基于納米粒子放大技術檢測p53蛋白生物傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物傳感器的研制領域，具體涉及一種基于納米粒子放大技術檢測P53蛋白生物傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002]石英晶體微天平技術，是20世紀60年代建立起來的一種新型傳感器測量技術，主要是利用了石英晶振對質量的敏感性，通過監測石英晶振表面吸附待測物質后諧振頻率的變化來檢測待測物。QCM最大的特點是能夠對實驗所用的芯片進行適合隨意的特異性修飾，它自上世紀六七十年代誕生以來已被廣泛應用于分子生物學、免疫學、遺傳學、環境科學以及其他一些涉及到質量、密度、濃度等檢測領域。QCM這類傳感器具有響應靈敏、選擇性良好、便于實現自動化等優點，并且儀器簡單、操作方便，因此引起了各國家科學家的濃厚興趣，成為當今傳感器領域的研宄熱點之一。
[0003]納米材料是納米技術的一個重要的方面，它是指在大約0.1-1OOnm范圍內，物質的性能發生突變，表現出新的特殊性質。若其沒有特殊性質，也不是納米材料。納米材料具有量子尺寸效應、表面與界面效應、小尺寸效應、宏觀量子隧道效應，使其具有不同于常規粗晶材料所沒有的一系列獨特的性能。同時，納米材料的的組成成分對其適用性也具有重要的影響，它能夠影響被檢測物質的范圍及檢測的靈敏性等方面。隨著納米技術及生物技術的不斷發展，納米金粒子引起了科學界的廣泛關注，在診斷和修復以及治療等方面都可以看到金納米粒子的應用，這是由納米金粒子良好的生物相容性以及無毒性所決定的。目前，納米金粒子可以與蛋白質，DNA，酶，以及生物素等生物體相結合，納米金粒子在生物傳感器，DNA識別與檢測，基因治療，免疫分析檢測等方面具有巨大的應用前景。
[0004]生物傳感器是一種將酶、抗體等對生物體功能有響應的最小單體引入電極，以此來對目標檢測物進行分析檢測的檢測器，具有專一、快速、靈敏、準確等優點，已廣泛應用于臨床檢測、環境檢測和生化分析等領域。其中電流型酶傳感器研宄最多的一種類型。Arnold等將谷氨酸氧化酶固載于Naf1n修飾的鉑電極上，制成了對谷氨酸敏感的生物傳感器，檢測限為0.3 ymol/L，線性范圍高達800 ymol/L。選擇性明顯提高，有效消除了來自抗壞血酸、尿酸和乙酰氨基酚等雜質的干擾。
【發明內容】
[0005]本發明研制了一種新穎的基于納米金粒子質量放大石英晶體微天平(QCM)的頻移信號，檢測腫瘤標記物P53蛋白的新方法。該方法將P53蛋白第一抗體先固定在芯片上，對金納米粒子分別修飾共識雙鏈DNA和P53蛋白第二抗體，通過共識雙鏈DNA以及抗體抗原特異性免疫反應分別對野生型P53蛋白以及混合型P53蛋白進行識別檢測，將能放大QCM頻移信號的金納米粒子固定在QCM芯片上，實現對P53蛋白的檢測，具有較高的靈敏度和良好的選擇性。在最佳實驗條件下，對P53蛋白的檢測限為0.lpg.mL-’。此方法靈敏度高，選擇性好，就有廣泛的應用前景。
[0006]本發明所提供的方法包括以下步驟:
[0007](I)制備還原性金納米粒子，
[0008]所述的方法，其所述的還原劑為檸檬酸三納。
[0009]所述的方法，其所述的金納米粒子形狀為球型，粒徑約為24納米。
[0010](2)將所制備的金納米粒子與捕獲DNA混合，二者通過金-硫鍵固定結合，然后將此復合物與捕獲DNA互補鏈混合，兩條DNA鏈完全互補結合形成穩定結構的納米生物探針，最后產物用磷酸緩沖溶液清洗干凈。
[0011](3)用試劑氫氧化鈉將制備的金納米粒子溶液調節至堿性，然后與P53蛋白第二抗體溶液混合溫育反應，反應產物用磷酸緩沖溶液清洗干凈。
[0012]所述的方法，其所述的堿性金納米粒子溶液pH值為9.2。
[0013](4)將在石英晶體微天平儀器測試過程中使用的金片浸入雙氧水，氨水和去離子水的混合溶液中處理，然后用去離子水沖洗干凈之后放置在儀器當中，持續不斷的通入巰基乙胺溶液，然后用磷酸緩沖溶液沖洗掉沒有接在金表面的的巰基乙胺，再持續不斷的通入P53蛋白第一抗體溶液，最后用磷酸緩沖溶液沖洗掉沒有固定在金制傳感器表面的P53蛋白第一抗體。
[0014]所述的方法，其所述的雙氧水，氨水和去離子水混合液的體積比為1:1:5。
[0015]所述的方法，其所述的巰基乙胺中的活性基團巰基的作用與金片表面作用形成化學鍵，再由巰基乙胺去連接P53蛋白，以便達到更好的效果，巰基乙胺的濃度為0.15M/L。
[0016](5)將野生型P53蛋白緩慢持續通入制備的金制傳感器表面，P53蛋白會固定在其表面，然后用磷酸緩沖溶液沖洗掉未固載在金制傳感器表面的P53蛋白，再將步驟(2)中的生物探針持續緩慢通過金制傳感器表面，記錄數據。
[0017]所述的方法，其所述的P53蛋白第一抗體、P53蛋白、互補雙鏈雙鏈DNA、金納米粒子對金片載體表面層層修飾，形成的復合結構會逐步增大石英晶體微天平信號值，據此實現對目標檢測物的檢測。
[0018](6)將野生型與突變型P53蛋白混合液持續緩慢通過金制傳感器的表面，兩種P53蛋白會固定在其表面，然后用磷酸緩沖溶液沖洗掉未固載在金制傳感器表面的P53蛋白，再將步驟(3)中產物持續緩慢通過金制傳感器表面，記錄數據。
[0019]所述的方法，其所述的P53蛋白第一抗體、P53蛋白、P53蛋白第二抗體、金納米粒子對金片載體表面層層修飾，形成的復合結構會逐步增大石英晶體微天平信號值，據此實現對目標檢測物的檢測。
[0020]所述的方法，其所述的利用步驟(5)和￠)中分別測取野生型P53蛋白和混合型蛋白標準樣品所得線性關系，據此實現對突變型P53蛋白目標檢測物的檢測。
[0021]所述的方法，其所述的傳感器載體為金制薄片，厚度約為lOOnm。
【附圖說明】
[0022]附圖1為發明設計過程原理圖。圖1(a):1、傳感器金片修飾P53蛋白第一抗體；2、在傳感器金片上P53蛋白第一抗體與野生型P53蛋白結合，P53蛋白固載至傳感器金片上；
3、經互補雙鏈DNA修飾過的金納米粒子被P53蛋白捕獲結合在傳感器金片表面。圖1(b):1、傳感器金片修飾P53蛋白第一抗體；2、在傳感器金片上P53蛋白第一抗體與混合型P53蛋白結合，P53蛋白固載至傳感器金片上；3、經P53蛋白第二抗體修飾過的金納米粒子被P53蛋白捕獲結合在傳感器金片表面。
[0023]附圖2為金納米粒子對本發明所帶來的信號放大效果圖。a、QCM信號基線；b、單純的野生型P53蛋白在QCM上產生的信號；c、經金納米粒子信號放大之后在QCM上產生的信號。
[0024]附圖3為不同濃度野生型P53蛋白檢測物在QCM上產生的信號以及其線性工作曲線。線性回歸方程為AF = 677.8-50.141gC(pg mL_l) (R = 0.9979)，使用3 σ法得到的檢測限為0.lpg/mL。附圖4為不同濃度混合型P53蛋白檢測物在QCM上產生的信號以及其線性工作曲線。線性回歸方程為AF = 710.1-52.851gC(pg mL—1) (R = 0.9991)，使用3 σ法得到的檢測限為0.lpg/mL。
[0025]附圖5為該發明方法對于實際樣品的檢測效果圖。普通細胞勻漿液中野生型P53蛋白與混合型P53蛋白相比數量變化不大，而人類乳腺癌細胞勻漿液中野生型P53蛋白與混合型P53蛋白相比數量變化很大，說明癌細胞中含有大量突變型P53蛋白。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。實施例1
[0027]納米多孔金片電極電化學免疫傳感器檢測巰基乙酸(見圖1)
[0028]—、經互補雙鏈DNA修飾的金納米粒子生物探針的制備。
[0029](I)金納米粒子的制備
[0030]納米金粒子的合成是通過檸檬酸三鈉還原四氯金酸制備而成。具體制備方