基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒表面吸附蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法與流程

本發明屬于耗散性石英晶體微天平檢測方法的創新開發領域，主要涉及一種基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法。

背景技術：

耗散性石英晶體微天平(qcm-d)利用石英晶體諧振器的壓電特性，將石英晶體芯片電極表面質量變化轉化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化，進而通過計算機獲得高精度的數據，是一種新型的靈敏的質量檢測儀器，其測量精度可達納克級。

當納米材料進入人體內后，由于比表面積較大，會吸附人體液中的蛋白，在材料表面形成蛋白冠。蛋白冠對納米材料進入人體后的生物效應、毒理效應以及代謝途徑都有著決定作用。因此，研究納米材料與蛋白質作用的界面結構有著重要意義。

人體液中存在著幾百種蛋白，由于納米材料進入體液中并吸附蛋白形成蛋白冠，被吸附的蛋白在結構和功能上或多或少有所改變。納米材料與蛋白冠作為一個復雜的整體，對于同種材料，何種蛋白被吸附；蛋白被如何吸附；蛋白被吸附后的結構和功能被如何改變，這一系列的問題越來越受到人們關注。對于不同材料進入體內形成的蛋白冠的區別以及規律，也值得人們進一步研究。

目前，對納米材料與蛋白質的界面結構研究存在著許多困難。盡管圓二色光譜、紅外光譜、x射線晶體衍射等技術能檢測到被吸附的蛋白的各級結構變化，但對被吸附的蛋白的生理功能的改變仍然束手無策。

手性是納米材料的一個基本特性，不同的手性的納米材料進入人體后，對蛋白的吸附方式也有所區別，并對蛋白功能的改變有所差異。但這種差異通常較小，常規檢測手段很難精確地檢測出結果。

qcm-d作為微質量傳感器，操作簡單，靈敏度高，可實現在線監測，在化學、物理、生物、醫學和表面科學等領域中得到了廣泛的應用。在生物領域，qcm-d通常用于監測生物分子之間的相互作用，如：抗原-抗體之間的親和作用。通常在石英晶體芯片表面修飾一種生物分子，再直接通入另一種分子，從而檢測芯片電極表面的質量變化引起的輸出電信號的頻率變化。而對于納米材料-蛋白冠結構復雜，目前，關于基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的技術發明尚未見報導。

技術實現要素：

為了區分不同手性納米材料對吸附的蛋白的功能的影響，針對qcm-d靈敏度高這一特點，本發明提出了一種基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法。

本發明設計了一種原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白配體與細胞上受體相互作用的方法。將含有手性表面的金納米顆粒、配體蛋白、細胞膜表面受體逐層原位結合在石英晶體芯片表面，檢測被吸附的配體蛋白和受體的相互作用，從而進一步分辨出不同手性表面的金納米顆粒對吸附的蛋白在功能改變方面的區別。該方法對納米顆粒-蛋白冠復合物的進一步研究，有著至關重要的意義。

本發明是通過下述技術方案來實現的。

一種基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法，包括以下步驟：

1)采用2-巰基丙酸和2-巰基乙醇對石英晶體芯片預處理；

2)將處理過的石英晶體芯片放入qcm-d儀器中，通入edc/nhs，將芯片表面羧基活化；

3)通入表面修飾青霉胺小分子的納米金顆粒，通過酰胺鍵與芯片結合；

4)通入配體蛋白，使配體蛋白吸附在納米金的手性表面；

5)通入表面含有相關受體的細胞衍生的脂質體；通過頻率信號的強弱來將配體蛋白與相關受體的相互作用進行定量。

具體地，上述方法包括以下步驟：

1)石英晶體芯片預處理：將洗凈的石英晶體芯片用2-巰基丙酸和2-巰基乙醇處理12-24h，用三次水沖洗掉未結合到芯片上的巰基小分子，用氮氣吹干待用；

2)石英晶體芯片表面羧基的活化：將步驟1)預處理的石英晶體芯片放入qcm-d儀器中，先100-150μl/min的流速通入(qcm-d儀器中，下同)三次水，等到信號曲線平穩，再以30-50μl/min的流速通入含75mm的edc(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)和30mm的nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)溶液1-2h，等到信號曲線平穩；

3)手性表面的納米金顆粒的固定：將三次水以100-150μl/min的流速通入，直到信號平穩，再以20-40μl/min流速通入含有青霉胺分子修飾的手性表面的納米金顆粒，信號曲線大幅度變化，直到信號平穩；

4)配體蛋白的吸附：先用ph＝7.4的hepes(即4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液以50-100μl/min流速通入，到信號平穩，以40-60μl/min流速通入含0.5-2mg/ml的配體蛋白的hepes緩沖液，信號曲線變化，直到再次平穩；

5)配體-受體相互作用檢測：將pbs緩沖液以40-60μl/min流速通入，到信號平穩，再將表面含有相關受體的細胞衍生的脂質體溶液以20-40μl/min流速通入，根據信號的變化值，判斷配體-受體的相互作用強弱。

上述方法還包括以下步驟：

6)后處理：檢測結束后，將石英晶體芯片取出，浸沒在三次水:濃氨水:30％過氧化氫體積比為5:1:1的溶液中，水浴70℃，15min后倒掉混合液，用三次水清洗3遍，再用氮氣吹干；石英晶體芯片可循環使用。

進一步，所述石英晶體芯片的表面為金材質。

進一步，步驟1)采用含有體積分數0.97％的2-巰基丙酸和含有體積分數0.95％的2-巰基乙醇的混合液對石英晶體芯片進行預處理。

進一步，步驟1)具體包括：將原液體積濃度為97％的2-巰基丙酸和原液體積濃度為95％的2-巰基乙醇按1:1體積比例混合后再稀釋100倍，加到細胞培養板中(例如12孔板)，每孔1-1.5ml，將洗凈的石英晶體芯片放入孔內，完全浸沒，處理12-24h，用三次水沖洗掉未結合到芯片上的巰基小分子，用氮氣吹干待用。

進一步，步驟3)所述含有青霉胺分子修飾的手型表面的金納米顆粒的制備方法包括以下步驟：

(1)取10ml用檸檬酸還原法制備的納米金膠體溶液，加入10mg/ml的青霉胺手性分子500μl(過量)，室溫反應12-24h；

(2)將修飾青霉胺分子的納米金溶液于9500-12000r/min，離心40-60min，棄上清，用三次水重懸，除去未修飾的青霉胺分子，制得含有青霉胺分子修飾的手性表面的納米金顆粒。

進一步，本發明所述方法中，每通入一種新的溶質的溶液之前，都必須先通入不含溶質的溶劑，等到信號平穩，以免不同體系之間信號的干擾。

進一步，將配體蛋白溶液置于在ph＝7.4的hepes緩沖體系下，以免ph變化造成的蛋白的電位變化，從而改變蛋白的正常生理構型。

相應地，本發明給出一種表面含有相關受體的脂質體的制備方法，包括以下步驟：

(1)培養相關質粒轉染的半貼壁的hek293a細胞，用流式細胞儀檢測相關受體蛋白表達量；

(2)收集相關受體過表達的hek293a細胞，取4-8×10⁵/ml的細胞懸液10ml，1000r/min離心，棄上清培養基，用含有蛋白酶抑制劑的pbs緩沖液重懸；

(3)將細胞懸液通過800nm孔徑的碳纖維濾膜，制得表面含有相關受體的脂質體。

進一步，本發明使用hek293a細胞，一方面利于轉染，另一方面在收集細胞時，半貼壁狀態易收集，避免使用胰蛋白酶從而破壞表面受體。

進一步，本發明使用蛋白酶抑制劑，可以防止細胞通過濾膜時，由細胞破裂導致的溶酶體中的蛋白酶外漏，破壞表面受體。

本發明還包括上述基于石英晶體芯片的原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法在研究蛋白冠中蛋白的生物效應方面的應用。

本發明的優點及有益效果為：

(1)對石英晶體芯片逐層修飾，用qcm-d儀器可以直觀地檢測出每一步芯片上的質量改變情況。逐層修飾，以避免了配體蛋白直接與芯片表面接觸，從而引起結構改變；

(2)直接使用含有相關受體的細胞膜在原位檢測，可以更有效地模擬人體內環境，為該方法的實用性奠定了基礎。

本發明方法操作簡單，實用性強，對納米顆粒表面形成的蛋白冠的結構和功能的研究有著重要的意義。

附圖說明

圖1為本發明基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法的原理示意圖。

圖2a為實施例1中的石英芯片表面結合手性表面的納米金顆粒的原子力顯微鏡表征圖；

圖2b為實施例1中的納米金顆粒的手性表面結合轉鐵蛋白的原子力顯微鏡表征圖；

圖2c為實施例1中的轉鐵蛋白結合表面含有轉鐵蛋白受體的細胞衍生的脂質體的原子力顯微鏡表征圖。

圖3為實施例1中的石英芯片表面原位逐層結合手性表面的納米金顆粒、轉鐵蛋白、含有轉鐵蛋白受體的脂質體的qcm-d信號圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購買得到的常規產品。

下列實施例中所用到的qcm-d儀器型號為q-sensee4(瑞典百歐林科技有限公司)。

本發明基于石英晶體芯片原位定量檢測金納米顆粒手性表面吸附的蛋白與細胞膜相關受體相互作用的方法的原理示意圖見圖1。

實施例1

(1)石英晶體芯片預處理：

將洗凈的石英晶體芯片放在12孔板中，在12孔板中加入含有體積分數0.97％的2-巰基丙酸和含有體積分數0.95％的2-巰基乙醇的混合液，每孔1ml，處理12h，用三次水沖洗掉未結合到芯片上的巰基小分子，用氮氣吹干待用；

(2)石英晶體芯片表面羧基的活化：

將預處理的石英晶體芯片放入qcm-d儀器中，先100μl/min的流速通入三次水，清洗10min，等到信號曲線平穩，再以30μl/min的流速通入含75mm的edc和30mm的nhs溶液1h，等到信號曲線平穩；

(3)手性表面的納米金顆粒的制備與固定：

分別取10ml用檸檬酸還原法制備的納米金膠體溶液，分別加入10mg/ml的l型和d型青霉胺手性分子500μl(過量)，室溫反應12h；

將修飾青霉胺分子的納米金溶液9500r/min，離心1h，棄上清，用三次水重懸，除去未修飾的青霉胺分子，制得含有青霉胺分子修飾的手性表面的納米金顆粒；

將三次水以100μl/min的流速通入，直到信號平穩，再以20μl/min流速通入含有青霉胺分子修飾的手性表面的納米金顆粒，信號曲線大幅度變化，直到信號平穩；

石英芯片表面結合手性表面的納米金顆粒的原子力顯微鏡表征圖見圖圖2[a]；

(4)配體蛋白的吸附：

先用ph＝7.4的hepes緩沖液以50μl/min流速通入，到信號平穩，以50μl/min流速通入含1mg/ml的轉鐵蛋白的hepes緩沖液，信號曲線變化，直到再次平穩；

納米金顆粒的手性表面結合轉鐵蛋白的原子力顯微鏡表征圖見圖2[b]；

(5)配體-受體相互作用檢測：

培養質粒轉染轉鐵蛋白受體過表達的半貼壁的hek293a細胞，用流式細胞儀檢測轉鐵蛋白受體蛋白表達量；

收集轉鐵蛋白受體過表達的hek293a細胞，取5×10⁵/ml的細胞懸液10ml，1000r/min離心，棄上清培養基，用含有蛋白酶抑制劑的pbs緩沖液重懸；

將細胞懸液通過800nm孔徑的碳纖維濾膜，制得表面含有轉鐵蛋白受體的細胞衍生的脂質體；

將pbs緩沖液以40μl/min流速通入，到信號平穩，再將表面含有轉鐵蛋白受體的細胞衍生的脂質體溶液以30μl/min流速通入，根據信號的變化值，判斷轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體的相互作用強弱。

石英芯片表面原位逐層結合手性表面的納米金顆粒、轉鐵蛋白、含有轉鐵蛋白受體的脂質體的qcm-d信號圖見圖3。圖3中橫坐標指時間，縱坐標為頻率信號，au為納米金顆粒，transferrin為轉鐵蛋白，liposome為細胞衍生的脂質體。

進一步，上述方法還包括以下步驟：

(6)后處理：檢測結束后，將石英晶體芯片取出，浸沒在三次水:濃氨水:30％過氧化氫體積比為5:1:1的溶液中，水浴70℃，15min后倒掉混合液，用三次水清洗3遍，再用氮氣吹干。石英晶體芯片可循環使用。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。