一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器及其應用的制作方法

本發明涉及微電極生物傳感技術，具體地說，涉及一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器及其應用。

背景技術：

赤霉素(GAs)是調節植物生長發育不可缺少的植物激素之一,調控種子萌發、下胚軸伸長、葉片伸展、花、果實及種子發育等眾多生理過程，其通過GA-GID1-DELLA復合物,尤其是DELLA蛋白與多種植物激素發生相互作用，對植物正常生長發育起著重要作用。

當前，在植物生理學研究中，傳統的GAs檢測多采用光化學誘導熒光法、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質譜聯用技術等離體靜態分析方法。這類方法需要對植物材料離體取樣，通過檢測浸提液中GAs濃度來推測植株體內的含量，所以需對樣品進行復雜的前處理，耗時長同時對樣品提取純度要求較高，并且這種離體檢測反應的只是植物體內某一時刻的靜態濃度或累積效應，無法對植物進行長時間實時動態分析。而隨著研究的深入，研究者們希望獲得植物體在生長發育過程及環境適應過程中植物激素的實時動態信息，從而更好的指導農業生產。所以對植物活體組織GAs的原位動態檢測顯得尤為重要。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器及其應用。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供的一種活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器具有三電極體系，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對電極，金工作電極，所述金工作電極上電沉積Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠后，再電聚合L-Cys/GA3分子印跡聚合物。

所述Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠的制備方法為：將100mL 1.0×10^-3-5×10^-3mol·L^-1的HAuCl₄溶液加熱至沸，向沸液中一次性加入9.34mL 0.0378-0.5mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，保持沸騰15-30min，自然冷卻；取10mL通過上述方法制得的金溶膠稀釋至100mL加熱至沸，向沸液中一次性加入1mL 0.0378-0.5mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL 1×10^-2-5×10^-2mol·L^-1的AgNO₃溶液，保持沸騰1-1.5h，自然冷卻。

所述L-Cys/GA3分子印跡聚合物的制備方法為：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以2：1-4:1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

進一步地，本發明提供的活體在線檢測植物赤霉素的微電極生物傳感器的金工作電極的制備方法包括以下步驟：

首先微電極陣列通過微機電加工技術(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對電極及金工作電極，其中裸露導電部分長約5-20mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進行循環伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環伏安譜圖，確保電極表面清潔；

在金工作電極上電沉積Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠進行修飾，20-40分鐘后(優選30分鐘)，用前述修飾過的金工作電極以L-Cys/CA3分子印跡聚合物溶液為電解質溶液，用循環伏安法掃描進行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液沖洗。

進一步地，循環伏安法掃描進行電聚合的工作條件為，電壓0V-1.2V，20-100mV/s(優選50mV/s)，掃描15-60圈(優選30圈)。優選地，電壓0V-1.2V，50mV/s，掃描30圈。

所述甲醇乙酸溶液的體積比為5:1-8:1(優選8:1)，沖洗時間為5分鐘。

為了能夠實現活體檢測植物組織中的赤霉素，采樣中把對植物組織的傷害降低到最小，本發明的微電極生物傳感器的電極外觀具有穿透植物組織的能力，如圖1所示的外觀，裸露導電部位長度為5-20mm。

本發明提供了上述微電極生物傳感器在活體實時檢測植物赤霉素中的應用。

具體地，檢測部位為植物的莖、葉、果實或嫩芽。

本發明提供了一種活體在線檢測植物赤霉素濃度的方法，包括：

(1)將上述微電極生物傳感器連接至電化學工作站，與不同濃度的赤霉素標準溶液反應，在工作電壓下通過計時電流法進行連續檢測，由濃度與電流關系獲得穩定的檢測GA3的工作曲線；

(2)將上述的微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學工作站，獲取電流變化，導入工作曲線，計算被測樣本內赤霉素的濃度。

具體地，活體在線檢測植物赤霉素濃度的方法的步驟(1)是用CV或DPV法與GA3的標準溶液反應，獲得工作電位為0.2V，然后在0.2V工作電位下，用計時電流法檢測不同濃度的GA3標準溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)

具體地，步驟(2)是選用培養至第15天植物幼苗做實驗材料，將微電極插入幼苗的嫩莖中，再連接至電化學工作站，在線測定1天內GA3的濃度變化。

本發明的有益效果在于：

本發明提供了一種基于微型生物傳感技術的植物體內赤霉素的活體在線監測方法，從而更全面、深入地了解植物體內赤霉素的調節規律及作用機制。本發明通過在工作電極電沉積Au/Ag核-殼結構復合納米粒子后，再電聚合L-Cys/GA3分子印跡聚合物，沖洗后獲得分子印跡敏感膜，保證檢測的靈敏度和特異性。本發明通過對活體植物體內GAs的在線監測，原位實時的掌握植物體內GAs的動態變化信息，為了解GAs參與植物生命體系的調控機理提供理論依據。應用本發明的微電極生物傳感器可實現對植物活體內GAs的在線監測，對被檢測樣本不造成本質傷害；得到的數據結果可實時動態的反映植物體內GAs的含量變化，實際應用操作簡便，易于掌握。

附圖說明

圖1為本發明所述微電極生物傳感器三電極體系外觀結構圖。

圖2為本發明所述微電極生物傳感器的金工作電極制備與檢測GAs的示意圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1工作電極的制備

(1)微電極陣列通過微機電加工技術(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對電極及金工作電極，其中裸露導電部分長約5-20mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進行循環伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環伏安譜圖，確保電極表面清潔。

(2)制備Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠：將100mL1.0×10^-3mol·L^-1的HAuCl₄溶液加熱至沸，向沸液中一次性加入9.34mL0.0378mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，保持沸騰15min，自然冷卻；取10mL通過上述方法制得的5×10^-4mol·L^-1金溶膠稀釋至100mL加熱至沸，向沸液中一次性加入1mL 0.0378mol·L^-1的Na₂C₆H₅O₇溶液，再沸；向沸液中分批加入5mL 1×10^-2mol·L^-1的AgNO₃溶液，保持沸騰1h，自然冷卻。

(3)準備分子印跡聚合物溶液：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以3：1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

(4)電極修飾過程：在金電極上電沉積Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠，30分鐘后，用上述修飾過的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質溶液，用循環伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

實施例2微電極生物傳感器的應用

先用CV或DPV法與GA3的標準溶液反應，獲得工作電位為0.2V，然后在0.2V工作電位下，用實施例1制得的微電極采用計時電流法檢測不同濃度的GA3標準溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)。

選用培養至第15天番茄幼苗做實驗材料，將微電極插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學工作站，在線測定12h內GA3的濃度變化。

分別取培養至第15天的番茄幼苗嫩莖，用傳統的液相色譜連用方法對不同時間選取的樣本(2h，4h，8h，12h)進行GA3的檢測。將液相色譜-質譜連用(HPLC-MS)得到的結果與同一時期微電極在線監測的結果進行對比。

每組實驗重復三次計算其平均值，得到結果如表1：

表1番茄幼苗莖部GA3含量檢測結果

由上表看出，利用微電極在線檢測番茄幼苗莖部GA3含量與傳統HPLC-MS方法測量結果數據基本吻合。該方法數據可靠、選擇性高，可實現對GA3高度靈敏、專一的識別，適用于植物的莖、葉、果實等不同組織部位，可實現植物體內GA3的活體在線監測，有助于了解GA3參與植物生命活動的調控規律及作用機制。

實施例3

將實施例1制得的微電極與GA3的標準溶液反應，在0.2V工作電位下，用計時電流法檢測不同濃度的GA3標準溶液(0、0.1、0.5、1.0、3.0、10、25、60nM)，得到一組電流與濃度的關系曲線Δi＝45.56+12.55lgC(r＝0.9880)。

將培養至第15天的番茄幼苗進行鹽脅迫處理，分為對照組和實驗組。將微電極插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學工作站，在線測定鹽脅迫處理后1h內GA3的濃度變化。本發明實施例1制備的微電極生物傳感器采樣間隔為0.1秒，可實時給出番茄幼苗在鹽脅迫下1h內的動態變化數據。而HPLC方法則只能對某幾個時間點進行采樣，經過復雜的處理過程再進行檢測，需要的采樣量多，而得到的信息量少，不能實現動態變化信息的采集，某些情況下可能丟失重要信息。

對比例1

1)微電極清潔后，(不電沉積Au/Ag核-殼納米粒子)用清潔過的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質溶液，用循環伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

2)將上述微電極生物傳感器連接至電化學工作站，與不同濃度的赤霉素標準溶液反應，在工作電壓下通過計時電流法進行連續檢測，由濃度與電流關系獲得穩定的檢測GA3的工作曲線為Δi＝56.82+8.45lgC(r＝0.9877)，與制備的包含電沉積Au/Ag核-殼納米粒子步驟的傳感器相比，靈敏度降低。

3)將上述的微電極生物傳感器插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學工作站，在線測定GA3，獲取電流變化，導入工作曲線，計算的赤霉素的濃度數值也偏低

表2番茄幼苗莖部GA3含量檢測結果

對比例2

1)微電極清潔后，在金電極上電沉積Au/Ag核-殼結構復合納米粒子溶膠。

2)準備分子印跡聚合物溶液：將0.007g GA3加入到100ml蒸餾水中，制備2.0×10^-4M GA3原液；將0.0024g L-Cys加入到1.0M NaOH溶液中，用0.04M的PBS溶液稀釋至100ml，制備2.0×10^-4M L-Cys原液；將L-Cys和GA3的原液以1:1的體積混合，制備分子印跡聚合物溶液。

3)用修飾有Au/Ag核-殼納米粒子的電極以分子印跡聚合物溶液為電解質溶液，用循環伏安法(電壓0V-1.2V，50mV/s)掃描30圈進行電聚合，然后用甲醇乙酸溶液(8：1)沖洗5分鐘，將模板分子沖洗掉，完成工作電極的修飾。

4)將上述微電極生物傳感器連接至電化學工作站，與不同濃度的赤霉素標準溶液反應，在工作電壓下通過計時電流法進行連續檢測，由濃度與電流關系獲得穩定的檢測GA3的工作曲線為Δi＝33.22+9.623gC(r＝0.9925)，與制備的將L-Cys和GA3的原液以2:1-4:1的體積混合的傳感器相比，靈敏度降低。

5)將上述的微電極生物傳感器插入番茄幼苗的嫩莖中，再連接至電化學工作站，在線測定GA3，獲取電流變化，導入工作曲線，計算赤霉素的濃度數值也偏低。

表3番茄幼苗莖部GA3含量檢測結果

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。