血葉蘭種子的組織培養與快速育苗方法
【技術領域】
[0001]本申請涉及一種血葉蘭種子的組織培養與快速育苗方法，應用在保護血葉蘭資源和生產血葉蘭種苗上。
【背景技術】
[0002]血葉蘭Ludisia discolor (Ker-Gawl.)A.Rich.是蘭科血葉蘭屬植物，全屬有4種，我國僅有I種，即血葉蘭。其分布于海拔900-1300米山坡或溝谷常綠闊葉林下陰濕處，根莖呈匍匐狀，形似蠶，莖節生根，葉呈紫黑色，上有細小的絨毛，有金紅色或銀白色脈紋，似絲絨狀，十分美麗，具有較高的觀賞價值。同時它又是民間傳統的中草藥，全草入藥，有滋陰潤肺、清熱涼血之功效，能治療肺結核咯血、神經衰弱、食欲不振等癥，療效甚佳。由于血葉蘭兼具觀賞和藥用價值，具有很好的市場開發潛力。隨著人們過度采挖以及生態環境被破壞，血葉蘭野生資源越來越稀少，屬珍稀的物種之一，已有瀕臨滅絕的危險。
[0003]目前，血葉蘭種苗的繁殖方法有分株繁殖和扦插繁殖，繁殖速度慢，難以滿足規模化種植需求，因此，急需應用植物組織培養方法進行血葉蘭種苗的快速繁殖。有關血葉蘭組織培養方法已有報道，一種方法是以莖段和頂芽作為外植體，通過誘導產生類原始球莖、類原始球莖增殖、類原始球莖分化及壯苗和生根培養的途徑來繁殖試管苗，該方法通過誘導莖段或頂芽組織產生類原始球莖，其分化率不詳，類原始球莖的增殖倍數為4.86,88.6%的類原始球莖可分化成不定芽；另一種是采用八九分成熟的蒴果進行種子的無菌繁殖，但該方法未見詳細的培養途徑的報道。血葉蘭是蘭科植物，其種子由于胚發育不完全，自然狀態下極難萌發，而且血葉蘭的果實與其他蘭科植物的果實發育周期不同，血葉蘭的果實發育周期短、同個果實中的種子成熟度不一致，導致了種子壽命短和大量敗育，因此，急需研究開發利用血葉蘭種子的組培快速育苗方法，為進行人工栽培保護血葉蘭資源提供種苗。
【發明內容】
[0004]本申請提供一種血葉蘭種子的組織培養與快速育苗方法，解決了血葉蘭在自然狀態下難萌發以及果實發育周期短導致種子成熟度不一致、種子壽命短和大量敗育的問題，開發一種可快速繁殖血葉蘭種苗的方法。該方法取材方便且成功率高，可用于挽救種子發育不一致的血葉蘭果實，生產大量的血葉蘭種苗，更好地保護血葉蘭資源。
[0005]本申請申請技術方案如下:
[0006]—種血葉蘭種子的組織培養與快速育苗方法，其特征在于:其步驟包括，
[0007]I)選擇培養材料:于血葉蘭開花期，選擇生長健壯的優良株系進行同株或異株授粉，授粉25-40天后，摘取果實外表顏色為白色或淡黃色且未開裂的果實作為培養材料用于組織培養；或者用野外采集到的野生血葉蘭植株上的果實外表顏色為白色或近黃色且未破裂的蒴果用于組織培養；
[0008]2)原始球莖的誘導培養:包含以下步驟
[0009]①消毒處理:將步驟I中選取的果實先用質量百分比濃度為80-95%的酒精浸泡30-50s后，用無菌水沖洗干凈，接著進行二次消毒；所述二次消毒是將果實先倒入質量百分比濃度為0.01-0.02 %的吐溫20溶液中，搖晃10-20S后，夾出果實，置于質量百分比濃度為10-15%次氯酸鈉溶液中消毒8-12min，或者將果實置于吐溫20和次氯酸鈉的混合溶液中消毒8-12min并用無菌水沖洗干凈，所述吐溫20和次氯酸鈉的混合溶液中，吐溫20的質量百分比濃度為0.01-0.02%，次氯酸鈉的質量百分比濃度為10-15% ;
[0010]②萌發培養處理:將步驟①消毒處理過的果實用無菌水沖洗干凈后用無菌解剖工具剖開果實，取出白色漿狀或粉狀種胚接種到胚萌發培養基上，將接種后的培養瓶置于溫度20-28°C的培養室內進行無光照培養20-30天，誘導種胚萌發成原始球莖，再轉入溫度20-25°C、光照強度為1600-22001x的條件下培養15-30天以強壯原始球莖，同時誘導種胚繼續萌發原始球莖；
[0011]所述的胚萌發培養基由以下組分配置而成:MS基本培養基+ 土豆泥20_50g/L+椰子水30-80ml/L+脯氨酸5-lOmg/L+蔗糖20_30g/L+瓊脂或卡拉膠5.0-8.0g/L，pH值為5.0-5.4 ；
[0012]3)原始球莖的增殖培養:將上述步驟2中獲得萌發的原始球莖轉入原始球莖增殖培養基中進行增殖培養，在培養溫度20-25°C，光照強度1500-20001x，光照時間8_12h/天的條件下，培養30-60天以誘導原始球莖的增殖；
[0013]所述的增殖培養基由以下組分配置而成:MS基本培養基+6-BA或6-糠氨基嘌呤 KT 0.5-2.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+ 椰子水 30_60ml/L+ 白糖 20_30g/L+ 瓊脂或卡拉膠
4.5-5.5g/L，pH 值為 5.0-5.4 ；
[0014]4)分化與壯苗培養:將上述步驟3中獲得的原始球莖轉入分化與壯苗培養基中，培養溫度20-28°C，光照強度2000-25001x，光照時間8_12h/天，培養60-90天，使得原始球莖分化形成健壯的具根、莖、葉的完整血葉蘭植株；
[0015]所述的分化與壯苗培養基由以下組分配置而成:1/2MS基本培養基+ΝΑΑ0.2-0.5mg/L+ 香蕉泥 50_80g/L+ 白糖 20_40g/L+ 活性炭 0.5-3.0g/L+ 瓊脂或卡拉膠
5.0-8.0g/L, pH 值為 5.2-5.6。
[0016]該血葉蘭種子的組織培養快速育苗方法采用了與現有血葉蘭組培育苗方法不同的是外植體和培養途徑。而現有血葉蘭的組織培養方法，多選用莖段或頂芽為外植體，誘導產生類原始球莖；或者采用八九分成熟的蒴果進行種子的無菌繁殖，但培養途徑不詳。本申請的血葉蘭種子的組織培養快速育苗方法不僅取材方便，而且經分化與壯苗培養步驟，能誘導約94%的原始球莖分化形成健壯的血葉蘭幼苗完整植株，對血葉蘭的資源保護意義重大。
[0017]步驟2的第①步消毒處理是將步驟I中選取的果實先用質量百分比濃度為80%的酒精浸泡35s后，用無菌水沖洗干凈，接著進行二次消毒；所述二次消毒是將果實先倒入質量百分比濃度為0.01%的吐溫20溶液中，搖晃15s后，夾出果實，置于質量百分比濃度為10%次氯酸鈉溶液中消毒lOmin，或者將果實置于吐溫20和次氯酸鈉混合溶液中消毒1min,所述吐溫20和次氯酸鈉混合溶液中，吐溫20的質量百分比濃度為0.01 %，次氯酸鈉的質量百分比濃度為10%。經上述消毒步驟后，其組織培養的染菌率明顯降低。
[0018]步驟2中的原始球莖萌發培養基由以下組分配置而成:MS基本培養基+ 土豆泥50g/L+椰子水30ml/L+脯氨酸8mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂或卡拉膠5.8g/L，pH值為5.4。使用上述原始球莖萌發培養基可以提高原始球莖的誘導萌發率。
[0019]步驟2中接種后置于無光照條件下以誘導種胚萌發成原始球莖的培養天數為25天，強壯原始球莖使用的光照強度為18001x，培養天數為20天。這樣可以提高原始球莖的誘導萌發率。
[0020]步驟3中增殖培養以誘導原始球莖增殖的培養溫度為22±2°C，光照強度為18001x，光照時間為1h/天，培養天數為50天。這樣可以更好地促進原始球莖的增殖。
[0021]步驟3中所述的增殖培養基由以下組分配置而成:MS基本培養基+6-BA或6_糠氨基嘌呤Κ??.8mg/L+NAA0.3mg/L+椰子水50ml/L+白糖30g/L+瓊脂或卡拉膠4.5g/L，pH值為5.4。使用上述原始球莖增殖培養基可以促進原始球莖的增殖。
[0022]步驟4中原始球莖轉入分化與壯苗培養基中誘導原始球莖分化形成健壯的完整植株，培養溫度為20-28°C，光照強度為25001x，光照時間為8h/天，培養天數為80天。上述培養條件可以促進原始球莖的分化和生長。
[0023]步驟4中所述的分化與壯苗培養基由以下組分配置而成:1/2MS MS基本培養基+ΝΑΑ0.3mg/L+香蕉泥80g/L+白糖25g/L+瓊脂或卡拉膠6.0g/L, pH值為5.6。上述分化與壯苗培養基可以更好地促進原始球莖的分化和生長。
[0024]本申請不同于現有的血葉蘭組培育苗的方法，其優點在于:
[0025]①本申請中利用血葉蘭發育不一致的種子為外植體，節省了植株材料且取材方便，通過種子誘導萌發形成原始球莖，再通過原始球莖增殖、分化和壯苗培養，不僅能實現種苗的快速繁殖，還能挽救由于果實發育速度快、種子壽命短導致種子成熟度不一致及大量敗育等現象，最大可能挽救和保護了血葉蘭資源。
[0026]②采用本申請所述的培養方法得到的84%以上血葉蘭種子萌發，血葉蘭原始球莖的增殖系數達到1