生物條形碼檢測中的np探針、其制備方法與生物條形碼檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域中的生物條形碼檢測技術，特別是涉及其中的一種與NP 探針聯結的單鏈條形碼DNA、新型NP探針、該探針的制備以及基于該新型NP探針形成的生 物條形碼檢測試劑盒，本發明可用于與該單鏈條形碼DNA無核酸序列同源性的病毒抗原的 高靈敏度檢測。
【背景技術】
[0002] 生物條形碼檢測技術（bio-bar codes assay，BCA)于2003年Mirkin等開發以 來，為分子診斷領域，尤其是微量蛋白質檢測提供了一個全新的技術平臺（Nam JM，Thaxton CS,Mirkin CA. Nanoparticle-based bi〇-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science，2003, 301 (5641) : 1884-1886)。該技術檢測蛋白的原理是利用標記 被檢物單抗的磁性微球（magnetic microparticles，MMP)、標記被檢物多抗和條形碼DNA 鏈的金納米顆粒（nano-particle，NP)，通過形成MMP-被檢物-NP三明治復合物，利用磁場 進行分離，洗脫釋放NP上標記的條形碼DNA鏈，通過PCR或銀染法鑒定就可確定被檢物的 存在。
[0003] BCA技術中，NP探針標記有雙鏈DNA (48bp)和病原的多克隆抗體，雙鏈DNA 的其中一條和膠體金顆粒通過Au-S鍵相連，另一條和前者互補是用來指示被檢物的 條形碼DNA，每一個直徑為30nm的膠體金上大約標記有400條左右的條形碼DNA鏈 (Hurst SJ, Lytton-Jean AR, Mirkin CA. Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes. Anal Chem, 2006, 78:8313-8318) ;MMP探針是對應于分選磁場的直徑 約為1 μ m的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的單克隆抗體。BCA技術通過抗原抗體高度 特異性反應捕獲抗原，再通過檢測條形碼DNA而實現對被檢物的間接檢測，由于雙鏈DNA標 記的一次放大以及PCR反應和芯片檢測的二次放大效應，使檢測靈敏度得到極大提高。
[0004] 發明人所在實驗室對傳統BCA技術進行了改進，先后建立了用于藍舌病病毒檢測 的新型 BCA 檢測技術（Yin HQ，Jia MX，Yang S，Jing PP，Wang R, Zhang JG. Development of a highly sensitive gold nanoparticle probe-based assay for bluetongue virus detection. Journal of Virological Methods, 2012, 183(1) :45-48)以及蓖麻毒素檢測 的新型 BCA 檢測技術（Yin HQ, Jia MX, Shi LJ, Liu J, Wang R, Lv MM, Ma YY, Zhao X, Zhang JG. Evaluation of a novel ultra-sensitive nanoparticle probe-Based assay for ricin detection. Journal of Immunotoxicology, 2013, early online: 1-5)，其中蓖麻毒 素新型BCA檢測方法申報并獲得了國家發明專利（ZL201010530075. 2, 2013-06-19,申請日 2010-10-29)〇
[0005] 在上述新型BCA檢測技術中，標記的條形碼DNA鏈改進為單鏈，其長度為90個堿 基（如序列表中SEQ ID No :5所示），其長度適于進行TaqMan探針法的熒光定量PCR檢 測，但是這一長度的DNA鏈容易在NP探針表面形成彎曲折疊結構，從而不利于后續基于抗 原-抗體反應的NP-被檢物-MMP免疫復合物的形成。此外，NP探針制備中，僅采用離心法 去除未標記到NP上的游離條形碼DNA，這一制備方法不易去除游離條形碼DNA，而游離條形 碼DNA的殘留會導致BCA檢測的假陽性結果。
【發明內容】
[0006] 針對現有BCA檢測技術中存在的不足，本發明目的在于改進BCA檢測技術，提供一 種新型NP探針以及該探針的制備方法。
[0007] 本發明首先提供一種生物條形碼檢測中與NP探針聯結的單鏈條形碼DNA，所述條 形碼DNA長度少于90堿基仍適用于熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測的長度，優選為60 個堿基。
[0008] 具體的，該單鏈條形碼DNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :1所示。
[0009] 本發明進一步提供一種生物條形碼檢測中的NP探針，其金納米顆粒上包被有如 上所述的長度少于90堿基的單鏈條形碼DNA。
[0010] 所述生物條形碼檢測中的NP探針中，金納米顆粒上還包被有被檢病原的多抗，所 述被檢病原的核酸序列與所述單鏈條形碼DNA無同源性。例如丙型肝炎病毒核酸序列與單 鏈條形碼DNA無同源性，因而可對丙型肝炎病毒進行檢測，可采用抗丙型肝炎病毒的多抗 進行包被，同理，也可采用乙型肝炎病毒多抗標記以用于乙型肝炎病毒抗原的檢測。
[0011] 本發明提供一種生物條形碼檢測中NP探針的制備方法，包括以下步驟：1)合成所 述的單鏈條形碼DNA ;2)在金納米顆粒上分別標記被檢病原的多抗和所述單鏈條形碼DNA ; 3)用脫氧核糖核酸酶（DNase I )降解未標記上的游離單鏈條形碼DNA ;由此得到NP探針。
[0012] 以上所述生物條形碼檢測中NP探針的制備方法，所述步驟3)的過程為：將1體積 的DNase I (100U)、1體積的25mM MgCl2、1體積的小牛血清和5體積的0.0 lM PBS混合均 勻，加入2體積的步驟2)得到的標記有多抗和DNA的納米金顆粒PBS重懸液中，37°C孵育 2h，4°C、13000g離心10min，去除上清，0.0 lM PBS重懸沉淀得到去除了游離單鏈條形碼DNA 的NP探針，4 °C保存。
[0013] 本發明進一步目的在于提供一種基于該新型NP探針形成的用于新型生物條形碼 檢測的廣品。
[0014] 此類產品可以為生物條形碼檢測中的MMP-核心抗原-NP三明治復合物，是將所述 NP探針、MMP探針和被檢病原抗原通過抗原、抗體作用制備得到，所述MMP探針為標記有抗 被檢病原單抗的磁珠。
[0015] 此類產品還可以為生物條形碼檢測試劑盒，其中包括所述NP探針、標記有抗被檢 病原單抗的MMP探針以及用于實時熒光定量PCR檢測的引物對和TaqMan熒光探針。
[0016] 具體的，該生物條形碼檢測試劑盒中，用于實時熒光定量PCR檢測的引物對的上 游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :3所示，TaqMan熒光探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :4所示。
[0017] 以上單鏈條形碼DNA、NP探針、MMP-核心抗原-NP三明治復合物或試劑盒可用于 核酸序列與所述單鏈條形碼DNA無同源性的病原的抗原檢測。
[0018] 具體的，所述試劑盒為丙型肝炎病毒核心抗原生物條形碼檢測試劑盒，其中包含： 包被有抗丙型肝炎病毒核心抗原多抗和條形碼DNA的NP探針、包被有抗丙型肝炎病毒核心 抗原單抗的MMP探針以及用于實時熒光定量PCR檢測的引物和TaqMan熒光探針。
[0019] 以丙型肝炎病毒核心抗原的檢測為例，基于本發明的新型生物條形碼檢測是在普 通生物條形碼檢測方法的基礎上，將單鏈條形碼DNA的長度改為60堿基，其長度可適用于 熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢測，三明治反應復合物中條形碼DNA鏈不用解離，直接用 基于TaqMan熒光探針的實時熒光定量PCR方法對三明治反應復合物中條形碼DNA鏈進行 定性、定量檢測。此外，在NP探針制備中，采用脫氧核糖核酸酶（DNase I )處理來降解未 標記上的游離條形碼DNA，從而避免檢測中存在的假陽性。
[0020] 具體來講，丙型肝炎病毒核心抗原的新型生物條形碼檢測可包括以下步驟：
[0021] (I)NP探針的制備：設計長度為60堿基的適用熒光定量PCR/TaqMan熒光探針檢 測的單鏈條形碼DNA，在金納米顆粒上分別標記抗丙型肝炎病毒核心抗原的多克隆抗體和 條形碼DNA，然后用脫氧核糖核酸酶（DNase I )降解未標記上的游離條形碼DNA，以避免檢 測結果存在假陽性，得到NP探針；
[0022] (2)MMP探針的制備：在磁性微球（磁珠）上標記抗丙型肝炎病毒核心抗原的單 抗，得到MMP探針；
[0023] (3)條形碼DNA檢測：將NP探針、MMP探針和丙型肝炎病毒核心抗原通過抗原、抗 體作用制備三明治復合物，然后經磁場分離純化后，將復合物上標記的條形碼DNA直接進 行基于TaqMan熒光探針的實時熒光定量PCR檢測，以對丙型肝炎病毒核心抗原進行定性、 定量檢測。
[0024] 在上述丙型肝炎病毒核心抗原的新型生物條形碼檢測方法中，所述步驟（1)中金 納米顆粒的直徑可為15_30nm，優選為15nm ;優選的用于基于金納米探針的丙型肝炎病毒 核心