一種甲胎蛋白異質體的檢測方法、檢測試劑和檢測試劑盒的制作方法

一種甲胎蛋白異質體的檢測方法、檢測試劑和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種甲胎蛋白異質體的檢測方法、所用試劑和檢測試劑盒，本發明的檢測方法包括以下步驟：步驟1，表面偶聯抗AFP-L3抗體的磁微粒A的制備，和表面偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B的制備；步驟2，熒光標記的抗AFP-L3抗體的制備；步驟3，AFP-L3含量的檢測：血漿或血清樣品和磁微粒A反應，反應完畢將AFP-L3洗脫，加入熒光標記的抗AFP-L3抗體孵育，再加入磁微粒B繼續孵育，然后磁性分離，用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，計算樣品中AFP-L3含量。
【專利說明】
一種甲胎蛋白異質體的檢測方法、檢測試劑和檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種醫學檢測方法，特別涉及一種AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測方法、 以及AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑和檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 原發性肝細胞癌(HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順 位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位，在部分地區的農村中則占第二位，僅次于胃癌。我國 是乙肝大國，大約有1.2億乙肝病毒攜帶者，每年有13萬患者死于肝癌，占全世界肝癌死亡 人數的45%。肝細胞癌大部分基于長期乙肝病毒導致的慢性肝炎、肝硬化。
[0003] 與其他腫瘤普查一樣，肝癌防治主要在于"三早"，即早期發現、早期診斷和早期治 療。早期肝癌，除非位置特殊，治療上多無太大困難，切除、栓塞、消融及肝移植等方法皆能 奏效，如得到科學治療，5年生存率在50~70%以上，大部分患者可以長期存活。然而中晚期 肝癌通常伴有肝內外的轉移，手術無法切除，也無法實施肝移植，介入栓塞治療效果欠佳， 藥物治療也難有顯效，手術并發癥多，療效差，生存期短，一般發病后生存時間僅為6個月。
[0004] 臨床肝癌療效不盡如人意的最主要原因是臨床確診時已近晚期，因此對于肝癌， 在亞臨床階段即可得出診斷非常重要。目前甲胎蛋白（AFP)已經被廣泛應用于臨床診斷。盡 管AFP在很多的臨床疾病中都有相應的升高，但它主要是作為臨床診斷HCC的腫瘤標志物， 其血清濃度可能與HCC的分化程度及腫瘤的大小相關。在高危人群中，15~58%的慢性肝炎 患者和11~47%的肝硬化患者其血清中的AFP都會有所升高，臨床上將ALT不升高，AFP升高 作為肝細胞再生的指標。HCC和肝病患者血清中AFP均有升高，致使對AFP檢測結果的解釋產 生混淆。從臨床經驗角度觀察，AFP對HCC可疑患者(尤其是在高危人群中）的篩查是有效的， 然而AFP特異性不足限制了 HCC早期診斷的價值。
[0005] AFP是一種糖蛋白，根據糖蛋白形式分三類:AFP-LUAFP-I^AFP-I^AFP-Ll主要 存在于良性肝病中，AFP-L2來自孕婦，AFP-L3是肝癌細胞所特有，可以作為檢測HCC的一個 新的腫瘤標志物。
[0006] 研究表明，表達AFP-L3的肝癌細胞有早期血管浸潤和肝內轉移的傾向，在經過染 色后通常在胞核中可發現Ki67,其為肝細胞惡變的一個標志物。如果α-連環蛋白缺失，那么 HCC常常有肝外的轉移。影像學研究發現AFP-L3陽性的HCC通常有豐富的肝動脈血液供給， 腫瘤的倍增時間較短，提示AFP-L3陽性的HCC進程較快且容易發生早期轉移。研究表明，若 直徑小于2cm的HCC患者血清中AFP-L3占總AFP的10%以上，那么提示此腫瘤具有攻擊性癌 變。在良性的肝臟慢性疾病中，肝細胞不表達AFP-L3，因此AFP-L3的含量越高提示腫瘤的惡 性程度越高。大量研究結果顯示，AFP-L3與其組織器官來源有關，不同生理和病理狀況可產 生不同的糖鏈結構，具有相關腫瘤特異性;其單獨或與其他腫瘤指標的聯合應用，對于HCC 的診斷療效和預后判斷具有重要意義。
[0007] 常彬霞等報道稱表達AFP-L3的細胞有早期血管侵襲和肝內轉移的傾向，約35%的 直徑<2cm的小肝癌病灶患者可出現AFP-L3的升高(常彬霞，辛邵杰.甲胎蛋白及其臨床應用 研究進展.世界華人消化雜志，2010; 18:576-580)。食品藥品監督管理局于2005年批準將該 指標應用于肝癌診斷，并把AFP-L3診斷肝癌的陽性界定值為lO^^AFP-LS在早期肝癌的預 警方面也具有顯著作用，研究表明其在肝癌術后預后判斷具有重要的臨床意義(Taketa K， Ichikawa E,Sakuda H,et al.Lectin reactivity of alpha-fetoprotein in a case of renal cell carcinoma.Tumour Biol，1989;10:275_280)(王壽明，高蕾，于樂成，何長倫. 甲胎蛋白異質體對肝癌診斷及療效評估價值研究進展.實用肝臟病雜志，2011; 14: 479-481)(陳燕，林鶯鶯，胡敏華，陳巖松.甲胎蛋白異質體在肝癌早期診斷和預警作用研究.現 代腫瘤醫學，2012; 20:1652-1654)。由于AFP-L3來源于肝癌細胞的分泌，因此隨著腫瘤直徑 的增加，其分泌到血中的AFP-L3含量也隨之增多（李賓，劉志偉，劉艷芬，等.原發性肝癌患 者術后甲胎蛋白異質體的變化及臨床意義.貴陽中醫藥學報，2014; 36: 52-54)。研究表明， AFP-L3多10%作為肝癌的診斷標準敏感性為82.6%，與慢性肝病鑒別診斷的特異性為 76.8%，肝癌患者的AFP-L3均值及陽性率均高于肝硬化組和慢性肝炎組，差別具有統計學 意義，提示檢測AFP-L3有助于鑒別原發性肝癌與非原發性肝癌患者。尤其在甲胎蛋白低濃 度組AFP〈400ng/ml，AFP-L3彡10%為鑒別診斷指標時，肝癌與良性肝病可得到明顯區分(熊 彪，蔡其浩，蒙凱.三項生化指標聯合甲胎蛋白診斷原發性肝癌的研究.當代醫學，2008; 14 (14): 37-38) jae等指出，AFP-L3含量的測定有助于肝臟良惡性疾病的鑒別診斷。AFP-L3在 良性慢性肝病患者很低，而在肝細胞癌(HCC)患者很高。另一方面，AFP-L3含量升高的患者， 其HCC發生率也顯著高于AFP升高的患者（BAE JS，PARK SJ，PARK KB，et al.Acute exacerbation of hepatitis in liver cirrhosis with very high levels of alpha-fetoprotein but no occurrence of hepatocellular carcinoma.Korean J Intern Med，2005; 20( 1): 80-85)。血清AFP含量介于 10~200ng/mL的患者，AFP-L3> 10%對HCC診斷 的敏感度為71 %，特異度為63 % (王永忠，羅立波，吳國祥，等.微量離心柱法分離檢測甲胎 蛋白異質體(AFP-L3)及其臨床意義.中華實驗和臨床病毒學雜志，2007;21(2) :135-137)。 AFP-L3>35%對HCC診斷的敏感度為35%，特異度可達100%(STERLINGRK，IEFFERSL， GORDON F,et al.Utility of Lens culinaris agglutinin-reactive fraction of alpha-fetoprotein and des-gamma-carboxy prothrombin,alone or in combination, as biomarkers for hepatocellular carcinoma.Cl in Gastroenterol Hepatol,2009；7 (1): 104-113)。臨床一般以AFP-L3占 AFP總水平的15%作為判斷HCC的臨界值，從而取得較 好的特異度與敏感度性之間的平衡（LEERAPUN A，SURAVARAPU SV，B IDA JP，et al.The utility of Lens culinaris agglutinin2 reactive alpha2-fetoprotein in the diagnosis of hepatocellular carcinoma:evaluation in a United States refrral population.Clin Gastroenterol Hepatol，2007;5(3) :394-402)。國內外研究表明，AFP-L3是肝癌高度特異性指標，比單純檢查總AFP能顯著提高準確率，可以不受AFP多400ng標準 的限制。但是由于AFP-L3與AFP的差異只存在于糖鏈上，長期以來AFP-L3指標無法在臨床常 規使用，因此，研究用新方法檢測AFP-L3十分有必要(青柳璺.腫瘤標志物的臨床診斷意義 及展望一甲胎蛋白（厶卩？）1^3組分.日本醫學介紹，2005;26:49-50)(!11]印，1^111 〇 NL.Clinical significance of elevated alpha-fetoprotein(AFP)in patients with chronic hepatitis C,but not hepatocellular carcinoma.Am J Gastroenterol,2004； 99:860-865)〇
[0008] AFP-L3對疾病的診斷價值是肯定的，但是一些常規的檢測方法缺乏足夠的敏感 性，導致檢測結果不準確。臨床常用免疫分析法檢測AFP-L3的含量，利用抗原抗體特異性結 合反應進行檢測，免疫標記技術進行結果判定，將熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體 (或抗原)進行抗原-抗體反應，通過對免疫復合物中的標記物的檢測，達到對免疫反應進行 監測的目的。常用的免疫分析標記技術包括酶免疫分析、放射免疫分析、熒光酶免疫分析、 膠體金免疫技術、發光免疫技術等。其中酶免疫分析靈敏度較低且操作復雜;放射免疫分析 靈敏精確、樣本用量少，但檢測有效期較短且具有放射性污染;膠體金免疫技術標記物的制 備簡便，靈敏直觀，但同時受影響因素較多；發光免疫技術檢測步驟較復雜，本底較高且結 果不穩走。
[0009] 現有技術中，磁微粒化學發光免疫分析技術綜合了磁微粒載體技術和化學發光免 疫檢測技術，使測量結果更準確，更穩定。該技術包括：
[0010] 磁微粒化學發光--雙抗體夾心法:待測抗原同熒光素標記的抗體及酶標抗體結合 形成"三明治"結構的復合物。隨后加入連有抗熒光素抗體的磁微粒，通過抗熒光素抗體與 熒光素的特異性結合使抗原抗體復合物連接在磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，將免疫 反應形成的復合物與未結合的其它物質分離。去上清后清洗沉淀的復合物，加入酶促化學 發光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到 基態時便發出光子，形成發光反應，通過光量子閱讀系統記錄光子能量，并通過計算機處理 系統將光能量強度在標準曲線上轉換為待測抗原的濃度，并報告結果。
[0011] 磁微粒化學發光一競爭法:將待測抗原、用過量包被磁微粒的抗體和定量的標記 抗原同時加入反應杯溫育，其免疫反應的結合形式有兩種，一是標記抗原與抗體結合形成 復合物;二是待測抗原與抗體結合形成復合物。如待測標本中含有待測抗原，則與標記抗原 以同樣的機會與磁微粒包被的抗體結合，競爭性地占去了標記抗原與磁微粒包被的抗體結 合的機會，使標記抗原與磁微粒包被的抗體的結合量減少。由于磁微粒包被的抗體是過量 的，足以與待測抗原結合。磁微粒在外加磁場中直接沉淀，將免疫反應形成的復合物與未結 合的其它物質分離。去上清后清洗沉淀的復合物，加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下 被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時便發出光子，形成發 光反應，通過光量子閱讀系統記錄光子能量，并通過計算機處理系統將光能量強度在標準 曲線上轉換為待測抗原的濃度，并報告結果。
[0012] 磁微粒化學發光一間接法:待測抗體與熒光素標記的抗原結合，隨后加入包被著 抗熒光素抗體的磁微粒，通過抗熒光素抗體與熒光素的特異性結合使抗原抗體復合物連接 在磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，去上清后清洗沉淀的復合物，加入酶標抗體，形成磁 微粒一抗原一抗體一酶標二抗夾心免疫復合物。再次清洗后，加入酶促化學發光底物。底物 在酶作用下被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時便發出 光子，形成發光反應，通過光量子閱讀系統記錄光子能量，并通過計算機處理系統將光能量 強度在標準曲線上轉換為待測抗體的濃度，并報告結果。
[0013] 但上述技術存在一些缺陷：如：
[0014] 間斷的、閃爍性發光不穩定，
[0015] 反應過程中易發生裂變，結果不穩定，
[0016] 以微孔板為載體，測試成本高、時間長，
[0017] 需對結合相、游離相進行分離，操作步驟多，
[0018] 瞬間產生的化學發光峰值很快衰減，
[0019] 本底較高，干擾妨礙應用，
[0020] 不易自動化等。
[0021 ]基于以上不足，本發明建立了一種AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測方法，使用磁微粒A 與AFP-L3特異性結合的抗體偶聯，使用熒光素標記該抗體作為檢測抗體，再使用偶聯AFP-L3的磁微粒B清除過量的檢測抗體，通過檢測熒光強度計算目標檢測物AFP-L3的含量，實現 對AFP-L3含量的簡便快速、靈敏準確的檢測。

【發明內容】

[0022]本發明提供一種檢測血漿或血清中AFP-L3含量的方法:所述方法包括以下步驟： [0023]步驟1，表面偶聯抗AFP-L3抗體的磁微粒A的制備，和表面偶聯AFP-L3抗原的磁微 粒B的制備；
[0024]步驟2，熒光標記的抗AFP-L3抗體的制備；
[0025]步驟3，AFP-L3含量的檢測:血漿或血清樣品和磁微粒A反應，反應完畢將AFP-L3洗 脫，加入熒光標記的抗AFP-L3抗體孵育，再加入磁微粒B繼續孵育，然后磁性分離，用熒光分 光光度計檢測樣品熒光值，計算樣品中AFP-L3含量；
[0026] 其中所述AFP-L3為甲胎蛋白異質體(Alpha-fetoprotein_L3)。
[0027] 本發明所述的方法，其中所述磁微粒A和磁微粒B的制備，方法如下:將磁微粒制備 成磁微粒懸浮液，磁微粒懸浮液與抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原偶聯：將抗AFP-L3抗體或 AFP-L3抗原與磁微粒懸浮液混合孵育偶聯，偶聯后用封閉液封閉，得到偶聯AFP-L3抗體的 磁微粒A和偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B。
[0028] 本發明所述的方法，其中，所述與AFP-L3特異性結合的抗體是單克隆抗體或多克 隆抗體。
[0029] 本發明所述的方法，其中，磁微粒與AFP-L3抗原的偶聯條件選自如下條件：
[0030] 磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20yg/mL、22°C孵育2h、pH=ll;
[0031] 磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10;
[0032] 磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH=ll;
[0033] 磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、pH= 10;
[0034] 磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=ll;
[0035] 或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=10;本發明所述的方 法，其中，磁微粒與抗AFP-L3抗體的偶聯條件選自如下條件：
[0036] 磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20yg/mL、22°C孵育2h、pH=ll;
[0037] 磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10;
[0038] 磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH=ll;
[0039] 磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、pH= 10;
[0040] 磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=ll;
[00411 或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30yg/mL、28 °C孵育6h、pH = 10。本發明所述的方 法，步驟如下：
[0042]步驟（1)取磁微粒，加入磁微粒體積2~50倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在磁力架上 磁性分離，棄上清液;重復上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯緩沖液中懸浮，得到 磁微粒懸浮液；
[0043] 步驟(2)向抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原中加入體積0.01~1倍的步驟（1)處理的磁 微粒懸浮液，加入偶聯緩沖液，孵育，直至磁微粒偶聯完全;磁性分離，保留磁微粒;磁微粒 偶聯結束后，加入封閉液，混勻，孵育磁性分離，得到偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A和偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B;
[0044] 步驟(3)熒光標記的抗AFP-L3抗體的制備:抗AFP-L3抗體溶解于碳酸鹽緩沖液中， 熒光素溶解于DMS0中，將熒光素逐滴緩慢加入抗AFP-L3抗體溶液中，4°C避光攪拌12~20h， 用G-25葡聚糖凝膠去除游離的熒光素；
[0045] 步驟(4)取待測樣品，加入樣品體積1~100倍的磁微粒A，于室溫旋轉孵育2~6h或 者4 °C孵育12~20h，使AFP-L3抗原抗體充分反應;置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗 滌緩沖液清洗磁微粒復合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液;加入與抗體等量的洗脫 液，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液;加入樣品體積1 ~100倍的熒光標記AFP-L3抗體，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;加入磁微粒A 體積1~100倍的磁微粒B，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;置于磁力架上磁性 分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中AFP-L3含量。
[0046] 本發明所述的方法，優選的步驟如下：
[0047] (5)取磁微粒置于EP管中，加入磁微粒體積10~20倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在 磁力架上磁性分離，棄上清液;重復上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯緩沖液中懸 浮，得到磁微粒懸浮液；
[0048] (6)加入磁微粒懸浮液體積0.2~0.3倍的需偶聯的抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原于 盛有磁微粒磁微粒懸浮液的EP管中，并加入磁微粒懸浮液體積10倍的偶聯緩沖液，混勻;將 EP管置于旋轉混合儀上室溫孵育2~6h或者4°C孵育12~20h，直至磁微粒偶聯完全;將EP管 置于磁力架上磁性分離，保留磁微粒;表面偶聯抗AFP-L3抗體的為磁微粒A，表面偶聯AFP-L3抗原的為磁微粒B，上清液用于檢測偶聯效率；
[0049] (7)磁微粒偶聯結束后，加入磁微粒懸浮液體積10倍的封閉液，混勻，將EP管置于 旋轉混合儀上室溫孵育2~6h或者4°C孵育12~20h，將EP管置于磁力架上磁性分離，棄上清 液;重復上一步驟一次；
[0050] (8)取待測血漿或血清樣品，加入樣品體積1~100倍的磁微粒A，于室溫旋轉孵育2 ~6h或者4 °C孵育12~20h，使AFP-L3抗原抗體充分反應;置于磁力架上磁性分離，棄上清 液，用洗滌緩沖液清洗磁微粒復合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液;加入與抗體等量 的洗脫液，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液;加入樣 品體積1~100倍的熒光標記AFP-L3抗體，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;加入 磁微粒A體積1~100倍的磁微粒B，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;置于磁力架 上磁性分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品 中AFP-L3含量。
[0051]本發明所述的方法，其中，
[0052]偶聯緩沖液選自：碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一種或多種的 組合，濃度為1~100mM，pH為8.0~10.0;
[0053]洗滌緩沖液選自：甘氨酸緩沖液、Tri s-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、 碳酸鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為2~200mM，pH為7.0~8.0;
[0054] 洗脫液選自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buff er的一種或多種的組合，濃度為0 · 01~10M，pH為2 · 0~3 · 0;
[0055] 封閉液選自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合，濃度為0.05%~5%，pH為 8 · 0~9 · 0;
[0056] 保存液選自：BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合，濃度為1~ 50mM，pH為8~10。
[0057]本發明還提供一種采用本發明方法檢測AFP-L3的試劑盒，包括：
[0058] 磁微粒，以及任選的以下組分:偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A，偶聯AFP-L3抗原的磁 微粒B，AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存 液，磁力架。
[0059] 優選的采用本發明方法檢測AFP-L3的試劑盒，包括：
[0060] 偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A，
[00611偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B，
[0062]以及任選的以下組分:AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖 液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
[0063] 本發明所述的試劑盒，包括:盒體、盒體內的試劑，試劑槽，說明書，所述試劑放置 在試劑槽中。
[0064] 本發明的目的在于提供:與以往的方法相比，簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全 無毒，可回收AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測方法，以及其檢測試劑和檢測試劑盒。
[0065]本發明人對于AFP-L3的檢測方法進行了深入的研究，結果發現:通過磁微粒分離 熒光免疫分析技術，與以往的方法相比，具有簡便快速，靈敏度高，準確性高，安全無毒，可 回收等優點，從而完成了本發明。
[0066] 即，本發明提供AFP-L3的磁微粒分離免疫熒光分析檢測方法，該檢測方法包括:使 用磁微粒作為固相載體，偶聯與AFP-L3特異性結合的抗體作為包被抗體，使用熒光素標記 與AFP-L3特異性結合的抗體作為檢測抗體，最后使用偶聯AFP-L3的磁微粒清除過量的檢測 抗體，通過熒光強度定量檢測樣品中的AFP-L3。本發明還提供AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測 試劑，該免疫熒光檢測試劑包含:磁微粒，AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液， 洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液。本發明進一步提供AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑 盒，該檢測試劑盒包括本發明所述的AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑。
[0067]根據本發明可提供簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全無毒，可回收的的AFP-L3 的磁微粒分離免疫熒光分析檢測方法、以及用于該檢測的試劑和檢測試劑盒。本發明的方 法與以往的方法相比，檢測效率得到大幅提高，作為AFP-L3檢測方法，其具有簡便快速，靈 敏度高，準確性高，安全無毒，可回收等優點。
[0068]本發明的檢測方法中，使用磁性微粒分別偶聯AFP-L3、與AFP-L3特異性結合的抗 AFP-L3抗體、和熒光標記的抗AFP-L3抗體進行磁微粒分離免疫熒光分析檢測。通過此方法， 可以合乎需要地簡化操作步驟，降低檢測成本，提高檢測值的準確性。
[0069] AFP-L3抗原，即AFP-L3抗原蛋白標準品，為市售商品，可按照常規方法購買獲得， 其特性如下:產品濃度lmg/ml，純化方法為HPLC，純度多98 %。
[0070] 抗AFP-L3抗體是與AFP-L3特異性結合的抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克 隆抗體。從免疫檢測的再現性等角度考慮，可優選使用單克隆抗體。另外，這些抗體也可以 保持與對應抗原的結合性的抗體片段(抗原結合性片段)的形式使用。
[0071] 多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結合性片段的制備方法本身是周知的常規方法， 抗AFP-L3抗體或及抗原結合性片段可按照常規方法制備。另外，這些抗體也存在市售商品， 因此也可以使用市售的抗體。
[0072]抗AFP-L3單克隆抗體例如可通過周知的雜交瘤法獲得:將AFP-L3或其部分片段作 為免疫原與適當的佐劑混合用于免疫動物(人除外），從該動物采集脾細胞或淋巴細胞等抗 體生成細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，制備雜交瘤，然后選擇生產與AFP-L3特異性結合的抗 體的雜交瘤，使其增殖，從培養上清中獲得抗AFP-L3單克隆抗體。為了使被免疫動物中抗體 效價升高，免疫通常需要花費數周進行多次。本發明中，為了提高AFP-L3結合的特異性，優 選單克隆抗體。
[0073] 作為免疫原使用的多肽或其部分片段可通過化學合成、遺傳工程學方法等常規方 法制備，或從新鮮人血漿等中提取AFP-L3并純化獲得。化學合成法的具體例子例如可舉出： Fmoc法(芴甲氧羰基法）、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等。還可以利用各種市售的肽合成儀，通 過常規方法參照GenBank等數據庫中的AFP-L3序列信息合成所需的多肽。通過遺傳工程學 方法制備多肽的方法也是周知的。具體來說，例如可通過以下所述的方法制備:首先，由來 自人的培養細胞等中提取RNA，通過反轉錄反應由mRNA合成cDNA。以該cDNA為模板，根據 GenBank等數據庫中的AFP-L3序列信息等設計引物并進行PCR，制備編碼AFP-L3的多核苷 酸。或者，編碼AFP-L3的多核苷酸可通過使用市售的核酸合成儀的常規方法制備。編碼各氨 基酸的密碼子是公知的，因此只要特定氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的多核苷酸的堿基 序列也可確定。接著，將制備的多核苷酸導入適當的載體，通過適當的表達系統使多肽表 達，回收該多肽，由此可獲得所需的免疫原多肽。所使用的載體或各種表達系統(細菌表達 系統、酵母細胞表達系統、哺乳動物細胞表達系統、昆蟲細胞表達系統、無細胞表達系統等） 也是周知的，各種載體或宿主細胞、試劑類、檢測試劑盒均有市售。
[0074] 免疫分析法是周知的常規方法。作為具體例子，可舉出競爭蛋白結合分析、受體結 合分析，以及放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、膠體金免疫分析、化學發光和生物 發光免疫分析方法等，本發明中可以采用任意方法。從免疫檢測的準確性及安全性等角度 考慮，可優選使用熒光免疫分析法。
[0075] 磁微粒即超順磁性納米顆粒，磁微粒分離免疫熒光分析技術是將目標分子的親和 基團如抗體、蛋白等偶聯于磁性納米顆粒表面，形成可均勻分散的具有高度穩定性的膠態 復合磁微粒。當免疫磁微粒與含有檢測目標分子的溶液混合后，由于目標分子與其基團的 親和結合而形成磁微粒-基團-目標分子復合物，然后利用外加磁場(磁力架或磁棒)與磁微 粒之間的磁性將磁微粒-基團-目標分子復合物分離，經過洗滌緩沖液去除非特異性結合雜 質，然后用洗脫液將目標分子與磁微粒分離，進而實現目標分子的分離檢測，具有成本低、 能耗少、安全無毒、可回收等優點，若與全自動分離檢測儀器配套使用，可進一步提高反應 通量和工作效率。本發明在粒徑分布于100~lOOOnm之間的磁微粒表面或通過磁微粒表面 的功能基團（氨基、羧基、巰基、環氧基、NHS基團等)偶聯AFP-L3和與AFP-L3特異性結合的抗 AFP-L3抗體，作為固相載體用于免疫檢測。本發明中的磁微粒表面可以使用任意一種功能 基團與AFP-L3或者抗AFP-L3抗體偶聯。懸浮性磁微粒作為固相載體，取代傳統的免疫學固 相載體用于檢測，具有較大的比表面積，能夠充分的與樣品反應，加之外加磁場的靈活運 用，具有快速高效、靈敏度高、重復性好等優點。另外，這些磁微粒也存在市售商品，因此也 可以使用市售的磁微粒或者磁珠。
[0076]以使用抗AFP-L3抗體作為包被抗體的情形為例，具體說明本發明的AFP-L3檢測方 法。首先，將抗AFP-L3抗體(包被抗體)偶聯于固相載體磁微粒上，將多余的基團封閉后使足 量磁微粒與待測樣品充分接觸，由此磁微粒上的抗AFP-L3抗體與樣品中所含的AFP-L3特異 性結合，接著磁性分離，用適當的緩沖液洗滌磁微粒復合物，除去未結合的樣品中其他成 分，例如多余的載體等。然后洗脫AFP-L3，使用過量的熒光素標記的抗AFP-L3抗體與AFP-L3 結合，孵育使充分反應。反應結束后，用適當的方法檢測來自熒光素標記物的熒光信號，由 此可檢測樣品中的AFP-L3含量。
[0077]固相載體沒有特別限定，可以與在公知的免疫檢測系統中使用的固相載體相同。 固相載體的材質的具體例子可舉出：聚苯乙烯、聚氯乙烯、瓊脂糖、脂質體、膜載體、高分子 磁微粒等，但并不限于這些。所使用的固相載體優選為抗體與其表面結合牢固，且可容易地 將檢測中形成的免疫復合物與未反應的成分分離的材料。從操作性、經濟性、安全性與結合 效率等方面考慮，優選使用如上所述材質中的磁微粒。
[0078] AFP-L3、與AFP-L3特異性結合的抗AFP-L3抗體或其抗原結合性片段與固相載體的 結合可通過本領域周知的常規方法進行，作為具體例子，可舉出共價鍵化學偶聯、非共價鍵 吸附或物理吸附等，本發明可以采用任意一種方式結合到固相載體表面，但并不限于這些。
[0079] -種磁微粒，其特征在于:所述磁微粒表面覆蓋有一層具有抗原識別活性的抗體， 或覆蓋有一層具有抗體識別活性的抗原。
[0080] 標記物沒有特別限定，可以使用與在公知的免疫檢測系統中使用的標記物同樣的 物質。具體例子可舉出：酶、熒光物質、化學發光物質、染色物質、放射性物質等。為了提高檢 測靈敏度，簡化操作步驟，降低放射污染，優選使用熒光素標記。用于標記的熒光染料也沒 有特別限定，可以使用與在公知的免疫熒光檢測系統中使用的標記物同樣的物質，具體例 子可舉出：異硫氰酸焚光素 （fluoresce ini sothiocyanate，FITC)，四乙基羅丹明（rhoda mine，RIB200)，四甲基異硫氛酸羅丹明（tetramethylrhoda mineisothiocyanate，TRITC)， 鑭系元素（銪Eu3、鉞Tb3、鋪Ce3等）螯合物，藻紅蛋白（phycoerythrin，PE)及其他焚光物質 (β_半乳糖苷酶、堿性酸酶、辣根過氧化物酶）等。本發明中可以使用任意一種作為熒光染 料，但并不限于這些。
[0081] 使用生物素作為標記物時，可以使用結合了酶、熒光物質、化學發光物質、染色物 質或放射性物質等的鏈霉抗生物素或半抗原抗體等檢測。
[0082]信號的檢測可根據標記物的種類適當選擇。例如信號如果是顯色，則可使用比色 計或吸光光度計，如果是熒光則可以使用熒光分光光度計，如果是發光則可以使用光子計 數儀，如果是放射線則可以使用放射線檢測裝置。對于以各種濃度含有AFP-L3的濃度已知 的標準樣品，按照本發明的方法檢測AFP-L3，由來自標記的信號量和標準樣品中AFP-L3的 濃度的相關關系制圖，繪制標準曲線，對AFP-L3濃度未知的樣品同樣進行檢測操作，檢測來 自標記的信號量，將檢測值代入該標準曲線，由此可對樣品中AFP-L3進行定量。
[0083] 本發明的方法所適用的樣品是從受試者體內分離的樣品，優選血液樣品，特別優 選血漿或血清。根據本發明的檢測方法，不管是血漿還是血清，均可穩定地檢測AFP-L3含 量。根據需要可適當稀釋樣品，以確保在工作濃度范圍內進行檢測。
[0084] 本AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測方法所述抗體不是包被在板上，而是用抗體來包被 磁微粒，將包被的磁微粒作為試劑使用，更利于定量操作，方便穩定且靈敏度更高，在抗體 抗原反應中能將檢測干擾因素降到最低。
[0085]本發明還提供AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑，該試劑包含:磁微粒，AFP-L3抗 原，抗AFP-L3抗體，焚光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液。
[0086]上述AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑可以適當組合，作為AFP-L3磁微粒免疫熒光 檢測試劑盒提供。AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑還可以與其它試劑類等適當組合，例如， 除上述檢測試劑之外，本發明的檢測試劑盒中還可以進一步含有EP管、樣本稀釋液等。其 中，EP管即Eppendorf離心管，為市售商品，可按照常規方法購買獲得。免疫檢測所必需的其 它試劑類是周知的。
[0087]本發明所提供的靈敏快速的AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑盒，為AFP-L3的檢測 和疾病的早期診斷提供了一種簡便快速，高靈敏度，高準確性，安全無毒，可回收的途徑。檢 測試劑盒中包括所述AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑，固定在盒內的凹槽中。
【附圖說明】
[0088]圖1是表示實施例1中AFP-L3標準品濃度與吸光度的線性關系的圖表。
【具體實施方式】
[0089]以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，以使用AFP-L3作為目標檢測物 的情形為例，具體說明本發明的AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測方法。本發明并不受這些實施 例等的限定。本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與 功效。本發明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應用，本說明書中的各項細 節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0090]在本發明中，當給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的 兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有 技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方 法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以 使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和 材料來實現本發明。
[0091 ]實施例1 .AFP-L3磁微粒分離免疫熒光分析檢測試劑的制備
[0092] 1、AFP_L3抗原的制備
[0093] (1 )pColdΠ -AFP-L3表達載體的構建
[0094] 參照GenBank中人AFP-L3的基因序列設計引物并合成AFP-L3基因，PCR擴增后，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測AFP-L3擴增產物，切下目的條帶，使用膠回收試劑盒回收目的片段。對 其用限制性內切酶NdeI和Hindm雙酶切的原核表達載體pCo 1 d Π 連接，轉化至大腸桿菌 E. co 1 i . DH5a中擴增，再轉入E. co 1 i . BL21 (DE3)感受態細胞，接種于LB固體培養基中，含氨 芐青霉素(Amp)100mg/L，抽取質粒，進行Ndel和Hindm酶切鑒定和測序。重組質粒pColdn-AFP-L3經5'NdeI和3'把11(1111進行雙酶切，出現兩條特異性條帶，位置與?(：〇1(111和目的片段 的大小一致。測序結果顯示目標序列與NCBI相應序列相符，證實表達載體pCold II-AFP-L3 構建成功。
[0095] (2)AFP_L3融合蛋白的表達及純化
[0096] 挑取含重組質粒pColdn -AFP-L3-BL21的菌落接種于10mL LB培養基(Amp，100mg/ L)中，220r/min 37°C搖菌12h，按1:100的比例接種于1000mL的LB培養基(Amp，100mg/L)中， 相同條件下培養3h，待菌液達到A 6Q()時加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，15°C振搖培養16h， 誘導培養結束后，收集菌體至50mL無菌離心管，5000r/min 4°C離心10min，棄上清，重懸于 20mL lysis buffer(20mmol/L Tris-HCl包含lmmol/L蛋白酶抑制劑混合物，pH 8.0)中，經 細胞超聲破碎儀破碎(超聲2s、冷卻4s、功率1001)，1200(^/11^11、4°(：離心151^11。沉淀重懸于 lysis buffer(含8mol/L尿素），并經0·22μηι濾膜過濾，過Ni-NTA層析柱進行純化；10倍的柱 體積lysis buffer(含8mol/L尿素+20mmol/L咪唑）洗滌；用buffer C(20mmol/L Tris-HCl buffer，pH 8.0，含150mmo 1 /L NaCl，8mo 1 尿素，250mmo 1 /L咪唑)洗脫目的蛋白。將洗脫的 蛋白用含有一定濃度梯度的尿素(6、5、4、2、lmol/L)進行復性，最終用PBS透析，透析完成后 檢測凍干濃縮蛋白濃度為1.5mg/mL。
[0097] 2、AFP_L3抗體的制備
[0098] (1)雜交瘤細胞株的制備
[0099] 將生長狀態良好的S p2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾細胞以1:10的比例混合，加入 50 %聚乙二醇進行融合，融合過程按常規方法進行。用AFP-L3表達蛋白作為檢測抗原，對有 融合細胞孔的上清液進行間接ELISA檢測，一抗為細胞培養上清，二抗為辣根過氧化物酶標 記的山羊抗小鼠 IgG(l :2000稀釋），TMB顯色檢測篩選陽性細胞克隆株。將篩選的陽性細胞 克隆株用有限稀釋法進行單克隆篩選，間接ELISA法檢測，直至陽性率達100%，篩選出穩定 分泌抗AFP-L3抗體的雜交瘤細胞株進行擴大培養，并凍存于液氮中。
[0100] (2)單克隆抗體的制備
[0101]選擇BALb/c小鼠，每只腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL，l周后經腹腔接種雜交瘤細 胞0.5mL( 1 X 106細胞/只）。10~14d后小鼠腹部明顯腫脹收集腹水，12000r/min離心10min， 去除上層的脂肪、液體石蠟和沉淀，吸取淡黃色腹水，將腹水經Protein A瓊脂糖親和層析 柱獲得純化抗體，之后在PBS中進行4°C透析12h，隔日采用BCA法檢測抗體濃度，ELISA法檢 測抗體效價，然后加入50 %甘油混合，小量分裝后-80°C保存備用。
[0102] AFP-L3磁微粒免疫熒光分析檢測方法及操作步驟
[0103] 1、磁微粒與目標生物樣品的偶聯
[0104] (1)磁微粒的預處理
[0105] 將磁微粒懸浮液反復顛倒混勾，取50yL置于1.5mL EP管中，加入0.5~l.OmL洗滌 緩沖液，洗滌緩沖液為:pH為7.2~7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，混勻，然后在磁力架上 磁性分離，棄上清液。加入lmL洗滌緩沖液懸浮磁微粒，混勻，在磁力架上磁性分離，棄上清 液。重復上一步驟，然后將磁微粒在50yL偶聯緩沖液中懸浮，偶聯緩沖液為:pH為8.0~8.2 的25mM~50mM碳酸氫銨，待用。
[0106] (2)目標生物樣品的偶聯
[0107] 將目標生物樣品與磁微粒偶聯以制備免疫磁微粒時，所用的單克隆抗體或抗原包 被液的濃度是影響后期檢測的直接因素，其濃度大小直接影響檢測結果的準確性和線性范 圍。若所用包被液的濃度過低，在后期的免疫反應中磁微粒的反應效率差，抗原抗體反應不 完全，使檢測結果偏低;若所用包被液的濃度過高，會造成昂貴試劑的浪費。因此采用以下 方法進行條件優化篩選：
[0108] 取10~15yL需偶聯的AFP-L3抗體或抗原于盛有2mL粒徑為100~lOOOnm磁微粒的 EP管中，并加入500yL偶聯緩沖液，偶聯緩沖液為:pH為8.0~8.2的25mM~50mM碳酸氫銨，混 勻。將EP管置于旋轉混合儀上孵育。然后將EP管置于磁力架上磁性分離，保留磁微粒及上清 液，采用BCA法檢測偶聯前后抗AFP-L3抗體標準溶液的蛋白含量。所述磁微粒與抗AFP-L3抗 體偶聯條件優選為：
[0109] 磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20yg/mL、22°C孵育2h、pH=ll;
[0110] 磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10;
[0111] 磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、pH= 11;
[0112] 磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、pH= 10;
[0113] 磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=ll;
[0114] 或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=10。
[0115] 所述磁微粒與抗AFP-L3抗原偶聯條件優選為：
[0116] 磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 11;
[0117] 磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10;
[0118] 磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH=ll;
[0119] 磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、pH= 10;
[0120] 磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=ll;
[0121] 或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=10。
[0122] (3)封閉未反應的基團
[0123] 磁微粒偶聯結束后，加入500yL封閉液，封閉液為:0.1 %的BSA，混勻后將EP管置于 旋轉混合儀上室溫孵育2~6h或者4°C孵育12~20h，然后將EP管置于磁力架上磁性分離，棄 上清液。重復上一步驟一次。
[0124] (4)磁微粒的保存
[0125] 向已完成生物分子共價偶聯的磁微粒中加入lmL的保存液，保存液為:pH為9的5mM BST緩沖液，0 · 05 % Tween-20，0 · 01 % NaN3，0 · 1 % BSA，混勻，于4 °C保存備用。
[0126] 2、磁微粒與抗AFP-L3抗體偶聯效率的檢測
[0127] 將抗AFP-L3抗體與磁微粒偶聯后，采用BCA法檢測偶聯前后抗AFP-L3抗體標準溶 液的蛋白含量，計算磁微粒偶聯效率。結果表明，加入磁微粒后，溶液蛋白濃度顯著降低，磁 微粒表面的基團可與抗AFP-L3抗體發生偶聯，以使磁微粒具有生物活性，即具有捕獲抗體 或抗原的能力成為免疫磁微粒。磁微粒與抗AFP-L3抗體偶聯效率為78.43% ±4.25。
[0128] 3、AFP_L3標準曲線的繪制
[0129] 取FITC標記的抗AFP-L3抗體100yL于EP管中，分別加入AFP-L3標準品各100yL，用 Ο ·Olmol/L PBS稀釋為7個濃度梯度（Ong/mL，1 · 25ng/mL，2 · 50ng/mL，5 ·OOng/mL，10 · OOng/ mL，20.0 Ong/mL，40.0 Ong/mL)，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12h以上，使AFP-L3抗原 抗體充分反應。用空白孔調零，采用熒光分光光度計檢測標準品熒光值，依據AFP-L3標準品 濃度及其熒光值繪制標準曲線，見圖1。
[0130] 4、AFP-L3含量的檢測
[0131] 具體操作步驟如下：
[0132] (1)取10份人血清樣品200yL，加入2mL偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A，于室溫旋轉孵 育2~6h或者4°C孵育12~20h，使AFP-L3抗原抗體充分反應。
[0133] (2)置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗滌緩沖液清洗磁微粒復合物，洗滌緩 沖液為:pH為7.2~7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，置于磁力架上磁性分離，棄上清液。
[0134] (3)加入lOOyL洗脫液，洗脫液為:pH為2.5的0.1M甘氨酸，混勻，重懸磁微粒，室溫 孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液。
[0135] (4)加入2mL FITC標記的抗AFP-L3抗體，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~ 20h。加入20mL偶聯AFP-L3抗原的磁微粒，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h。
[0136] (5)置于磁力架上磁性分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值， 并對照標準曲線計算樣品中AFP-L3含量。
[0137] 和現有的方法相比，本發明的優點表現在：
[0138] 免疫磁微粒具有較高的表面質量比，可以結合更多的抗體或者抗原參加免疫反 應；
[0139] 采用兩套磁微粒分別偶聯抗體及抗原，與常規的雙抗體夾心法相比，本方法只需 要一種對應的抗AFP-L3抗體即可完成反應，成本較低；
[0140]采用熒光標記抗體技術，將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性 相結合，特異性強、靈敏度高、準確性好。
[0141] 5、AFP_L3檢測方法的穩定性比較
[0142] 將上述檢測結果與ELISA法進行對照，結果顯示二者具有良好的相關性:采用磁微 粒分離免疫熒光分析法檢測AFP-L3的線性范圍為0.1~500.0ng/mL，檢測限為0.1 ng/mL，標 準曲線的線性回歸方程為7 = -1.6679+1.07421，妒=0.9981，（其中1為六??-1^3濃度，7為吸 光度值），其檢測下限比ELISA法低50倍。血清樣品AFP-L3含量檢測結果如下：
[0143]
[0144]
[0145] 注：-表示不能檢出。
[0146] 6、磁微粒的回收率檢測
[0147] 將已偶聯AFP-L3抗體或抗原的磁微粒與洗脫液混合，洗脫液為:pH為2.5的0.1M甘 氨酸，充分反應后置于磁力架上磁性分離，立即用洗滌緩沖液清洗磁微粒，洗滌緩沖液為： pH為7.2~7.6的20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，除去殘留于磁微粒表面的抗體或抗原，然后加 入 lmL保存液，保存液為:pH為 9 的 5mM BST 緩沖液，0· 05 % Tween-20，0 · 01 % NaN3，0 · 1 % BSA， 混勻，于4°C保存備用。將抗AFP-L3抗體與回收的磁微粒偶聯后，采用BCA法檢測偶聯前后抗 AFP-L3抗體標準溶液的蛋白含量，計算得磁微粒回收率為79.53% ±9.25。
[0148] 7、全自動磁微粒分離免疫熒光分析檢測
[0149] 磁微粒分離檢測的具體實現方法通常有手動和自動兩種形式。手動檢測是指操作 人員使用DCP磁微粒免疫熒光檢測試劑、磁力架等耗材和工具，手工完成整個檢測流程。手 動分選中用到的磁力架結構比較簡單，主要由支架和產生磁場的永磁鐵組成，起到承托試 管并提供外加磁場的作用。磁微粒的孵育、外部磁場的加入與移除、吸附物的清洗與洗脫等 各關鍵步驟都由人工操作完成。手動分選不需要復雜的設備，形式靈活、成本較低，適合少 量實驗使用。
[0150] 當需要頻繁進行操作且樣本量較大時，采用自動分離檢測法更為方便高效。自動 分離法主要利用全自動磁微粒分選儀，操作人員將待分選樣本加入到分選儀中，由分選儀 自動完成分離流程。全自動磁性分選儀的分選通量較大，并且一般有多個優化的分選程序 可供調用，操作簡單，分選可靠性高。當前具有代表性的產品化全自動磁性分選儀有美天旎 (MACS)，BD，R&D，StemCell RoboSep和Dynal Bead Retriever等品牌。
[0151] 本發明磁微粒分離免疫熒光分析DCP含量的檢測方法，可用于全自動免疫磁珠分 選系統，實現全自動分析檢測，具體操作步驟如下：
[0152] (1)預沖autoMACS pro分選儀，準備待測血清樣品、磁微粒A/B、DCP標準品、FITC標 記的抗DCP抗體、偶聯緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫液、封閉液、保存液；
[0153] (2)細胞分選策略選擇"陽性分選策略"，標記方式選擇"直接標記"；
[0154] (3)取25yL DCP標準品到S1 -7號管中，向2個空白管中加入lmL洗滌緩沖液，向離心 管中分別加入25yL磁微粒A和50yL熒光標記抗DCP抗體，設置反應程序條件，上機檢測。將檢 測結果與手動檢測法進行對照，結果顯示二者具有良好的相關性。
[0155] 實施例2. AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑盒的組成
[0156] 本發明根據本發明所述方法設計了一種試劑盒，該試劑盒可以用于AFP-L3的檢 測，通過使用該試劑盒，使操作簡單，省時省力，避免了現用現配的繁瑣，同時使操作標準 化。
[0157] 因此本發明提供一種試劑盒。
[0158] 本發明的試劑盒，包括磁微粒，以及任選的以下組分:偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A， 偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B，AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖液， 洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
[0159] 本發明的另一種試劑盒，包括:偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A，偶聯AFP-L3抗原的磁 微粒B，以及任選的以下組分:AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖 液，洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
[0160] 其中所述任選為可以不選其中任一組分，也可以選擇其中一或多種組分。
[0161] 本發明的試劑盒，是將不同的組分分別盛裝，再一同包裝在同一包裝盒內，使用時 根據說明書中描述的方法進行操作。
[0162] 試劑盒中，偶聯緩沖液選自：碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一 種或多種的組合，濃度為1~100mM，pH為8.0~10.0;
[0163 ]洗滌緩沖液選自：甘氨酸緩沖液、Tri s-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、 碳酸鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為2~200mM，pH為7.0~8.0;
[0164] 洗脫液選自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buff er的一種或多種的組合，濃度為0 · 01~10M，pH為2 · 0~3 · 0;
[0165] 封閉液選自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合，濃度為0.05%~5%，pH為 8 · 0~9 · 0;
[0166] 保存液選自：BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合，濃度為1~ 50mM，pH為8~10。
[0167] 本發明的檢測試劑盒，包括:盒體、盒體內的試劑，所述試劑為AFP-L3磁微粒免疫 熒光檢測試劑，所述盒體內部設有若干試劑槽，所述試劑槽中放置盛有磁微粒的EP管，試劑 盒中試劑的量可以是一人份，也可以是多人份。
[0168] 和現有的方法相比，本發明的優點表現在：
[0169] 免疫磁微粒具有較高的表面質量比，可以結合更多的抗體或者抗原參加免疫反 應；
[0170]采用兩套磁微粒分別偶聯抗體及抗原，與常規的雙抗體夾心法相比，本方法只需 要一種對應的抗免疫標志物抗體即可完成反應，成本較低；
[0171]采用熒光標記抗體技術，將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性 相結合，特異性強、靈敏度高、準確性好。
[0172]綜上所述，本發明所提供的AFP-L3磁微粒免疫熒光檢測試劑盒具有良好的準確性 和特異性且靈敏度高，有效克服了現有技術中的缺點且具高度產業化利用價值。
[0173]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種檢測血漿或血清中AFP-L3含量的方法:所述方法包括以下步驟： 步驟1，表面偶聯抗AFP-L3抗體的磁微粒A的制備，和表面偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B的 制備； 步驟2，熒光標記的抗AFP-L3抗體的制備； 步驟3，AFP-L3含量的檢測：血漿或血清樣品和磁微粒A反應，反應完畢將AFP-L3洗脫， 加入熒光標記的抗AFP-L3抗體孵育，再加入磁微粒B繼續孵育，然后磁性分離，用熒光分光 光度計檢測樣品熒光值，計算樣品中AFP-L3含量。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁微粒A和磁微粒B的制備，方法如下： 將磁微粒制備成磁微粒懸浮液，磁微粒懸浮液與抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原偶聯：將抗 AFP-L3抗體或AFP-L3抗原與磁微粒懸浮液混合孵育偶聯，偶聯后用封閉液封閉，得到偶聯 AFP-L3抗體的磁微粒A和偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述與AFP-L3特異性結合的抗體是 單克隆抗體或多克隆抗體。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，磁微粒與AFP-L3抗原的偶聯條件選 自如下條件： 磁微粒粒徑120nm、抗原濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 11; 磁微粒粒徑180nm、抗原濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10; 磁微粒粒徑200nm、抗原濃度25yg/mL、25 °C孵育4h、ρΗ= 11; 磁微粒粒徑300nm、抗原濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH=10; 磁微粒粒徑500nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH= 11; 或者磁微粒粒徑800nm、抗原濃度30yg/mL、28°C孵育6h、pH=10。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中，磁微粒與抗AFP-L3抗體的偶聯條件 選自如下條件： 磁微粒粒徑120nm、抗體濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 11; 磁微粒粒徑180nm、抗體濃度20yg/mL、22 °C孵育2h、pH = 10; 磁微粒粒徑200nm、抗體濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH= 11; 磁微粒粒徑300nm、抗體濃度25yg/mL、25°C孵育4h、pH=10; 磁微粒粒徑500nm、抗體濃度30yg/mL、28 °C孵育6h、pH= 11; 或者磁微粒粒徑800nm、抗體濃度30yg/mL、28 °C孵育6h、pH= 10。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下： 步驟（1)取磁微粒，加入磁微粒體積2~50倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在磁力架上磁性 分離，棄上清液;重復上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯緩沖液中懸浮，得到磁微 粒懸浮液； 步驟(2)向抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原中加入體積0.01~1倍的步驟（1)處理的磁微粒 懸浮液，加入偶聯緩沖液，孵育，直至磁微粒偶聯完全;磁性分離，保留磁微粒;磁微粒偶聯 結束后，加入封閉液混勻，孵育，磁性分離，得到偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A和偶聯AFP-L3 抗原的磁微粒B; 步驟(3)熒光標記的抗AFP-L3抗體的制備:抗AFP-L3抗體溶解于碳酸鹽緩沖液中，熒光 素溶解于DMSO中，將熒光素逐滴緩慢加入抗AFP-L3抗體溶液中，4°C避光攪拌12~20h，用G- 25葡聚糖凝膠去除游離的熒光素； 步驟(4)取待測樣品，加入樣品體積1~100倍的磁微粒A，于室溫旋轉孵育2~6h或者4 °C孵育12~20h，使AFP-L3抗原抗體充分反應;置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用洗滌緩 沖液清洗磁微粒復合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液;加入與抗體等量的洗脫液，混 勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液;加入樣品體積1~100 倍的熒光標記AFP-L3抗體，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;加入磁微粒A體積1 ~100倍的磁微粒B，于室溫旋轉孵育2~6h或者4 °C孵育12~20h;置于磁力架上磁性分離， 保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中AFP-L3含 量。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 取磁微粒置于EP管中，加入磁微粒體積10~20倍的洗滌緩沖液，混勻，然后在磁力 架上磁性分離，棄上清液;重復上一步驟，然后將磁微粒在與其等量的偶聯緩沖液中懸浮， 得到磁微粒懸浮液； (2) 加入磁微粒懸浮液體積0.2~0.3倍的需偶聯的抗AFP-L3抗體或AFP-L3抗原于盛有 磁微粒懸浮液的EP管中，并加入磁微粒懸浮液體積10倍的偶聯緩沖液，混勻;將EP管置于旋 轉混合儀上室溫孵育2~6h或者4°C孵育12~20h，直至磁微粒偶聯完全;將EP管置于磁力架 上磁性分離，保留磁微粒;表面偶聯抗AFP-L3抗體的為磁微粒A，表面偶聯AFP-L3抗原的為 磁微粒B，上清液用于檢測偶聯效率； (3) 磁微粒偶聯結束后，加入磁微粒懸浮液體積10倍的封閉液，混勻，將EP管置于旋轉 混合儀上室溫孵育2~6h或者4 °C孵育12~20h，將EP管置于磁力架上磁性分離，棄上清液； 重復上一步驟一次； (4) 取待測血漿或血清樣品，加入樣品體積1~100倍的磁微粒A，于室溫旋轉孵育2~6h 或者4 °C孵育12~20h，使AFP-L3抗原抗體充分反應;置于磁力架上磁性分離，棄上清液，用 洗滌緩沖液清洗磁微粒復合物，置于磁力架上磁性分離，棄上清液;加入與抗體等量的洗脫 液，混勻，重懸磁微粒，室溫孵育5min，置于磁力架上磁性分離，保留上清液;加入樣品體積1 ~100倍的熒光標記AFP-L3抗體，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;加入磁微粒A 體積1~100倍的磁微粒B，于室溫旋轉孵育2~6h或者4°C孵育12~20h;置于磁力架上磁性 分離，保留上清液，采用熒光分光光度計檢測樣品熒光值，并對照標準曲線計算樣品中AFP-L3含量。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中， 偶聯緩沖液選自：碳酸氫鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硫酸鹽緩沖液的一種或多種的組 合，濃度為1~100mM，pH為8.0~10.0; 洗滌緩沖液選自：甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸 鹽緩沖液、氯化鹽緩沖液的一種或多種的組合，濃度為2~200mM，pH為7.0~8.0; 洗脫液選自：甘氨酸、Tris Buffer、EDTA溶液、IPTG溶液、L-谷氨酸溶液、MES Buffer的 一種或多種的組合，濃度為0.01~1〇Μ，ρΗ為2.0~3.0; 封閉液選自：BSA、酪蛋白、甘氨酸的一種或多種的組合，濃度為0.05 %~5%，pH為8.0 ~9 · 0; 保存液選自：BST緩沖液、Tween-20、NaN3、BSA的一種或多種的組合，濃度為1~50mM，pH 為8~ΙΟ。9. 一種采用權利要求1方法檢測AFP-L3的試劑盒，包括： 磁微粒，以及任選的以下組分:偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A，偶聯AFP-L3抗原的磁微粒 B，AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫液，封閉液，保存液， 磁力架。10. -種采用權利要求1方法檢測AFP-L3的試劑盒，包括： 偶聯AFP-L3抗體的磁微粒A， 偶聯AFP-L3抗原的磁微粒B， 以及任選的以下組分:AFP-L3抗原，抗AFP-L3抗體，熒光素，偶聯緩沖液，洗滌緩沖液， 洗脫液，封閉液，保存液，磁力架。
【文檔編號】G01N33/68GK105974132SQ201610519524
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】劉婕, 吳文強, 李國棟
【申請人】福建廣生堂藥業股份有限公司