一種分離尿液中外泌體的方法與流程

本發明涉及生物化學與細胞生物學領域，具體地講，涉及一種分離尿液中外泌體的方法及試劑盒。

背景技術：

尿液不僅能提供關于腎的疾病標記物，同樣能提供關于尿道及前列腺等的標記物。這些生物標記物能夠游離存在于尿液或存在于由膜雙層所包裹的外泌體中。尿液外泌體是直徑為40-100nm的小囊泡，起源于細胞內吞作用，當一個多泡小體與所有腎單元段的細胞膜融合之后而被分泌到尿液中。尿液外泌體不僅包含蛋白質，同時也包含有功能性的mirna及mrna分子，這些在靶細胞中能夠被翻譯成為蛋白質而介導細胞間的通訊。這些功能性mirna/rna分子被證實能作為腎功能障礙及結構性損傷相關的分子標記物之后，研究對于尿液外泌體的研究興趣異常濃厚，于是激發了新一輪對于分離外泌體及從外泌體中提取這些分子的熱情。

最經典的從體液中分離外泌體的方法是基于連續低溫梯度超速離心的方法。這種方法從尿液中分離外泌體既費時，又需要昂貴的超高速離心機，每次都只能處理較少數量較小體積的樣本，因此限制了其臨床應用的可能性。最近幾年，已經有一些成熟的外泌體提取試劑盒相繼上市，這些試劑盒不需要特殊設備，可以方便快捷地提取外泌體及其所攜帶的rna。此類試劑盒中，有的是利用特殊設計的過濾器過濾掉非外泌體成分，同時把外泌體中的rna成分釋放出來，直接用于接下來的實驗；有的則是高分子聚合物的體積排阻效應，把外泌體沉淀出來。這樣一來，從體液中分離外泌體變得省時省力，且成本大大降低。

不同的試劑盒在分離外泌體的效率方面差別明顯。由于不同體液之間的生化特性等的差異，制定改進適用于特定體液如尿液中外泌體分離的方法，如何在目前標準的分離操作的技術上再進一步提高分離的效率，使得其能滿足后續的蛋白及rna分子的分析等要求，顯得十分必要。

人體正常排出的尿液中富含tamm–horsfall蛋白（thp）。它是一種糖蛋白，生理條件下，其在尿液中由單體形式聚集形成分子量巨大的多聚體。尿液thp多聚體之間形成的網格狀結構會捕獲相當數目的外泌體。由于thp豐度較高，因此在一定程度上降低了尿液中外泌體的產量。研究發現，在加入二硫蘇糖醇(dtt)之后，thp的多聚化網格能夠被打亂，從而能夠從中釋放外泌體，增加外泌體提取的產量。另外，較低的溫度會有利于thp的多聚化及沉淀，因此，適當提高操作及孵育溫度可以減少外泌體的損失。

發明人在之前的研究實踐中，先后采用了不同的方法分離尿液中的外泌體，對不同的外泌體富集和rna提取的方法進行了比較，同時基于上述的背景，對尿液中外泌體的分離方法進行改進，提出了本發明所采用的技術方案。

通過比較實驗證明，利用本發明所提供的方法能夠從每ml尿液中獲得最大數量的外泌體顆粒。與優選方案的標準的exoquick-tc的操作流程相比，這種方法同樣也能產生較高數量及更優質量的外泌體mirna和mrna。因此，這為尿液外泌體分離及尿液外泌體分子標記物的開發提供了一個有用的重要工具。

技術實現要素：

本發明的目的在于開發一種低成本高效率的方法來分離提取尿液中的外泌體。

為了實現本發明的目的，本發明提供的一種簡單快捷高效分離尿液中外泌體的方法，步驟如下：

s1.收集尿液，離心，保留上清液（sn1）。具體地，

s1a.在無菌容器中收集第一次的尿液樣本；

s1b.在每50ml尿液中加入1mlpic溶液以減少蛋白的降解；

s1c.在37℃條件下，將10ml尿液/pic混合溶液17,000×g離心10分鐘；

s1d.轉移上清液sn1到新的管中并留存。

s2.使用二硫蘇糖醇dtt處理底部沉淀；具體地，

s2a.加入500μl分離溶液重懸沉淀，渦旋30秒；

s2b.加入100mgdtt使得最終濃度為200mg/ml；

s2c.在37℃條件下孵育樣品10分鐘，在孵育期間，每隔2分鐘渦旋振蕩直到沉淀完全溶解。

s3.處理后的混合液經離心獲得上清（sn2），與第一次得到的上清sn1混合；具體地，在s2c所得到的重懸液中加入1ml分離溶液，混勻，在37℃條件下，17,000×g離心10分鐘，得到上清sn2，將其與第一次得到的上清sn1混合。

s4.將特定體積的商業化外泌體沉淀試劑加入到總的上清液中（sn1+sn2），混勻后在4℃孵育至少12個小時；具體地，

s4a.將上清混合液sn1+sn2轉移到一個大的無菌管中，測定其總體積；

s4b.按照各自相應的操作指南，加入特定體積的商業化外泌體沉淀試劑，優選地，使用systembioscience所生產的exoquick-tc外泌體沉淀試劑，再優選地，在每10ml上清混合液中加入3.3mlexoquick-tc外泌體沉淀試劑，來回顛倒混勻；

s4c.在4℃條件下過夜（至少12個小時）孵育混合液

s5.將上清與外泌體沉淀試劑混合液離心，在管底得到可見的外泌體沉淀；具體地，

s5a.在4℃條件下10,000×g離心混合液30分鐘，離心后在管底可見米黃色或淺白色沉淀；

s5b.再1,500×g離心5分鐘，快速旋轉出除殘留的余量液體，管子開口放置2-3分鐘以晾干所有的可能液體。

s6.加入磷酸鹽緩沖液（pbs）重懸外泌體沉淀；具體地，加入100μl磷酸緩沖液，不斷攪動重懸沉淀，直至液體完全透亮在光下不顯示有任何懸浮顆粒。

基于以上從尿液中分離外泌體的具體操作步驟，本發明還構造了一種分離尿液中外泌體的試劑盒，包括：商業化的外泌體沉淀試劑，優選地，exoquick-tc，dtt、蛋白抑酶混合劑、分離溶液及磷酸鹽緩沖液。

本發明采用基于改進的外泌體沉淀法分離尿液外泌體的方法，可以實現簡單快速高效的分離尿液的外泌體，且本發明具有以下優點：

首先，避免了超高速離心機對實驗的限制，這在一般的生物實驗室及臨床病理檢驗等科室都可以達到。

其次，起始尿液采用較高速的離心去除尿沉渣、細胞、細胞膜碎片、其他殘渣及聚集體較大的thp等。這樣就避免其他試劑盒逐步分離的繁復操作，通過后續的dtt處理能夠獲得純度更高的外泌體，為后續外泌體蛋白及rna的分析提供了更加有效可靠的基礎。

最后，使用還原性的試劑處理底部沉淀，通過轉移到較高溫度來解聚thp蛋白并釋放包裹在其中的外泌體，因此進一步提高了外泌體分離的效率。

附圖說明

圖1為通過本發明所述方法分離外泌體的流程圖。

圖2為分別通過超速離心、通過標準exoquick-tc方法和通過本發明所述方法進行外泌體分離后nanosightns300的檢測結果。

圖3為通過westernblot的方法檢測超速離心法、標準exoquick-tc方法和本發明所述方法分離得到的外泌體的蛋白標志物flotillin1。

圖4為通過qrt-pcr的方法檢測超速離心法、標準exoquick-tc方法和本發明所述方法分離得到的外泌體中mir-192和mir-200c的相對表達情況。

具體實施方式

以下具體實施例是為了進一步闡述本發明的最佳實施例，而不用于限定本發明的范圍。實施例中未注明具體試驗條件和試驗方法的按照常規條件或制造廠商所建議的條件實施。

實施例1

健康志愿者的晨尿在知情同意的情況下被收集，并在使用前存放于-80℃冰箱。凍存的尿樣在冰上完全融化之后，劇烈渦旋振蕩90秒。取相同個體的尿樣分別采用超高速離心法、exoquick-tc常規方法及本發明所提出的方法來進行尿液中外泌體的分離富集。

超高速離心法的具體操作流程為，先將10ml尿樣在500×g離心15分鐘去除細胞及細胞碎片，上清液被轉移到新ti70離心管（70ti轉子,beckmancoulter）中，在4℃條件下17,000×g離心45分鐘去除大的囊泡，隨后轉移上清液到新的管中，4℃條件下200,000×g離心65分鐘以沉淀外泌體，最后加入100μl磷酸鹽緩沖液（pbs）重懸外泌體。

exoquick-tc常規方法即是按照systembioscience所提供的產品說明書，按照其建議的條件操作。具體來說，取10ml尿樣，3,000×g離心15分鐘，轉移上清到一個無菌管中，加入2mlexoquick-tc外泌體沉淀試劑，吹吸混勻。在4℃條件下過夜孵育后，室溫下將混合溶液1,500×g離心30分鐘。離心后，在管底可見米黃色或者淺白色沉淀。再在1,500×g離心5分鐘去除痕量的液體，晾干沉淀。最后加入100μllpbs溶液重懸外泌體。

本發明所提示方法的具體操作為：在10ml尿液中加入0.2mlpic溶液，在37℃條件下，17,000×g離心10ml尿液/pic混合溶液10分鐘，隨后轉移上清液sn1到新的管中并留存。在沉淀中加入500μl分離溶液，渦旋30秒，加入100mgdtt，在37℃條件下孵育樣品10分鐘，在孵育期間，每隔2分鐘渦旋振蕩直到沉淀完全溶解。再在溶解液中加入1ml分離溶液，混勻后，在37℃條件下，17,000×g離心10分鐘。將離心后得到的上清sn2與sn1混合，轉移到一個無菌管中，測定總體積，每10ml上清液中加入3.3mlexoquick-tc外泌體沉淀溶液，來回顛倒混勻后，在4℃條件下過夜孵育混合液。在4℃條件下10,000×g離心混合液30分鐘，離心后在管底可見米黃色或淺白色沉淀。再1,500×g離心5分鐘去除痕量的液體，晾干沉淀。最后加入100μlpbs溶液重懸外泌體。

吸取10μl以上三種方法所分離的外泌體通過加入pbs溶液稀釋10,000倍以后，取1ml上樣，使用nanosightns300（馬爾文公司）的散射光模式來進行記數。儀器配套的納米顆粒跟蹤分析軟件來自動界定樣本內小泡的數量及大小范圍，并對顆粒大小、相對密度及數量繪制曲線。

結果如圖2所示，圖2a為通過超速離心分離得到的外泌體，圖2b為通過標準exoquick-tc方法分離得到的外泌體，圖2c為使用本發明的方法分離得到的外泌體。通過直觀的方法可以看出，三種方法所分離得到的外泌體在粒徑上并無太大差別，但通過本發明所提供的方法能分離出更多的外泌體。

實施例2

利用實施例1中分離得到的外泌體進行westernblot試驗檢測外泌體中的標志性蛋白flotillin1。

分別取40ul上述三種方法所分離的外泌體溶液，在其中加入等體積的外泌體裂解液，通過移液器上下吹吸混勻樣本；隨后在冰上孵育30分鐘，每隔10分鐘顛倒離心管不斷混勻樣本；在4°c條件下，14,000×g離心10分鐘，轉移上清液到干凈的離心管中，并置于冰上；將蛋白樣本稀釋200倍后通過bca法測定λ562nm的吸光度值，通過標準蛋白溶液所繪制的標準曲線而換算其濃度；定量30ug外泌體總蛋白置于2×sds樣品上樣緩沖液中，100℃同時變性5分鐘，順序加樣到10％的sds-page凝膠中，通過10％的sds-page分離，采用濕氏電轉儀(bio-rad)恒流350ma冰浴轉膜1h20min轉到0.2mm的pvdf膜，質量體積比5％脫脂牛奶37℃封閉1小時，加一抗多克隆抗體anti-flotillin1(將原液按照體積比稀釋400倍，原液為購自abcam的多克隆抗體，貨號為ab41927)孵育過夜；加二抗(原液為山羊抗兔igg-hrp，工作液的濃度是將原液按照體積比稀釋10000倍，購自abcam，貨號ab6721)，室溫下孵育1小時，化學發光(supersignalwestpicochemiluscentsubstrate，34080，pierce)，根據試劑盒的說明書進行顯影、定影，利用上述westernblotting方法分別檢測超高速離心法、常規exoquick-tc法及本發明的技術方法所分離外泌體效果的結果見圖3。

實施例3

利用實施例1中分離得到的外泌體提取其中的mirna，通過qrt-pcr來檢測外泌體中成熟mirna的相對表達量，以表明不同外泌體分離方法的效果。

分別取40ul上述三種方法所分離的外泌體溶液，在其中加入1mltrizol溶液（invitrogen），用力渦旋振蕩后室溫靜置5分鐘，隨后加入200ul氯仿溶液，上下振蕩離心管至均一狀態，室溫靜置3分鐘后在4℃條件下12000rpm高速離心15min。吸取上層水相到新的離心管中，加入等體積的預冷異丙醇，充分顛倒混勻后，再在-20℃條件下靜置2個小時以上。4℃條件下，12000rpm高速離心15min后小心棄掉上清液，加入1ml預冷的75％乙醇洗滌沉淀，再在4℃下7500rpm離心5min，棄去液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，最后5ul加入不含rnase的無菌水溶解沉淀。使用agilentbioanalyer2100及smallrnachip（安捷倫公司）測量小rna純度及濃度。10ng的總rna與含有特定的mirna引物的taqmanmicrorna反轉錄試劑盒(appliedbiosystems)試劑混合，然后按照廠商的操作指示來完成反轉錄。實時熒光定量pcr在abisteponeplus定量pcr儀(appliedbiosystems)上進行，使用商業化的assay-on-demand(appliedbiosystems)用于每個mirna的研究。通過rnu6b的表達來進行內參。每一組都進行三次重復。不同方法所分離的外泌體內mirna相對表達量如圖4所示。

本發明為簡單快速高效分離尿液中的外泌體提供了有效工具。結果證明該方法能夠提高尿液中外泌體分離的效率，能夠滿足后續外泌體蛋白及rna分子的研究。該發明對尿液外泌體rna作為分子標志物提供了理論基礎，結合不同的疾病及治療方案，可以進一步篩選疾病（如癌癥等）和藥物使用中用于病程監控的生物標志物。