譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質量指紋圖；第六步，數據統計學分析使用儀器上配置的由Bruker公司開發的數據分析系統,系統包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進行標峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統計學檢驗方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結合KNN建立分類預測模型，首先使用遺傳算法，設變異率為0.2，交叉率為.0.5，初始染色體個數為1000，適應度函數用KNN判定結果的準確率，最終經過10000次進化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了幾個蛋白峰，建立模型，計算模型的特異性、敏感性及平均準確率，用隨機抽樣方法，隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，運行十次，驗證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統計學意義。4.一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質荷比分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個唾液蛋白峰組成。【文檔編號】G01N27/62GK104007166SQ201410234499【公開日】2014年8月27日申請日期:2014年5月29日優先權日:2014年5月29日【發明者】吳正治,孫珂煥,曹美群申請人:深圳市第二人民醫院