本發明涉及醫學檢測，具體涉及一種利用共價和非共價結合增強抗體檢測靈敏度的方法。
背景技術：
1、準確的疾病診斷是指導臨床治療的關鍵步驟，傳統的y型抗體用來識別特定蛋白已廣泛應用于科研、臨床診斷和治療相關領域，但是傳統抗體的尺寸過大限制了序列加工、表達以及在體內作為藥物的應用價值。
2、與已經在臨床開發中取得數十年成功的igg抗體相比，納米抗體是一個年輕的充滿未知的平臺。hamers等科學家發現在駝科中存在一種缺失輕鏈和第一恒定區(ch1)、通過重鏈上的可變區結合抗原的單鏈抗體(heavy?chain?antibodies,hcab)，與人類igg3的vh具有較高的序列和結構相似性，之后陸續在鯊魚、鰩魚等軟骨魚中同樣發現了類似結構的抗體。羊駝抗體的可變結構域(variable?domain?of?heavy?chain?antibody，vhh)部分就可以與抗原結合。由于這種vhh長4nm，直徑2.5nm，分子量為12–15kda，是目前已知最小的抗原結合蛋白，僅為傳統抗體的十分之一，也被稱為納米抗體(nanobody,nb)。納米抗體具有大規模、低成本地在多種系統中表達，具備可塑性強、水溶性好、親和性和穩定性高、特異性強、小尺寸、具備易改造篩選和純化等優點，能夠識別傳統抗體難以識別的較為隱匿的抗原表位。
3、隨著治療各種疾病及檢測方面的應用不斷深入，納米抗體應用于成像技術及疾病診斷研究，需要較高的準確度和靈敏度。由于納米抗體分子量小，vhh更適合分子改造來添加標簽，被用作粘合模塊創建抗體相關的融合蛋白，可以達到精準治療的目的。例如，已經發明了一種抗體-酶偶聯物，該偶聯物具有抗癌前藥的位點選擇性激活能力，將抗體作為靶向伴侶。人們致力于不斷地應用創新，使目前除了單價納米抗體外，雙價、雙特異性以及通過融合蛋白支架富集vhh的研究，來增強其對目標的特異性以及親和力等特性，更加有利于藥物發揮其高效作用。uchański等通過將納米抗體溶合表達到選定的支架蛋白質上以產生穩定和有效折疊的單體嵌合體并開發了巨型抗體，可以促進抗體的活性以及標記特定標簽。但是這種方法生產的蛋白可溶性和穩定性大大降低，蛋白純化和保存的難度變大。
4、來源于駱駝重鏈抗體的納米抗體是設計用于各種應用的最小抗體片段之一。納米抗體作為良好的生物工程材料，可以與多種報告蛋白結合。雖然vhh片段具有高度穩定性和可溶性，但由于其與抗原的單價相互作用，其缺點是在血管和組織的非平衡環境中解離速度快，親和力不滿足需求。
5、因此，提高抗體的檢測靈敏度、降低抗原抗體的解離速度具有重要意義，因此我們急需一種便捷操作，溶解性好，穩定性高，類似搭積木的模塊化拼接的納米抗體密集展示的生產方案。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種利用納米抗體多聚化策略增強抗體檢測靈敏度的方法，具體包括以下內容。
2、本發明提供了一種利用共價和非共價結合增強抗體檢測靈敏度的方法，包括以下步驟：
3、步驟一、將納米抗體重鏈可變區域(vhh)基因通過pet22b-vhh1-vhh2-spytag-6xhis載體質粒加入spytag標簽轉化至大腸桿菌top10感受態細胞中，經過培養裂解純化得到二聚體納米抗體蛋白vhh1-vhh2-spytag-6xhis；
4、步驟二、將pet28a-spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis質粒熱轉化到大腸桿菌bl21感受態細胞中，進行細胞培養和細胞解離，離心收集上清液后經親和層析純化得到可溶性七聚體蛋白骨架spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis；
5、步驟三、將可溶性七聚體融合蛋白骨架spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis與二聚體納米抗體蛋白vhh1-vhh2-spytag-6xhis進行反應共價結合，形成密集展示的可溶性七聚體巨型納米抗體融合蛋白分子。
6、優選地，步驟一中，所述vhh基因使用信號肽(pelb)作為n端前導序列，使用6xhis標簽作為c端金屬親和層析純化標簽。
7、優選地，步驟二中，所述細胞培養和細胞解離的具體操作為：
8、將大腸桿菌bl21感受態細胞在25～37℃下在含有10μg/ml氨芐西林的100ml溶液中以250r/min自誘導振蕩培養10～12h，在4℃,8000×g離心15～20min收集細胞，并使用20ml平衡緩沖液和60mg溶菌酶重懸，通過冰水浴超聲破壞重懸的大腸桿菌細胞。
9、優選地，步驟三中，所述純化的具體操作為：
10、使用ni-nta親和層析純化含有vhh1-vhh2-spytag-6his的細胞裂解液，用300mmol/l咪唑洗脫，再用10mmol/l?ph為6.8～7.4的pbs緩沖液透析。
11、優選地，所述的一種利用共價和非共價結合增強抗體檢測靈敏度的方法，具體包括以下步驟：
12、步驟一、將pet28a載體使用xhoi酶切和瓊脂糖凝膠純化，經柔性氨基酸連接子3x(ggggs)同源重組后，與編碼c4?bpα蛋白的基因序列在37～42℃結合90s，將結合后的產物電轉至新鮮制備的大腸桿菌top10感受態細胞中，并在37～42℃含100μg/ml氨芐西林的瓊脂平板培養過夜，大腸桿菌bl21感受態細胞通過自誘導表達產生二聚體納米抗體蛋白vhh-spytag-6xhis；
13、步驟二、在37～42℃熱轉化90～120s將重組載體pet28a-spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis轉化到大腸桿菌bl21感受態細胞中，25～37℃下在誘導溶液中以200～250r/min自誘導振蕩培養10～12h，在4℃,8000×g離心15～20min收集細胞，并使用20ml平衡緩沖液和60mg溶菌酶重懸，通過冰水浴超聲破壞重懸的大腸桿菌細胞，防止靶蛋白降解或變性，之后將其在4℃條件下1000×g離心15～20min收集上清液，并通過0.22μm過濾，獲得可溶性七聚體融合蛋白；
14、步驟三、使用ni-nta親和層析純化spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis融合蛋白，用300mmol/l咪唑洗脫，再用10mmol/l?ph為6.8～7.4的pbs緩沖液透析，得到純化的可溶性七聚體融合蛋白。
15、步驟四、將可溶性七聚體融合蛋白骨架spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis與二聚體納米抗體蛋白vhh1-vhh2-spytag-6xhis進行反應共價結合再與snooptag-biotin結合，形成密集展示的可溶性七聚體巨型納米抗體(14xvhh)和7個biotin分子融合蛋白分子。
16、優選地，步驟四中，所述將可溶性蛋白骨架spycatcher-c4bp-snoopcatcher-6xhis與二聚體納米抗體蛋白vhh1-vhh2-spytag-6his進行反應，通過共價與非共價結合并用的形式，形成密集展示的可溶性巨型納米抗體(14vhh)和7個biotin分子分子。
17、優選地，步驟二中，所述平衡緩沖液中各組分及其濃度為：2mmol/l?kh2po4，8mmol/l?na2hpo4，136mmol/l?nacl，2.6mmol/l?kcl，1mmol/l苯甲磺酰氟。
18、優選地，步驟二中，所述誘導溶液中氨芐的濃度為100μg/ml，iptg的濃度為1mm/l。
19、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
20、(1)本發明通過將vhh基因通過載體質粒轉化至大腸桿菌bl21感受態細胞中，進行細胞培養和細胞解離，離心收集上清液得到帶連接標簽spy-tag的納米抗體。
21、(2)本發明制備了一種可溶性七聚體骨架大分子蛋白，通過共價連接二聚體再構建七聚體并與snooptag-biotin結合可以引入可以連接14個vhh和7個biotin分子的大分子納米抗體展示平臺，從而促使納米抗體的可拼接模塊化，以便更加便捷的大規模應用。
22、(3)本發明制備的可溶性七聚體融合蛋白保留了抗原特異識別能力，又提高了單體vhh抗體的親和力，可溶性七聚體融合蛋白的c端還為分析信號擴大提供了更多的結合位點。
23、(4)本發明制備的一種裝載納米抗體的多聚體的蛋白質理論上可以顯示單抗體額外的6倍靈敏度，通過七聚體的結合可以提高親和力和放大信號，將該方法應用于新冠病毒的測定，可以作為快速檢測樣品中抗原的有力工具。