一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法及其應用與流程

本發明涉及電化學納米生物傳感以及生物檢測領域，具體地說，提供一種氨基碳量子點-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體在金電極表面自組裝修飾制備的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法及其應用。

背景技術：

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱嘔吐毒素，是一種B型單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產生，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實中；以這些被DON污染的谷物籽實加工成食品，DON也隨之進入糧食制品中，造成食品污染。DON是全球分布最廣的霉菌污染性毒素，特別特別在中國、美國、南非、阿根廷和日本。DON是一種劇毒或中等毒性的生物毒素，可致嘔吐、腹瀉、發燒等急性中毒癥狀，與貧血、免疫抑制、克山病相聯系；也與食管癌、胃癌具有密切聯系。如我國林縣、磁縣，在面粉和玉米中的DON檢出率分別為53.8％和100％，林縣樣品(玉米)中DON平均含量(范圍是384～9686ng/g)，磁縣玉米和面粉中的DON平均含量分別為7959ng/g和1032ng/g，林縣、磁縣也是我國胃癌、食管癌等惡性腫瘤高發區。隨著人們生活水平不斷提高，以大小麥為主要原料加工生產的啤酒、麥芽飲料的消費量和人群不斷增大，DON能從天然污染大麥和小麥通過麥芽轉移到麥芽飲料和啤酒中。因此，這些飲料中DON的含量監控對人們健康生活具有重要意義。目前檢測DON的方法主要有色譜法、酶聯免疫等。色譜法對操作技術要求高，檢測成本較高，免疫法需要使用價格較昂貴的酶、抗體等生化試劑，而且這些生化試劑很容易失活等不足；酶聯免疫法簡單、快速，但該法所需DON高效、特異的單抗等制備工藝復雜，且易出現假陽性等問題；中國發明CN 102559686 A公開了一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體并應用于DON的檢測，中國發明201610132667.6公開了檢測真菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，這些方法都是基于DON核酸適體熒光法檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。光分析法與電化學分析法均為儀器設備簡單、快速有效的分析方法，但熒光法易受內源性物質熒光的干擾。電化學方法是測定電化學信號，故不受內源性物質熒光的干擾，而且，電化學還有易于自動化、智能化和網絡化的優點。

技術實現要素：

針對現有檢測技術存在的不足，本發明提供了一種簡單、快速、靈敏的、高特異性的能檢測超痕量脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法及其應用。

碳量子點具有環境友好、制備工藝簡單、原料來源廣泛，特別是大量含碳可再生有機廢棄材料，都可以用來制備碳量子點，可以變廢為寶。更為重要的是，碳量子點具有奇異的光電特性、高催化活性和優良的生物相容性，并且極易進行氨基、羧基、巰基等功能化，非常適合制備具有優異性能的光化學、電化學生物復合物，非常適合構建電化學生物傳感研究平臺。因而氨基碳量子點生物復合物修飾電極在化學分析和生物分析中具有廣泛的應用。

核酸適體(Aptamer)是一類新型的識別分子。與單克隆抗體相比，其分子量較低，沒有免疫源性和毒性，可通過化學合成制備、結構改造以及標記，化學穩定性好，能可逆的變性與復性，可在常溫下保存和運輸，適體是以SELEX技術，通過重復選擇的過程從化學合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的，理論上任何分子都能找到其相應的適體，由于核酸適體的高特異性，可以制備高選擇性化學生物傳感器件，實現目標分子/物質的高選擇性檢測。

自組裝膜技術是活性分子通過化學鍵自發吸附在異相界面上而形成的有序分子組裝體系，可以在分子水平上按人們預期的目標進行設計。自組裝膜可以按預先設計，通過精確的化學控制，在電極表面構建特定的結構與功能的自組裝傳感膜，在化學及生物傳感與分子識別等領域具有顯著的優點和廣泛的應用前景。

本發明將氨基碳量子點和DON Aptamer通過自組裝的方式，在電極構建氨基碳量子點-DON Aptamer復合膜；應用碳量子點優異的電學性質與放大功能，DON核酸適體的高特異性制備高選擇性、高靈敏的DON電化學生物傳感器；在核酸適體熒光傳感中，往往存在內源性物質的背景熒光干擾；而在電化學傳感檢測中，由于采集的是電信號，則可有效地克服內源性物質(熒光信號)的干擾，電化學適配體生物傳感具有更高的檢測靈敏度和特異性。因此，能充分發揮了二者各自的優勢，增強了對DON的檢測能力，并充分發揮了自組裝技術優點，制得了具有高靈敏度和高特異性DON電化學生物傳感器。

本發明的技術方案為：

一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器包括(商品)金電極，和在金電極的金基底表面自組裝氨基碳量子點-DON核酸適體傳感膜，其通過在金電極基底表面修飾一層氨基碳量子點-DON核酸適體自組裝傳感膜制備而成，具體包括如下步驟：

(1)金電極預處理，先依次用粒經為1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al₂O₃粉對金電極進行打磨、拋光，然后將金電極依次置于HNO₃-HCl溶液、二次去離子水、乙醇中進行超聲清洗，再將金電極置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中進行電化學清洗處理，得到表面光潔的金電極；

(2)將預處理的金電極置于pH為5.0、濃度為10mmol/L的巰基丙胺-醋酸溶液中，室溫下自組裝24小時后取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(3)將步驟(2)所得電極浸入質量分數為5％的戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(4)將步驟(3)所得金電極侵入10mg/mL氨基碳量子點溶液中，在室溫下自組裝3～7小時，取出，用二次去離子水反復沖洗干凈；

(5)將步驟(4)所得金電極浸入5mmol/L的硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(6)將步驟(5)所得金電極浸入質量分數為5％的戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(7)將步驟(6)所得金電極浸入1μmol/L的氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體水溶液中，在室溫下孵化12-24小時，取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(8)將步驟(7)所得金電極浸入5mmol/L的硼氫化鈉水溶液中1小時，取出，再用二次去離子水反復沖洗干凈，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器。

進一步地，所述的氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體為5’-H₂N-AAAAAGCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGG GGGATCGTTA AGGA AGTGCC CGGAGGCGGT ATCGTGTGAA GTGCT-3’。

進一步地，所述的1μmol/L氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液是指，濃度為1μmol/L氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體-0.05mol/L、pH＝5.0的Tris-HCl溶液，并經水浴中加熱至95℃并保持5分鐘，然后并迅速冷卻至室溫的溶液。

進一步地，所述的HNO₃-HCl溶液中，HNO₃、HCl的體積比為3:1。

上述制備方法得到的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的應用，其特征在于，以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器為工作電極，對溶液中DON進行測定，其步驟如下：

(A)將1.646克鐵氰化鉀、2.212克亞鐵氰化鉀和7.45克氯化鉀置于1000mL容量瓶中，用濃度為10m mol/LpH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(簡稱PBS)溶解，然后，再向容量瓶中繼續加入濃度為10m mol/L的pH7.4的PBS溶液至800～850mL,搖勻,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探針溶液，將其置陰涼處密閉保存備用；

(B)將待測DON加入pH＝7.4，濃度為0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液中，配制成DON標準濃度系列溶液；

(C)將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器依次分別浸入步驟(B)所配制的DON標準濃度系列溶液中，40分鐘后，取出，用二次去離子水充分沖洗，得DON-核酸適體傳感器；

(D)取步驟(A)制備的探針溶液10mL置于電解池中，以步驟(C)所得DON-核酸適體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，置于電解池的探針溶液中，進行電化學交流阻抗R_et測試，并建立阻抗值R_et與DON的濃度關系式。

DON濃度為9ng/L～10μg/L的范圍內,與所測得的交流阻抗值R_et呈良好線性關系，線性關系式為R_et(KΩ)＝12.21+18.06×log(C_DON/μg/L)，檢出限為3ng/L。

在實際樣品啤酒和麥芽飲料中DON測定中，先取這些飲料適量，以超聲法除去其中的二氧化碳和泡沫，然后取除去了二氧化碳和泡沫的啤酒或麥芽飲料用pH＝7.4濃度為0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度，得到實際樣品溶液；將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器浸入2ml實際樣品溶液中，40分鐘后取出，用二次去離子水充分沖洗傳感器后，轉入10ml探針溶液中，測定R_et值，依據DON濃度與R_et值的關系，測定樣品中DON。

本發明的有益效果在于：

本發明采用自組裝法在金電極表面修飾一層氨基碳量子點-DON核酸適體復合物，使傳感器既具碳量子點優異的電化學特性和信號放大特性，又具有核酸適體的高特異性，本發明的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器具有快速、靈敏、特異性強的優點，檢測DON含量的方法可直接應用于啤酒、麥芽飲料中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量測定，方法簡單、經濟、快速；而且，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備簡便、成本低廉。

附圖說明

圖1為本發明脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的敏感膜結構示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步闡述。值得說的是，以下實施例中的單位M表示mol/L。

實施例1

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法為：

(1).進行金電極預處理，先依次用粒經為μm、μm、μm的Al₂O₃粉對金電極進行打磨、拋光，然后將金電極依次置于HNO₃-HCl(體積比為3:1)溶液、二次去離子水、乙醇中進行超聲清洗，再將金電極置于1M的H₂SO₄溶液中進行電化學清洗處理，得到基底表面光潔的金電極；

(2).氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液預處理，將濃度為1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加熱至95℃，并在95℃下保持5分鐘，然后將其立即置于冰水浴中迅速冷卻至室溫，待用，后續所用1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液即為該溶液。

(3).將預處理的金電極置于pH＝5.0的10mM巰基丙胺-醋酸溶液中，室溫下自組裝24小時后取出，用大量二次蒸餾水沖洗干凈；

(4).將(3)制備的電極，浸入5％戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(5).將(4)所得到的金電極浸入10mg/mL氨基碳量子點溶液中，在室溫下自組裝3小時，取出，用二次去離子水反復沖洗干凈；

(6).將(5)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(7).將(6)所得到的金電極，浸入5％戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(8).將(7)所得到的金電極浸入1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體水溶液中，在室溫下孵化24小時，取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(9).將(8)所得到的金電極25mM乙二醇胺水溶液中3小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(10).將(9)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，取出，然后用二次去離子水反復沖洗干凈，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器。

實施例2

(1).進行金電極預處理，先依次用粒經為μm、μm、μm的Al₂O₃粉對金電極進行打磨、拋光，然后將金電極依次置于HNO₃-HCl(體積比為3:1)溶液、二次去離子水、乙醇中進行超聲清洗，再將金電極置于1M的H₂SO₄溶液中進行電化學清洗處理，得到基底表面光潔的金電極；

(2).氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液預處理，將濃度為1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加熱至95℃，并在95℃下保持5分鐘，然后將其立即置于冰水浴中迅速冷卻至室溫，待用，后續所用1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液即為該溶液。

(3).將經(1)預處理過的潔凈的金電極置于pH＝5.0的10mM巰基丙胺-醋酸溶液中，室溫下自組裝24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(4).將(3)制備的電極，浸入5％戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(5).將(4)所得到的金電極浸入10mg/mL氨基碳量子點溶液中，在室溫下自組裝5小時，[取出，用二次去離子水反復沖洗干凈；

(6).將(5)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(7).將(6)所得到的金電極，浸入5％戊二醛水溶液中，12小時后取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(8).將(7)所得到的金電極侵入(2)制備的1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體水溶液中，在室溫下孵化12小時，取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(9).將(8)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器。

實施例3

(1).進行金電極預處理，先依次用粒經為μm、μm、μm的Al₂O₃粉對金電極進行打磨、拋光，然后將金電極依次置于HNO₃-HCl(體積比為3:1)溶液、二次去離子水、乙醇中進行超聲清洗，再將金電極置于1M的H₂SO₄溶液中進行電化學清洗處理，得到基底表面光潔的金電極；

(2).氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液預處理，將濃度為1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體-0.05M Tris-HCl(pH 5.0)溶液，置于水浴中加熱至95℃，并在95℃下保持5分鐘，然后將其立即置于冰水浴中迅速冷卻至室溫，待用，后續所用1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體溶液即為該溶液。

(3).將經(1)預處理的潔凈的金電極置于pH＝5.0的10mM巰基丙胺-醋酸溶液中，室溫下自組裝24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(4).將(3)制備的電極，浸入5％戊二醛水溶液中，24小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(5).將(4)所得到的金電極浸入10mg/mL氨基碳量子點溶液中，在室溫下自組裝7小時，取出，用二次去離子水反復沖洗干凈；

(6).將(5)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(7).將(6)所得到的金電極，浸入5％戊二醛水溶液中，18小時后取出，用二次蒸餾水沖洗干凈；

(8).將(7)所得到的金電極浸入按(2)制備的1μM氨基化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇核酸適體水溶液中，在室溫下孵化24小時，取出，用二次去離子水沖洗干凈；

(9).將(8)所得到的金電極浸入25mM乙二醇胺水溶液中3小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈；

(10).將(9)所得到的金電極浸入5mM硼氫化鈉水溶液中1小時，然后取出，電極用二次去離子水反復沖洗干凈，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器。

實施例4

(1).探針溶液的制備將1.646克鐵氰化鉀、2.212克亞鐵氰化鉀和7.45克氯化鉀置于1000mL容量瓶中，用濃度為10m mol/LpH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入濃度為10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大約至800mL),搖勻,然后再以10m mol /L的pH7.4的PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探針溶液，將其置陰涼處密閉保存備用。

(2).DON標準溶液配制，精確稱取1.0mg DON標準物質置于2ml小燒杯中，用少量pH＝7.4，濃度為0.1M Tris-HCl緩沖溶液溶解，定量轉移至的100ml容量瓶中，用上述Tris-HCl緩沖溶液定容，搖勻，得到濃度為10μg/ml的DON標準溶液；置于暗處備用；取13只25ml潔凈的容量瓶，分別編號為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13，配置DON濃度依次為50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.50ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.01ng/ml、0.009ng/ml、0.005ng/mL、0.001ng/mL、和試樣空白Tris-HCl緩沖溶液的標準系列，該DON標準系列溶液以DON標準溶液用用Tris-HCl緩沖溶液稀釋而成。

(3).將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器浸入2ml(2)所配制的標準系列溶液中，40分鐘后取出，用大量二次去離子水沖洗干凈。

(4).取(1)所制備的探針溶液10ml置于電解池中，以經(2)處理過的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑電極為輔助電極，將工作電極、參比電極和輔助電極置于電解池中，測定交流阻抗值R_ct，DON的濃度在9ng/L～10μg/L范圍,與R_ct成線性關系，線性方程為R_et(KΩ)＝12.21+18.06×log(C_DON/μg/L)，檢測限為3ng/L。

實施例5

啤酒樣品脫氧雪腐鐮刀菌烯醇回收率測定

(1)啤酒樣品處理：某品牌啤酒樣品1從某超市購得，本底DON值為38.5μg/L，量取30ml啤酒樣品置于100ml燒杯中，以超聲波超聲脫氣至無二氧化碳氣泡和泡沫備用；實施例4中所用啤酒均該品牌啤酒；啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇回收率測定的試液均用該啤酒配置。

(2)啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇回收率測定的試液配置：取20只10ml容量瓶，分別編號為A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4和D5；精確量取稱取300μl啤酒樣品5份，分別置于編號為A1、A2、A3、A4、A5的容量瓶中，然后再向編號為A1、A2、A3、A4、A5容量瓶中分別加入1.0ml濃度均為10μg/L的DON標準溶液；再精確量取150μl啤酒樣品5份，分別置于編號為B1、B2、B3、B4、B5的容量瓶中,然后再向編號為B1、B2、B3、B4、B5容量瓶中分別加入300μl濃度均為10μg/L的DON標準溶液；再精確量取30μl啤酒樣品5份，分別置于編號為C1、C2、C3、C4、C5的容量瓶中,然后再向編號為C1、C2、C3、C4、C5容量瓶中分別加入50μl濃度均為10μg/L的DON標準溶液；再精確量取3μl啤酒樣品5份，分別置于編號為D1、D2、D3、D4、D5的容量瓶中,然后再向編號為D1、D2、D3、D4和D5容量瓶中分別加入50μl濃度均為1μg/L的DON標準溶液；再分別向A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4和D5加入pH為7.4，濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液5ml，搖勻，再用pH為7.4，濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，即得到DON在啤酒樣品中回收率測定的試樣溶液，備用。

(3)探針溶液配置：將1.646克鐵氰化鉀、2.212克亞鐵氰化鉀和7.45克氯化鉀置于1000mL容量瓶中，用濃度為10m mol/LpH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入濃度為10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大約至800mL),搖勻,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探針溶液，置于陰涼處備用；另取10ml探針溶液置于電解池中，供測定交流阻抗用。

(4)啤酒試樣中DON回收率測定：將實施例2制備的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器置于2ml按(2)浸入的DON回收率測定的試樣溶液中，40分鐘后取出，傳感器用二次去離子水沖洗干凈，然后將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器(工作電極)、飽和甘汞電極(參比電極)和鉑電極(輔助電極)置于電解池的探針溶液中進行交流阻抗值測定；依據脫氧雪腐鐮刀烯醇的含量與交流阻抗的關系，求出DON的量，據此測得DON的回收率依次分別為97.5％、95.8％、96.7％、103.6％、94.5％；95.6％、98.6％；109.3％、97.6％、104.8％；98.4、99.2％、102.7％、107.3％、104.4％；101.5％、98.4％、96.3％、93.2％和95.7％；以上數據表明，回收率都保持在較高的水平，這說明用本發明的方法對DON含量進行檢測，準確率高。

實施例6

啤酒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定。

(1)啤酒樣品處理：從某超市購買得六種不同品牌的啤酒，分別將這些啤酒記為A、B、C、D、E和F；分別取A、B、C、D、E和F的啤酒樣品10ml，置于50ml燒杯中，以超聲波超聲至無二氧化碳氣泡和泡沫待用。

(2)啤酒試液制備：取18只10ml容量瓶，分別編號為A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3；D1、D2、D3；E1、E2、E3；F1、F2和F3；精確量取100μl A啤酒樣品3份，分別置于編號為A1、A2、A3的容量瓶中，精確量取100μl B啤酒樣品3份，分別置于編號為B1、B2、B3的容量瓶中，精確量取100μl C啤酒樣品3份，分別置于編號為C1、C2、C3的容量瓶中，精確量取100μl D啤酒樣品3份，分別置于編號為D1、D2、D3的容量瓶中，再精確量取100μl F啤酒樣品3份，分別置于編號為F1、F2和F3的容量瓶中，然后向編號為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3；F1、F2和F3容量瓶中分別加入pH＝4.7，濃度為0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液5ml搖勻，再向各容量瓶加入pH＝4.7，濃度為0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液至刻度，搖勻，即制得啤酒試樣溶液，待用。

(3)探針溶液配置：將1.646克鐵氰化鉀、2.212克亞鐵氰化鉀和7.45克氯化鉀置于1000mL容量瓶中，用濃度為10m mol/LpH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(PBS)溶解，然后，再向容量瓶中加入濃度為10m mol/L的pH7.4的PBS溶液(大約至800mL),搖勻,然后再以10m mol/L的pH7.4的PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，即得5.0mmol/L Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-探針溶液，置于陰涼處備用；另取10ml探針溶液置于電解池中，供測定交流阻抗用。

(4)啤酒中DON的測定：將實施例2制備的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器置于2ml按(2)浸入的啤酒試樣溶液中，40分鐘后取出，傳感器用二次去離子水沖洗干凈，然后將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器(工作電極)、飽和甘汞電極(參比電極)和鉑電極(輔助電極)置于電解池的探針溶液中進行交流阻抗值測定；依據脫氧雪腐鐮刀烯醇的含量與交流阻抗的關系，求出DON的量，據此測得A、B、C、D、E和F不同品牌啤酒中DON的含量分別以秩為2.65μg/L、2.74μg/L、2.86μg/L；36.8μg/L、37.5μg/L、36.2μg/L；1.16μg/L、1.28μg/L、1.31μg/L；35.5ng/L、40.6ng/L、38.2ng/L；11.5ng/L、11.8ng/L、12.1ng/L；19.6ng/L、20.9ng/L和21.1ng/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南科技大學

<120> 一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇電化學傳感器的制備方法及其應用

<130> 20161108

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

maaaaagcat cactacagtc attacgcatc gtagggggga tcgttaagga agtgcccgga 60

ggcggtatcg tgtgaagtgc t 81