用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法與流程

本發明屬于煙葉揮發油測定技術領域，尤其涉及一種用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法。

背景技術：

煙葉揮發油是具有揮發性的植物性油狀物，其成分包括：醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、酚類、醚類和萜烯烴、芳香烴類等許多成分，其中萜類、烯類等物質能吸收紫外光。煙葉揮發油易溶于有機溶劑、能隨水蒸氣蒸餾揮發而不被破壞，可以通過蒸餾萃取的方法提取獲得。煙葉揮發油是體現煙葉優良商品特性的重要物質。了解烤煙葉中揮發油含量的高低對于認識煙葉品質有重要幫助。“稱重法”是目前應用較多的揮發油定量方法，其過程是將煙葉揮發油經水蒸氣蒸餾和有機溶劑萃取后進行脫水干燥和有機溶劑揮發，最后稱出殘余物的重量。具體步驟如下：

1)首先用同時蒸餾萃取法獲得溶解于二氯甲烷中的煙葉揮發油并將其轉移到已知重量的容器內(重量w1)；

2)在室溫常壓條件下揮發或在減壓條件下蒸餾使二氯甲烷溶劑揮發散盡；

3)稱量出容器與揮發油的共同重量(重量w2)；

4)用“w2-w1”計算出提取得到的揮發性半揮發性物質量。

但上述方法都具有測定周期時間長、操作環節干擾因素較多、測定結果重復性欠佳等不足。紫外分光光度法在多種植物揮發油研究中有較為廣泛應用，表現出簡便、快速、準確、低成本等優勢；但利用紫外分光光度法測定烤煙葉揮發油溶液濃度的方法尚未見報道。

綜上所述，現有技術存在的問題是：目前的“稱重法”煙葉揮發油測定方法的不足在于：工作量大、工作時間周期長通常需要8個小時以上，工作環節多、易產生誤差。原因如下：

步驟1)和3)的稱重操作都涉及到物體的恒重測定，需要對物體進行烘干除水，此操作耗時2-3小時、期間易發生控溫不當造成揮發油受熱揮發、導致重量損失；若采用在常溫下、裝有硅膠干燥劑的干燥器中進行平衡干燥法除水，則耗時在24小時左右。

其步驟2)中若以“室溫常壓條件下使二氯甲烷揮發散盡”則耗時可長達24小時，測定周期時間長；若以“減壓條件下蒸餾使二氯甲烷揮發散盡”則易使揮發油組分揮發、導致重量損失。

因此，采用“稱重法”測定揮發油時必須設置多個重復樣本才能有效降低測定誤差，但這樣會大大增加工作量。

技術實現要素：

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法。

本發明是這樣實現的，以分光光度法測定出不同濃度烤煙揮發油溶液的紫外光譜，找出特征吸收峰所在的波長范圍224nm-245nm；再以梯度溶液的濃度作自變量、以其在224nm-245nm內各波長下對應的紫外吸光度作因變量，求二者間的線形式擬合模型，發現當以波長為239nm處的吸光度為因變量時，其擬合模型決定系數r²最高，宜作為標準曲線；從而確定了建立最佳線性擬合模型的條件。

所述用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法包括以下具體步驟：

步驟一，提取烤煙揮發油：以二氯甲烷作為溶劑、用同時蒸餾萃取法提取烤煙揮發油，經無水硫酸鈉脫水和室溫常壓條件下二氯甲烷溶劑揮發后，再將待測物放入常溫下、裝有硅膠干燥劑的干燥器中24小時、以去除其微量水，最后稱得烤煙揮發油重量；

步驟二，梯度溶液的制備：將上步所獲得的烤煙揮發油用二氯甲烷進行復溶、定容得到母液并計算出其準確的濃度，母液再經分取、稀釋、定容，得到由5-6個不同濃度烤煙揮發油溶液組成的梯度溶液；

步驟三，測定梯度溶液的od239：用紫外分光光度計逐一測定上步中配制的梯度溶液在239nm波段處的吸光度；

步驟四，建立線性標準曲線：將各烤煙葉揮發油梯度溶液的濃度作為自變量、對應的od239作為因變量，求得二者的線性回歸相關曲線；以此作為標準曲線可用于求得烤煙揮發油梯度溶液的濃度。

進一步，所述用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法以各梯度溶液的濃度作自變量、以其在波長239nm處的吸光度od239作因變量，求二者間的線性回歸擬合模型y＝ax+b，作為測定烤煙葉揮發油溶液濃度的標準曲線。公式中

y：揮發油溶液在239nm處的吸光度(因變量)

x：揮發油溶液的濃度(自變量，單位mg/ml)

a：線性回歸方程的斜率(常數)

b：線性回歸方程的截距(常數)

本發明的優點及積極效果為：按此法制備好測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線后，當要測定其它烤煙葉樣品的揮發油時，則無須對每個提取得到的揮發油溶液進行干燥和稱重操作，只須用紫外分光光度計測定其239nm處的吸光度、再將其代入標準曲線就可求出其濃度，進而求得揮發油的物質量。由此可使每個煙葉樣品的揮發油含量測定工作時間縮短少則5-6小時以上，可提高工作效率約200％；同時可以減少烘干和稱重操作所引起的誤差。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的標準曲線示意圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法包括以下步驟：

s101：提取烤煙揮發油：以二氯甲烷作為溶劑、用同時蒸餾萃取法提取烤煙揮發油，經脫水和二氯甲烷溶劑揮發、稱得烤煙揮發油重量；

s102：梯度溶液的制備：將上步所獲得的烤煙揮發油用二氯甲烷進行復溶、定容得到母液并計算出其準確的濃度，母液再經分取、稀釋、定容，得到由5-6個不同濃度烤煙揮發油溶液組成的梯度溶液；

s103：測定梯度溶液的od239：用紫外分光光度計逐一測定上步中配制的梯度溶液在239nm波段處的吸光度；

s104：建立線性標準曲線：將各烤煙葉揮發油梯度溶液的濃度作為自變量、對應的od239作為因變量，求得二者的線性回歸相關曲線；以此作為標準曲線可用于求得烤煙揮發油梯度溶液的濃度。

本發明實施例提供的用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法包括以下步驟：

(1)按同時蒸餾萃取法提取調制后烤煙葉的揮發油；

(2)用二氯甲烷配制至少5種濃度的烤煙揮發油梯度溶液；

(3)測定揮發油梯度溶液在239nm波段處的吸光度；

(4)以各梯度溶液的濃度作自變量、以其在波長239nm處的吸光度(od239)作因變量，求二者間的線性回歸擬合模型(y＝ax+b)，以此作為測定烤煙葉揮發油溶液濃度的標準曲線。

下面結合具體實施例對本發明的應用原理作進一步的描述。

本發明實施例提供的用于測定烤煙葉揮發油溶液濃度的線性標準曲線建立方法包括以下步驟：

(1)提取烤煙揮發油：將煙葉置于40℃烘箱內烘干，用粉碎機粉碎；分別取上中下5g混合烤煙樣品、150ml蒸餾水和20g氯化鈉加入同時蒸餾萃取裝置一端，另一端加入25ml二氯甲烷于有機溶劑容器中進行蒸餾萃取，保持微沸，萃取時間3h；回收二氯甲烷，加入適量的無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液用已稱重的具塞刻度試管(50ml)收集，去塞，于25℃下揮干溶劑后，用天平精確稱取此時試管重量，得到煙葉揮發油重量(0.036g)。

(2)梯度溶液的制備：將上述煙葉揮發油(0.036g)用二氯甲烷復溶后無損轉移到10ml容量瓶中定容，作為母液(7.2mg/ml)。從母液中精密分量取不等量的6份，用二氯甲烷在6個容量瓶中準確稀釋成6種濃度(1.440mg/ml、0.960mg/ml、0.720mg/ml、0.480mg/ml、0.360mg/ml、0.288mg/ml)。

(3)測定梯度溶液的od239：用紫外分光光度計對上步中配制的梯度溶液逐一測定239nm波段吸光度。

表1不同濃度下烤煙揮發油在od239吸光度

(4)建立線性標準曲線：求出烤煙葉揮發油溶液濃度與所測得的od239值做線性相關回歸分析，得到線性標準曲線，如圖2所示。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。