培養至對數生長期的細胞胰蛋白酶消化，收集于離心管中并計數，離心。
[0041] 2)棄除胰蛋白酶及舊的培養液，加入配置好的凍存培養液（含10% DMS0,40% DMEM和50% Gibico胎牛血清），凍存液中細胞的最終濃度為0. 5-1 X 107/ml。用吸管輕輕 吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中，每管加1-1. 5ml。
[0042] 3)將凍存管放入凍存盒置_80°C速凍，5小時后移入液氮罐中保存。
[0043] 4.藥物準備：
[0044] TT28溶于DMSO (二甲基亞砜），配制成IOOmM或50mM的母液備用。
[0045] 實施例1MTS法測定TT28對肝癌細胞的生長抑制作用
[0046] SK-HEPl細胞（購自中國科學院細胞庫）3 X IO3/孔接種至96孔板，培養24小時 使之貼壁后加入TT28 (購自中國科學院上海藥物研究所），設6個濃度梯度，每個濃度設3 個復孔。細胞在37°C，5% CO2條件下培養72小時后，倒掉培養液，用MTS試劑盒（Promega 公司）測定細胞存活率。
[0047] 測試方法為：將細胞用無血清培養基洗一遍，按照100 μ Ι/well的量加入預先配 制好的MTS顯色溶液（10ml無血清培養基中加入2ml溶液1和100 μ 1溶液2,充分混勻）。 將一個沒有細胞的孔設為本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把細胞放入細胞培養箱中 繼續培養2~4小時，然后用酶標儀讀取光吸收值（參考波長630-700nm，測定波長490nm)， 計算細胞存活率，以測定孔光吸收值/對照孔光吸收值作為細胞存活率的數值。根據細胞 存活率，計算TT28對Sk-h印1細胞的IC50值。
[0048] IC50是指被抑制一半時抑制劑的濃度。這里即為SK-HEPl細胞數量為對照的一半 時TT28的濃度。IC50的計算一般需要測定5個以上的劑量效應，再通過曲線擬合得到函數 計算而得。
[0049] 結果：TT28對Sk-h印1細胞的IC50值為4. 50 μ M。
[0050] 用同樣的方法測試QGY細胞（購自中科院細胞庫），結果ΤΤ28對QGY細胞的IC50 值為約23. ΙΟμΜ ;對Focus細胞的IC50值為約2. 90μΜ，對h印-G2細胞的IC50值為約 11.0(^]?，對511(：-7721 細胞的1050值為約9.37 4]\1。
[0051] 實施例2TT28對人白血病細胞的生長抑制作用
[0052] 利用cck-8試劑盒（日本同仁化學研究所）檢測。
[0053] 步驟：
[0054] 1)將K562細胞（購自中國科學院細胞庫）均勻的種在96孔板里，每孔細胞數為 IO4 個。
[0055] 2)待貼壁，過夜后加藥，加藥（TT28濃度分別為50、16. 67、5. 56、1.85、0. 62μΜ)， 每個濃度有3個復孔。
[0056] 3)培養48小時，將完全培養基替換成無血清培養基與CCK8的混合物（10 :1)，于 37°C培養箱孵育2小時。
[0057] 4)以450nm為測量波長，以650nm為對照波長，于酶標儀上測出讀數。
[0058] 結果：TT28 對 K562 細胞的 IC50 值為 2. 49 μ M。
[0059] 實施例3ΤΤ28對人胰腺癌細胞的生長抑制作用
[0060] 按照實施例2的方法檢測ΤΤ28對人胰腺癌細胞的生長抑制作用。
[0061] 結果顯示，ΤΤ28對人胰腺癌細胞PANC-I的IC50值為L 83 μ Μ。
[0062] 實施例4ΤΤ28對人肺腺癌細胞的生長抑制作用
[0063] 按照實施例2的方法檢測ΤΤ28對人肺腺癌細胞的生長抑制作用。
[0064] 結果顯示，ΤΤ28對人肺腺癌細胞Α549的IC50值為5. 67 μ Μ。
[0065] 實施例5ΤΤ28對人胃癌細胞的生長抑制作用
[0066] 按照實施例2的方法檢測ΤΤ28對人胃癌細胞的生長抑制作用。
[0067] 結果顯示，ΤΤ28對HGC細胞的IC50值為2. 86 μ Μ。
[0068] 實施例6ΤΤ28對人乳腺癌細胞的生長抑制作用
[0069] 按照實施例2的方法檢測ΤΤ28對人乳腺癌細胞的生長抑制作用。
[0070] 結果顯示，ΤΤ28對人乳腺癌細胞MCF-7的IC50值為3. 36 μ Μ。
[0071] 實施例7ΤΤ28對人宮頸癌細胞的生長抑制作用
[0072] 按照實施例2的方法檢測ΤΤ28對人宮頸癌細胞的生長抑制作用。
[0073] 結果顯示，ΤΤ28對人宮頸癌細胞宮頸的IC50值為4. 41 μ Μ。
[0074] 實施例8細胞周期的檢測
[0075] 取SMMC-7721細胞3X105細胞接種于60mm細胞培養皿。梯度藥物處理后， 37°C C02培養箱培養24h。將細胞培養液和細胞收集入離心管中，1000 rpm離心10min，棄上 清。細胞用2ml預冷的IXPBS洗1次，1000 rpm離心10min，棄上清。用70%預冷的乙醇 4°C固定2h或者更長時間。1000 rpm離心10min，小心吸掉上清。用500 μ I PI染液重懸， 室溫暗處染色20min，膜過濾后用流式細胞儀檢測細胞周期變化情況。
[0076] 結果顯示，TT28有明顯的促凋亡效果。
【主權項】
1. (5β，7α，9β，10α)-7, 14-二羥基-16-烯-3, 15-二酮在制備抗腫瘤藥物中的應 用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤是肝癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌、 胰腺癌、宮頸癌或者血癌。3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物。4. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗胰腺癌藥物。5. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗肺腺癌藥物。6. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是周期阻滯藥物。7. -種抑制體外腫瘤細胞增殖的方法，其特征在于，將ΤΤ28加入腫瘤細胞的培養液 中；所述的腫瘤細胞是肝癌細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、胰腺癌細胞、宮頸癌細胞、肺腺癌 細胞或者胰腺癌細胞。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，加入（5β，7α，9β，10α)-7, 14-二羥 基-16-烯-3, 15-二酮的終濃度為0. 1-50 μ Μ。9. 一種周期阻滯藥物，其特征在于，所述的周期阻滯藥物的活性成分是 (5 β，7 α，9 β，10 α )-7, 14-二羥基-16-烯-3, 15-二酮。10. 權利要求9所述的周期阻滯藥物的應用，其特征在于，所述的藥物適用的腫瘤是肝 癌、肺腺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌或者血癌。
【專利摘要】本發明屬于化工領域及醫藥領域，涉及(5β,7α,9β,10α)-7,14-二羥基-16-烯-3,15-二酮在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明提供了(5β,7α,9β,10α)-7,14-二羥基-16-烯-3,15-二酮在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述的腫瘤細胞包括肝癌細胞、肺腺癌細胞和胰腺癌細胞。(5β,7α,9β,10α)-7,14-二羥基-16-烯-3,15-二酮屬于天然產物，毒副作用小、生物利用度高、性質穩定,具有臨床使用價值。本發明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分進行開發，抑瘤效果明顯，綠色環保，將為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
【IPC分類】A61P35/02, A61P35/00, A61K31/122
【公開號】CN105520923
【申請號】CN201410571223
【發明人】唐麗莎, 余龍, 金曉鋒, 王煜棋, 解放
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2014年10月23日