本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種肝癌相關microRNA檢測試劑盒。
背景技術：
：MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過堿基互補配對的方式識別靶miRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。肝細胞肝癌(HCC)是我過常見的惡性腫瘤，其發生發展是多因素、多基因和多步驟的復雜過程。新近研究結果表明，多種miRNA通過調節其靶基因參與HCC的細胞生物程序調控，間接發揮癌基因和抑癌基因的功能。研究發現，與臨近肺腫瘤組織相比，77.8％的肝癌組織中miR-138表達下調。肝癌組織中過度表達的miR-138可誘導細胞周期阻滯，阻止細胞集落形成，降低腫瘤細胞的細胞存活率。此外還有研究表明，提高miR-122的表達水平可抑制肝癌細胞生長；miR-26a在肝癌細胞中呈現表達下降，降低磷酸化的PRB，阻止細胞從G1期向S期的過度；miR-101上調可使肝癌G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞減少，進一步實驗研究表明，其通過抑制EZH2基因表達，對人肝癌細胞增殖活性具有負調控作用；以及mir-21在肝癌轉移和侵犯的作用和基本作用機制得到明確。目前，針對miRNA的檢測方法主要有NorthernBlot、基因芯片、熒光定量探針法、基于微球的流式細胞術技術。但NorthernBlot方法敏感度低、耗時長且RNA的用量較大，不適合高通量分析；基因芯片技術能實現miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時檢測多個miRNA，但缺點是結果準確性低，重復性差，實驗價格昂貴；熒光定量探針法檢測靈敏度高，但檢測費用昂貴；而基于微球的流式細胞術技術將探針固定于微球上并置于液相中，更有利于捕獲miRNA序列，因此提高了準確性，但是由于miRNA同源性高，長度較短，細胞或組織內含量低，針對它的高靈敏高選擇性檢測方法仍然有待進一步完善。原位雜交技術是一種定位和形態學檢測保存的組織切片或細胞制備物中特異性miRNA 序列的方法。然而目前現有技術中對miRNA的多重平行檢測仍存在許多困難。首先，需要分別制備各靶miRNA的標記探針；其次，難以同時原位檢測多種靶miRNA的表達。因此，目前報道的對多種miRNA的檢測只能用不同的標記方法，然而，用不同的標記方法不能很好地控制探針與細胞中非特異性序列可能的交叉雜交。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高的肝癌相關microRNA檢測試劑盒。實現上述目的的技術方案如下。一種肝癌相關microRNA檢測試劑盒，包括有：針對每種待檢測的肝癌相關microRNA有至少一條一級信號放大探針、至少一條二級信號放大探針、和至少一條三級信號放大探針，以及捕獲探針，所述肝癌相關microRNA選自選自::hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p中的至少一種，其中：所述捕獲探針用于連接目標核酸與一級信號放大探針，每條捕獲探針從5’端到3’端依次為特異性P1序列、間隔臂序列、P2序列，針對不同目標基因的P2序列互不相同；所述一級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、P3序列，P3序列與P2序列互補配對；所述二級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P5序列、間隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一個與P5序列互補配對的堿基片段，且每個與P5序列互補配對的堿基片段之間設有間隔臂序列；所述三級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端還修飾有熒光基團，針對不同目標核酸的熒光基團的顏色互不相同或發射波長互不相同；所述P6序列含有至少一個與P7序列互補配對的堿基片段，且每個與P7序列互補配對的堿基片段之間設有間隔臂序列；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均為不存在發夾結構，各探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與整個檢測體系的其它核酸之間均不存在特異性結合的序列。所述待檢測的肝癌相關miRNA的捕獲探針的特異性P1序列選自以下中的至少一種：針對hsa-miR-138-5p的SEQIDNO.1，針對hsa-miR-122-5p的SEQIDNO.2，針對hsa-miR-101-3p的SEQIDNO.3，針對hsa-miR-21-5p的SEQIDNO.4，針對hsa-miR-326的SEQIDNO.5， 針對hsa-miR-297的SEQIDNO.6，針對hsa-miR-520b的SEQIDNO.7，針對hsa-miR-181b-5p的SEQIDNO.8，針對hsa-miR-519b-3p的SEQIDNO.9，針對hsa-miR-602的SEQIDNO.10，針對hsa-miR-26a-5p的SEQIDNO.11，針對hsa-miR-199a-5p的SEQIDNO.12。在其中一個實施例中，所述P2序列選自：SEQIDNO.13～SEQIDNO.24；所述P5序列選自：SEQIDNO.37～SEQIDNO.48，所述P7序列選自SEQIDNO.61～SEQIDNO.72；所述P4序列中的所述間隔臂序列為3—10個T；所述P6序列的所述間隔臂序列為2—10個T；P8序列為polyT。在其中一個實施例中，所述polyT為3-10個T。在其中一個實施例中，所述P4序列選自：SEQIDNO.25～SEQIDNO.36，所述P6序列選自：SEQIDNO.49～SEQIDNO.60。在其中一個實施例中，所述一級信號放大探針中所述P4序列與P3序列之間的間隔臂序列選自5－20個T；二級信號放大探針中所述P5序列與P6序列之間的間隔臂序列選自5－10個T；三級信號放大探針中P7序列與P8序列之間的間隔臂序列選自3－10個T。在其中一個實施例中，所述熒光基團選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且針對不同目標核酸的熒光基團互不相同。本發明的主要優點在于：(1)本發明提供一種肝癌相關miRNA的檢測捕獲探針以及由其構成的檢測試劑盒，所述的捕獲采用的三明治結構(與靶標miRNA反向互補序列P1—間隔序列—與一級信號放大探針P3序列互補結合的P2序列)，與現有技術相比，該設計更為簡單，更具有實用性。而且本技術方案所設計的捕獲探針能夠實現特異性強、靈敏度高的特點。本發明所選擇的信號放大探針，是發明人經過大量試驗進行綜合評估、統計分析、多種參數的優化組合而得出的。(2)原位雜交方法本身具有熒光信號靈敏度低的缺點，但是本發明采用新型的原位雜交方法，通過信號放大體系提高熒光信號強度。本發明檢測流程能夠在8h內完成，單一拷貝的miRNA雜交探針通過信號放大系統，與相應的熒光探針結合，顯著提高miRNA原位雜交的檢測靈敏度。(3)本發明所設計的各種肝癌相關miRNA的探針，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，且各種探針之間不存在非特異性結合；所設計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統。(4)本發明使用的是探針的多位點特異配對、級聯放大的方式來實現信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現了檢測的特異性，避免了逆轉錄PCR和實時熒光定量PCR技術的假陽性。具體實施方式為了便于理解本發明，下面將對本發明進行更全面的描述。本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。除非另有定義，本發明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發明的
技術領域：
的技術人員通常理解的含義相同。本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發明。本發明所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1肝癌相關miRNA檢測試劑盒本實施例提供一種肝癌相關miRNA檢測試劑盒，包括有捕獲探針以及信號放大探針，信號放大探針包括有，一級信號放大探針、二級信號放大探針、三級信號放大探針。以上探針具有特異性強、靈敏度高的特點。1、捕獲探針捕獲探針是連接靶核酸與一級信號放大探針，每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的靶核酸結合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與一級信號放大探針結合P3互補配對的P2序列，針對不同目標基因的P2序列互不相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與特異性序列P1間隔開來，通過在探針內部設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。本發明捕獲探針的間隔臂優選為5－10個T，本實施例優選為5個T。本實施例針對hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p設計捕獲探針，具體如表1、表2：表1捕獲探針的P1序列表2捕獲探針的P2序列SEQIDNO.P2序列(5’→3’)SEQIDNO.P2序列(5’→3’)13GTCTATAGTG19GATGACAGTA14GATTCAGTGA20AGTACTTGTG15TTGAGTAATG21AGTCTTGAAG16TGTAATGAGT22TGATGAATTG17GATTAGTGAT23ATGACGATAG18GTAGATTAGT24TTGACGTGAA2、信號放大探針1)一級信號放大探針信號放大組分中包括一條或以上的一級信號放大探針，所述每條一級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P2序列反向互補配對結合的P3序列、間隔臂序列、P4序列，P3序列通過與捕獲探針P2序列的結合實現目標信號的級聯放大。本實施例中，所述P3序列為與P2序列反向互補的堿基序列。本發明P3與P4序列之間的間隔臂序列可以選自5－20個T，本實施例使用的間隔臂為 10個T。所述P4序列含有一個或以上與二級信號放大探針的P5序列反向互補的堿基片段，優選含有2～5個與P2序列互補配對的堿基片段，本實施例中，P4含有3個與P5反向互補的堿基片段，相同堿基片段之間設有間隔臂序列，所述間隔臂序列優選為3—10個T，本實施例中為設有3個T。表3一級信號放大探針的P4序列SEQIDNO.P4序列(5’→3’)25GATCTCTTTGATCTCTTTGATCTC26ATATCATTTATATCATTTATATCA27TATCTCTTTTATCTCTTTTATCTC28CACATCTTTCACATCTTTCACATC29TCACATTTTTCACATTTTTCACAT30ACATCATTTACATCATTTACATCA31CATCGATTTCATCGATTTCATCGA32TCAGTCTTTTCAGTCTTTTCAGTC33ACTCTCTTTACTCTCTTTACTCTC34ATCATCTTTATCATCTTTATCATC35ACATCCTTTACATCCTTTACATCC36TCAGTATTTTCAGTATTTTCAGTA2)二級信號放大探針本發明含有一條或以上的二級信號放大探針，所述二級信號放大探針從5’端到3’端依次為：與P4序列反向互補結合的P5序列、間隔臂序列、P6序列，所述P4含有一個或以上的P5序列反向互補堿基序列；本發明P5與P6序列之間的間隔臂序列可以選自5－10個T，本實施例使用的間隔臂為6個T。表4二級信號放大探針的P5序列SEQIDNO.P5序列(5’→3’)SEQIDNO.P5序列(5’→3’)37GAGATC43TCGATG38TGATAT44GACTGA39GAGATA45GAGAGT40GATGTG46GATGAT41ATGTGA47GGATGT42TGATGT48TACTGA所述P6序列含有一個或以上與三級信號放大探針的P7序列反向互補的堿基序列，優選含有2-5個與P7序列互補配對的堿基片段，本實施例中，所述P6序列含有三個與P7序列反向互補片段，相同堿基序列之間設有間隔臂序列，間隔臂序列優選為2—10個T，本實施例中為有2個T。表5二級信號放大探針的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)49CATGATTCATGATTCATGA50ACGACTTACGACTTACGAC51GACTCTTGACTCTTGACTC52CAGTTTTCAGTTTTCAGTT53ACATGTTACATGTTACATG54AGCATTTAGCATTTAGCAT55CTAGATTCTAGATTCTAGA56ACGTGTTACGTGTTACGTG57GACGATTGACGATTGACGA58GCTGATTGCTGATTGCTGA59TCTGATTTCTGATTTCTGA60GTATCTTGTATCTTGTATC3)三級信號放大探針本發明所述三級信號放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一個或以上與P7序列反向互補序列；所述P8序列5’端還修飾有熒光基團；本發明P7與P8序列之間的間隔臂序列可以選自3－10個T，本實施例使用的間隔臂為5個T。表6三級信號放大探針的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)SEQIDNO.P7序列(5’→3’)61TCATG67TCTAG62GTCGT68CACGT63GAGTC69TCGTC64AACTG70TCAGC65CATGT71TCAGA66ATGCT72GATAC本實施例中，P8序列為5個堿基的polyT序列，其5’端帶有熒光基團標記，熒光基團可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，針對不同目標核酸的熒光基團互不相同，即所選擇的熒光基團的顏色互不相同或發射波長互不相同，以便于區分不同類型的目標核酸。本發明所設計的信號放大探針，除上述條件限定的特定探針反向互補完全匹配的情況以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列為不存在發夾結構，探針內部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與整個檢測體系的其它核酸之間均不存在特異性結合的序列。實施例2一種肝癌相關miRNA檢測試劑盒本發明提供了一種肝癌相關miRNA檢測試劑盒，該試劑盒能夠檢測靶標miRNA包括：hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p等表達水平，在實際檢測中，能根據具體的需要，使用相應的P1～P8序列，組成檢測試劑盒，即可實現檢測。本實施例檢測試劑盒的組分包括有：捕獲探針、信號放大探針和熒光基團，具體探針組分見表7所示。本實施例所述檢測試劑盒，在使用時，隨機分成3組進行檢測。表7針對具體目標基因的檢測試劑盒(表格數字為SEQIDNO.)實施例3運用實施例2中的試劑盒對樣品進行檢測本實施例將使用實施例2的試劑盒，對肝癌細胞進行檢測。肝癌細胞來源為：肝癌細胞株HuH-7，本領域技術人員，根據細胞株名稱，即可在現有產品中獲得相關的細胞株。所述各種溶液的配方如下：本實施例中的信號放大探針混合液均使用實施例3相應列表中的全部探針。一、樣本預處理，將CTCs過濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清。2.加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實驗操作。三、消化細胞，暴露miRNA，使其與探針雜交1.配制相應濃度的消化酶工作液：試劑組分每個樣本用量消化酶1.25μLPBS48.75μL總體積50μL2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實驗操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標miRNA序列結合1.捕獲探針混合液、探針緩沖液使用前需40℃水浴預熱20min。2.配制捕獲探針工作液：試劑組分每個樣本用量捕獲探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中捕獲探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1mlRI洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。五、目標mRNA序列信號放大1.探針緩沖液使用前需40℃水浴預熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個樣本用量信號放大探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。六、顯色，熒光標記目標信號1.顯色緩沖液(40℃預熱)避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色緩沖液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。七、熒光顯微鏡觀察CTCs本發明的對照品使用DAPI作為細胞核熒光基團，其發射藍色熒光信號。1.將濾膜細胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內環將濾膜割下，加10μL抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過20倍物鏡計數CTC異性核數量。3.根據10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結果，并拍照記錄結果。4.然后再根據10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結果并視野拍照記錄結果。5.重復操作至拍完所有的異性核，數量與20倍物鏡計數結果一致。顯微鏡使用通道如下：表8熒光基團的激發波長和發射波長八、檢測結果判斷及分析1.陽性肝癌細胞鑒定標準在濾膜上，富集有肝癌細胞，肝癌細胞陽性的判定標準為：1)具有相應靶標miRNA特異性標識物，在本試劑盒中表現為在相應的熒光通道下顯示熒光信號點。2)細胞核DAPI染色陽性。3)肝癌細胞核形狀不規則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細胞大小與濾膜孔大小相近。2.使用上述檢測方法，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個肝癌細胞的相應顏色的miRNA熒光點數量，并計算平均點數，具體結果為：表9樣本檢測結果(熒光信號點數)實施例4試劑盒的穩定性1、試劑盒穩定性檢測本發明提供一種肝癌相關miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同數量的捕獲探針，組成相應的探針混合液，從而實現不同數量肝癌相關miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例2的探針組Group1組成的試劑盒，對三組不同細胞株來源的15種樣本(每種細胞株5個樣本)中的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p表達情況進行檢測，從而評估本發明試劑盒的穩定性。2、關于檢測樣本來源本實施例使用肝癌的3中不同的細胞株來源的肝癌細胞作為檢測對象，從而驗證其有效性和穩定性(可重復性)，具體細胞株和樣本如表10所示，本領域技術人員，根據細胞株名稱，即可在現有產品中獲得相關的細胞株。實驗步驟參考實施例3。表10細胞株和檢測樣本樣本號肝癌細胞株實驗組樣本16～樣本20HuH-7Group4樣本21～樣本25HepG2Group5樣本26～樣本30QGY-7701Group63、檢測結果使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個肝癌細胞的相應顏色的miRNA熒光點數量，并計算平均點數，具體結果為：表11樣本檢測結果(熒光信號點數)從上述檢測結果可見，一方面，不同細胞株來源的樣本，其檢測結果不同，因此，本發明是能夠實現不同miRNA表達水平檢測的，是有效的；另一方面，相同細胞株來源的5個樣本，其hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p等4中miRNA的熒光點數檢測結果相近(±3)，具體見Group4(樣本16～20)、Group5(樣本21～25)或Group6(樣本26～30)，因此，本試劑盒重復性好；由此可見，本發明試劑盒是有效的，穩定性可靠的，其它針對不同miRNA種類的試劑盒，其結果依然穩定可靠，具體數據省略。實施例5靶標miRNA數量選擇1、試劑盒制備的設計(捕獲探針數量的選擇)本發明提供一種靶標miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同數量的捕獲探針，組成相應的探針混合液，從而實現不同數量miRNA的并行檢測。本實施例分別針對1種、3種、5種、7種miRNA，選用捕獲探針，信號放大探針選擇一級信號方法探針、二級放大探針以及三級信號放大探針，組成檢測試劑盒，對同一細胞株HuH-7來源的樣本進行檢測，對比其檢測效果，具體組成如表12，所述探針選自實施例1～2，實驗步驟參考實施例3。表12選擇不同數量靶標miRNA的捕獲探針(表格數字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個肝癌細胞的相應顏色的miRNA熒光點數量，并計算平均點數，具體結果為：表13樣本檢測結果(熒光信號點數)通過上述4組實驗對比可知，本試劑盒可以針對不同數量的靶標miRNA進行檢測，使用1條、3條和5條、7條的針對不同miRNA捕獲探針均可完成檢測，特異性和穩定性都很好。其它針對標志基因的使用不同數量捕獲探針的試劑盒，其結果依然穩定可靠，具體數據省略。實施例6標記探針的選擇1、試劑盒制備的設計(信號放大探針組合的選擇)本發明提供一種肝癌相關miRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的目標檢測miRNA，選取不同信號探針組合，組成相應的探針混合液，從而實現miRNA的并行檢測。本實施例將使用實施例1的所提供的各級信號放大探針組成的試劑盒，對同一細胞株(HuH-7)來源的5個樣本中的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-326和hsa-miR-181b-5p表達情況進行檢測，從而評估本發明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信號放大探針的適用性。具體的試劑盒組成如下：表14不同信號放大探針組合(表格數字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對每個樣本進行檢測(應用實施例3所述檢測方法)和觀察，其中，針對細胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標檢測miRNA標志物的熒光信號強度，分別讀取每個樣本中10個肝癌細胞的相應顏色的miRNA熒光點數量，并計算平均點數，具體結果為：表15不同信號放大探針組合的檢測結果通過上述3組實驗對比可知，使用不同信號探針組合組成的試劑盒對miRNA進行檢測，其檢測結果相一致，除了本實施例檢測的miRNA以及其放大探針組合外，本發明所提供的其他miRNA以及其他信號放大探針的組合，同樣能實現本實施例的檢測效果，具體試驗結果省略。由此可知，本發明提供的信號放大探針可以根據實際操作需要進行任意搭配，并且能實現本發明所述的miRNA檢測，其檢測結果一致，說明本發明所提供的信號放大探針對于肝癌相關miRNA檢測具有良好的適用性。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁1 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