一種彩色超分辨成像裝置及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及顯微成像技術領域，尤其涉及一種彩色超分辨成像裝置及方法。
【背景技術】
[0002] 當前，在結構光照明技術中，為了實現超分辨顯微成像，需要對待測樣品進行多次 的圖像采集，并在采集之后進行復雜的圖像重建過程才能還原出待測樣品的超分辨圖像。 可見，傳統的超分辨顯微成像做法不僅耗時，而且多次采集也會進一步增加樣品光漂白的 幾率。
[0003] 而目前，出現了一種二次掃描超分辨顯微技術，它是一種新型的結構光照明超分 辨顯微技術，其基本原理可以如圖1所示。其中，二次掃描超分辨顯微系統中有兩套振鏡， 其中SMl的作用是對待測樣品面進行點掃描，使激發光分別激發待測樣品產生熒光信號。 而SM2的作用是對激發的熒光信號進行二次掃描。在圖1右側的B部分中，M值表征的意 Mh 義為系統對待測樣品的放大率Mcib,和對激發光斑放大率Mspcit的比值（即M = f )。當 lVI- Spot M = 1時，激發光從左往右依次掃過熒光團激發出熒光信號，由于兩個熒光分子距離較近， 導致其發出的熒光信號在空間上有部分的重疊，無法區分出兩個熒光分子。但是當M = 2 時，由于系統對樣品的放大率大于激發光斑的放大率，導致兩個熒光分子的像之間的距離 增加，使得系統能夠分辨出這兩個原本發光信號重疊的熒光分子，由此突破了系統的極限 分辨率。這種超分辨技術最大的優勢在于，它摒棄了傳統結構光照明技術中的多次激發和 后期復雜的數據重建，而是利用純光學的方式，僅通過一次信號采集即可實現超分辨顯微 成像。緊隨其后，Hari ShofT等人將雙光子與二次掃描技術相結合，進一步的提升了二次 掃描系統的信噪比和成像深度。另外，當前出現了將超分辨成像與熒光光譜成像相結合的 技術，在熒光光譜成像部分，其通過光纖光譜儀來采集每個圖像像素點上的光譜，最終通過 線性光譜解混，來實現對樣品中不同熒光物質的區分。
[0004] 然而，上述的二次掃描技術，雖然在圖像的分辨率上有所提高，但是無法在單次的 檢測中區別出發不同波長的熒光團。而將二次掃描技術與光纖光譜儀相結合的技術，雖然 能實現超分辨的光譜成像，但是成像光譜儀采用光纖光譜儀，系統整體的信號采集速率將 極大的受限于光譜儀CCD檢測器的采集和讀出速率，無法實現快速的信號采集。且若需要 大面積的成像，過長的采集時間將加大圖像中各個像素點之間的采集時間差，當系統應用 于活體成像時，將導致明顯的圖像失真。其次，使用光纖來收集熒光信號，不可避免的會因 為光纖耦合過程而造成信號的損失。若熒光團被激發時產生的熒光較弱，則CCD檢測器需 要更長的曝光時間來采集足夠的信號量，從而更進一步的增加了信號的采集時間。而通過 提高激發光的功率以增加熒光信號，但同時將造成熒光團光漂白幾率的增加。
[0005] 可見，當前的二次掃描超分辨顯微技術中，存在信號采集速率和效率較低的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的實施例提供一種彩色超分辨成像裝置及方法，以解決當前的二次掃描超 分辨顯微技術中，存在信號采集速率和效率較低的問題。
[0007] 為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] -種彩色超分辨成像裝置，用于對待測樣品進行顯微成像，所述裝置包括激光發 射器、第一二向色鏡、分光鏡、CCD相機以及三通道光電倍增管模塊；
[0009] 所述激光發射器發射激發光至所述第一二向色鏡，所述第一二向色鏡將所述激發 光反射至待測樣品上，以激發所述待測樣品的熒光團發出熒光，所述熒光具有熒光信號；所 述熒光信號經過所述第一二向色鏡到達所述分光鏡；所述分光鏡將所述熒光信號分為第一 束光路和第二束光路；所述第一束光路發射至所述CCD相機，采集超分辨圖像；所述第二束 光路發射至所述三通道光電倍增管模塊，分別采集紅顏色通道圖像、綠顏色通道圖像和藍 顏色通道圖像。
[0010] 具體的，所述三通道光電倍增管模塊包括：第二二向色鏡、第一濾光片、第一光電 倍增管、第三二向色鏡、第二濾光片、第二光電倍增管、第三濾光片、第三光電倍增管；
[0011] 所述第二束光路發射至所述第二二向色鏡分光出紅色熒光；所述紅色熒光經所述 第一濾光片進行濾光后，被所述第一光電倍增管采集，產生所述紅顏色通道圖像；
[0012] 所述第二束光路分光出紅色熒光的剩余部分光路發射至所述第三二向色鏡，分光 出藍色熒光和綠色熒光；所述藍色熒光經所述第二濾光片進行濾光后，被所述第二光電倍 增管采集，產生所述藍顏色通道圖像；所述綠色熒光經所述第三濾光片進行濾光后，被所述 第三光電倍增管采集，產生所述綠顏色通道圖像。
[0013] 具體的，所述第一濾光片為中心波長在692. 3nm至696. 3nm之間的窄帶濾光片；所 述第二濾光片為中心波長在428nm至432nm之間的窄帶濾光片；所述第三濾光片為中心波 長在541. 5nm至545. 5nm之間的窄帶濾光片。
[0014] 進一步的，所述裝置還包括在所述激光發射器和所述第一二向色鏡之間設置的衰 減片；所述激光發射器發射激發光至所述衰減片進行強度衰減，再發射到所述第一二向色 鏡處。
[0015] 進一步的，所述裝置還包括依次設置于所述第一二向色鏡和所述待測樣品之間的 激發振鏡、第一掃描透鏡、鏡筒透鏡和第一物鏡；
[0016] 經所述第一二向色鏡反射的激發光照射在所述激發振鏡上，經所述激發振鏡改變 方向后進入所述第一掃描透鏡、所述鏡筒透鏡和所述第一物鏡，到達所述待測樣品處；
[0017] 待測樣品的熒光團發出的熒光依次經過所述第一物鏡、鏡筒透鏡、第一掃描透鏡、 激發振鏡到達所述第一二向色鏡。
[0018] 進一步的，所述裝置還包括依次設置于所述第一二向色鏡和所述分光鏡之間的第 四濾光片、第二物鏡、針孔以及第三物鏡；
[0019] 所述熒光通過所述第一二向色鏡到達所述第四濾光片進行濾光，消除熒光中的雜 散信號，并保留熒光中的所述熒光信號；
[0020] 進行濾光后的所述熒光信號依次經過所述第二物鏡、針孔和第三物鏡，到達所述 分光鏡。
[0021] 進一步的，所述裝置還包括依次設置于所述分光鏡和所述C⑶相機之間的二次掃 描振鏡和第二掃描透鏡；
[0022] 所述第一束光路發射至所述二次掃描振鏡后，再經過所述第二掃描透鏡聚焦到所 述CCD相機處，以采集超分辨圖像。
[0023] 具體的，所述分光鏡為30:70分光鏡；所述30:70分光鏡將所述焚光信號分為第一 束光路和第二束光路；所述第一束光路為所述熒光信號的30%部分，所述第二束光路為所 述焚光信號的70%部分。
[0024] -種彩色超分辨成像方法，應用于上述的彩色超分辨成像裝置，所述方法包括：
[0025] 將激光發射器發射的激發光經過第一二向色鏡反射至待測樣品上，以激發待測樣 品的熒光團發出熒光；其中，所述熒光具有熒光信號；
[0026] 將所述熒光信號經過所述第一二向色鏡到達分光鏡；
[0027] 通過所述分光鏡將所述焚光信號分為第一束光路和第二束光路；
[0028] 將所述第一束光路發射至CCD相機，通過所述第一束光路采集超分辨圖像；
[0029] 將所述第二束光路發射至三通道光電倍增管模塊，通過所述第二束光路分別采集 紅顏色通道圖像、綠顏色通道圖像和藍顏色通道圖像；
[0030] 將所述紅顏色通道圖像、綠顏色通道圖像和藍顏色通道圖像分別與所述超分辨圖 像進行矩陣點乘，分別生成紅顏色超分辨圖像、綠顏色超分辨圖像和藍顏色超分辨圖像；
[0031] 將所述紅顏色超分辨圖像、綠顏色超分辨圖像和藍顏色超分辨圖像經過矩陣相加 運算，生成彩色超分辨圖像。
[0032] 具體的，所述將所述第二束光路發射至三通道光電倍增管模塊，通過所述第二束 光路分別采集紅顏色通道圖像、綠顏色通道圖像和藍顏色通道圖像，包括：
[0033] 將所述第二束光路發射至第二二向色鏡分光出紅色熒光，并將所述紅色熒光經過 第一濾光片進行濾光，再由第一光電倍增管采集，產生所述紅顏色通道圖像；
[0034] 將所述第二束光路分光出紅色熒光的剩余部分光路發射至第三二向色鏡，分光出 藍色熒光和綠色熒光；
[0035] 將所述藍色熒光經過第二濾光片進行濾光，再由第二光電倍增管采集，產生所述 藍顏色通道圖像；
[0036] 將所述綠色熒光經過第三濾光片進行濾光，再由第三光電倍增管采集，產生所述 綠顏色通道圖像。
[0037] 本發明實施例提供的一種彩色超分辨成像裝置及方法，通過將待測樣品發出的熒 光信號分為兩束光路，并分別發射到CCD相機和三通道光電倍增管模塊處，從而能夠通過 三通