用于2-甲基異莰醇檢測的生物傳感器制備方法

本發明屬于生物傳感器，具體涉及一種用于2-甲基異莰醇檢測的生物傳感器制備方法。

背景技術：

1、2-甲基異莰醇是由藍綠藻等微生物產生的代謝產物，是飲用水中關鍵的土霉味物質，具有強烈的土腥味，能被人類嗅覺感知。2-甲基異莰醇的存在嚴重影響了飲用水的品質，關乎人類的健康與安全。

2、通常飲用水中2-甲基異莰醇的含量極低，是納克/升的水平，目前通常采用氣相色譜質譜（gc-ms）或三重四極氣相色譜串聯質譜（gc-ms/ms）結合液液萃取、固相微萃取等前處理技術進行測定。傳統的分析方法前處理相對復雜、檢測儀器龐大，難以滿足現場檢測的需求，尤其對突發的異味事件應對能力嚴重不足。電化學方法能夠將濃度信號轉化為易測量的電信號，實現對2-甲基異莰醇的檢測。并且電化學傳感器操作相對簡單，不需要復雜的樣品預處理步驟，易于在現場快速部署和使用。但是，2-甲基異莰醇本身缺乏電化學活性，難以在電極表面直接發生反應，難以達到2-甲基異莰醇極低的檢測閾值，這限制了電化學方法的應用。

3、針對2-甲基異莰醇的特征性氣味，生物傳感器能夠特異性地識別目標分子，從而提高檢測的選擇性。而過往的一些仿生傳感器研究中，以嗅覺組織或細胞作為敏感元件，存在維生條件苛刻、胞內干擾反應多和傳感器尺寸受限等缺陷；氣味結合蛋白則缺乏特異性，且對氣味分子的結合能力較弱。因此，亟需一種快速、靈敏且成本效益高的檢測飲用水中的2-甲基異莰醇的手段，提高水質監測的效率和準確性。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種工作電極表面修飾有含有嗅覺受體蛋白的納米囊泡，用于檢測2-甲基異莰醇的生物傳感器的制備方法。

2、本發明為實現上述目的所采取的技術方案為：

3、一種檢測2-甲基異莰醇的生物傳感器，包括：絲網印刷金電極，以及在絲網印刷金電極的工作電極表面上修飾載體膜層，載體膜層中含有納米囊泡，納米囊泡中含有嗅覺受體蛋白，嗅覺受體蛋白為or3a4蛋白；載體膜層中包括硝酸纖維素、氧化纖維素和2-羥乙基二茂鐵甲酸酯。硝酸纖維素、氧化纖維素和2-羥乙基二茂鐵甲酸酯共同形成穩定的膜狀結構，使得納米囊泡能夠均勻地分布在其中，并使得2-甲基異莰醇分子能夠以適當的速度擴散到or3a4蛋白所在的納米囊泡區域，同時促進電子轉移，實現電化學生物傳感器中信號的產生和放大，提高檢測的準確性和靈敏度。

4、本發明提供了一種檢測2-甲基異莰醇的生物傳感器的制備方法，將硝酸纖維素分散液與氧化纖維素分散液、2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液混合，滴加到絲網印刷金電極的工作電極表面上，然后再滴加納米囊泡溶液，靜置干燥后，得到檢測2-甲基異莰醇的生物傳感器。

5、優選地，硝酸纖維素以硝酸纖維素膜的面積進行計量，載體膜層中硝酸纖維素、氧化纖維素和2-羥乙基二茂鐵甲酸酯的面積質量比為2000-2500mm2:0.05-0.2g:1-5g。

6、優選地，納米囊泡中總蛋白與硝酸纖維素的質量面積比為3.75-5mg:2000-2500mm2。

7、優選地，硝酸纖維素分散液由硝酸纖維素膜分散于甲醇中得到，硝酸纖維素膜的孔徑為0.45-0.8μm，硝酸纖維素膜分散于甲醇中的面積體積之比為1-5mm2:5-50μl。

8、優選地，氧化纖維素分散液由氧化纖維素分散于去離子水中得到，氧化纖維素與去離子水的質量體積比為0.5-2g:10-100ml。

9、優選地，2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液由2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶于甲醇中得到，2-羥乙基二茂鐵甲酸酯與甲醇的質量體積比為1-5g:10-100ml。

10、優選地，硝酸纖維素分散液、氧化纖維素分散液與2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液體積比為1-10:1-10:1-10。

11、優選地，硝酸纖維素分散液與納米囊泡溶液體積比為2-10:7.5-37.5。

12、優選地，所述納米囊泡溶液與絲網印刷金電極的工作電極體積面積比為7.5-37.5μl:10-50mm2。

13、更優選地，檢測2-甲基異莰醇的生物傳感器中載體膜層的制備中可以加入聚乙烯醇，硝酸纖維素、聚乙烯醇、氧化纖維素與2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液面積質量比為2000-2500mm2:0.05-0.2g:0.05-0.2g:1-5g。聚乙烯醇的加入，在載體膜層的共同作用下，納米囊泡能夠在工作電極表面均勻分布并保持相對固定的位置，使得生物傳感器更好地與生物體內的環境相適應，減少對細胞的不良影響，生物傳感器的生物相容性和穩定性均有所提升。

14、本發明還提供了一種嗅覺受體細胞納米囊泡的制備方法，包括：

15、選用or3a4作為2-甲基異莰醇的人類嗅覺受體，根據嗅覺受體數據庫（olfactoryreceptor?database）中的基因序列信息，化學法合成or3a4基因，將or3a4基因克隆到哺乳動物真核表達載體pci的酶切位點mlui與noti之間，在pci載體的nhei和ecori酶切位點之間插入2個融合表達標簽，flag-tag和人類視紫紅質rhodopsin的前20個氨基酸（rho-tag），獲得嗅覺受體表達質粒；

16、選取生長狀態良好的hek-293t細胞，用脂質體轉染法將質粒導入細胞以表達嗅覺受體蛋白，質粒轉染12-36h后，在含有細胞松弛素b的無血清dmem培養基中，用hek293t細胞在36-37℃、4-5%co2條件下孵育20-40min，混合液離心去除剩余細胞，取上清液離心獲得納米囊泡沉淀，用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的pbs重懸，獲得嗅覺受體細胞納米囊泡。用qubit儀定量測定納米囊泡中的嗅覺受體蛋白濃度，用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的pbs稀釋至工作濃度10-100μg/ml。

17、優選地，細胞松弛素b與無血清dmem培養基的質量體積比為1-10mg:100-500?ml。

18、優選地，含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的pbs中蛋白酶抑制劑雞尾酒與pbs的體積比為1-2ml:100-200ml。

19、優選地，混合液離心轉速為300-700×g，時長為5-15min；上清液離心轉速為13000-17000×g，時長為20-40min。

20、本發明還提供了一種2-羥乙基二茂鐵甲酸酯的制備方法，包括：

21、將二茂鐵甲酸溶于四氯化碳，在氮氣保護下攪拌溶解，持續通氮氣20-40min，將反應體系密封后加入草酰氯，室溫攪拌反應6-10h，旋蒸除去四氯化碳溶劑和未反應的草酰氯，獲得二茂鐵甲酰氯；

22、將乙二醇和二氯甲烷混合溶解，加入三乙胺，在氮氣保護下置于冰水混合浴中攪拌反應15-45min，將二茂鐵甲酰氯溶于二氯甲烷中并加入反應體系，移除冰水浴，室溫攪拌反應12-36h，用飽和食鹽水洗滌，旋蒸除去剩余溶劑，得到2-羥乙基二茂鐵甲酸酯。

23、優選地，二茂鐵甲酸與四氯化碳的質量體積比為1-5g:20-100ml。

24、優選地，二茂鐵甲酸與草酰氯的質量體積比為1-5g:1-5ml。

25、優選地，乙二醇與二氯甲烷的質量體積比為1-5g:10-50ml。

26、優選地，乙二醇與三乙胺的質量體積比為1-5g:0.5-2.5ml。

27、優選地，乙二醇與二茂鐵甲酰氯的質量比為1-5:4-20。

28、優選地，二茂鐵甲酰氯與二氯甲烷的質量體積比為4-20g:10-50ml。

29、本發明還提供了一種氧化纖維素漿料的制備方法，包括：

30、將微晶纖維素分散于含有2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（tempo）和溴化鈉溶液中，加入次氯酸鈉，調節ph至9.8-10.2，加熱至35-45℃浸泡2-4h，用去離子水清洗經tempo氧化的纖維素；將tempo氧化的纖維素重新分散于去離子水中，超聲波細胞粉碎機處理，得到氧化纖維素漿料。

31、優選地，微晶纖維素、tempo與溴化鈉的質量比為1-10:0.016-0.16:0.1-1。

32、優選地，微晶纖維素與次氯酸鈉的質量比為1-10:0.74-7.4。

33、優選地，tempo氧化的纖維素與去離子水的質量體積比為1-10g:10-100ml。

34、優選地，超聲波細胞粉碎機功率為300w，處理10-20min。

35、本發明還提供了一種生物傳感器的制備方法，包括：

36、將硝酸纖維素膜分散于甲醇中溶解得到硝酸纖維素分散液；將2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶解于甲醇中，得到2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液；將氧化纖維素漿料分散于去離子水中，75-85℃加熱攪拌直至完全分散，形成均勻溶液；將硝酸纖維素分散液、氧化纖維素分散液與羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液混合，調節ph值至7.0-7.2，室溫下攪拌得到混合液；滴加混合液到絲網印刷金電極表面的工作電極上，室溫靜置至甲醇與水揮發晾干；將含有嗅覺受體蛋白的納米囊泡溶液滴加在金電極表面；將修飾后的微電極置于室溫下靜置1-3h，得到生物傳感器。

37、優選地，硝酸纖維素膜的孔徑為0.45-0.8μm，硝酸纖維素膜分散于甲醇中的面積體積比為1-5mm2:5-50μl。

38、優選地，2-羥乙基二茂鐵甲酸酯與甲醇的質量體積比為1-5g:10-100ml。

39、優選地，氧化纖維素漿料與去離子水的質量體積比為0.5-2g:10-100ml。

40、優選地，硝酸纖維素分散液、氧化纖維素分散液與2-羥乙基二茂鐵甲酸酯溶液體積比為1-10:1-10:1-10。

41、優選地，硝酸纖維素分散液與納米囊泡溶液體積比為2-10:7.5-37.5。

42、優選地，所述納米囊泡溶液與絲網印刷金電極的工作電極體積面積比為7.5-37.5μl:10-50mm2。

43、本發明公開了上述方法制備得到的生物傳感器。

44、本發明由于構建了一種能夠高效表達對2-甲基異莰醇具有特異性識別能力的嗅覺受體蛋白的異源表達體系，提供了一種嗅覺受體細胞納米囊泡的制備方法。對于生物傳感器進行了2-羥乙基二茂鐵甲酸酯、氧化纖維素與聚乙烯醇修飾，因而具有如下有益效果：載體膜層為含有嗅覺受體的納米囊泡提供了穩定的固定環境并促進電子的轉移，生物傳感器的生物相容性和穩定性增加。因此，本發明是一種電信號強的生物傳感器及其制備方法。