一種Cerrena來源的漆酶的高效表達方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種Cerrena來源的漆酶的高效表達方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 漆酶(EC. 1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，對各種酚類、芳胺及其衍生物都具有 催化氧化作用，并且在小分子助劑存在的情況下可以氧化降解一些不含酚羥基的酚類化合 物。1883年由日本人吉田首次從日本漆樹的汁液中分離而得名，漆酶自發現以來一直是紡 織、化學、生物學和環境科學等領域十分活躍的研究熱點，在紙漿生物漂白、有機染料脫色、 工業廢水處理和高分子催化合成等方面表現出很大的研究價值和應用潛力。
[0003] 目前認為，漆酶是一種普遍分布于植物、昆蟲、真菌和細菌中的重要酶，大部分漆 酶來自植物和真菌。真菌漆酶具有來源廣泛、單電子氧化還原電位高、催化活性強等特點， 而且既能催化底物的氧化聚合又能對木質素進行催化降解，比植物漆酶具有更廣泛的應用 前景和價值。Cerrena來源的漆酶產量高，且比多數其他真菌來源的漆酶基因的熱穩定性更 好，對某些有機物如乙醇的抗性更強。因此，進行Cerrena來源的漆酶的大量表達對擴展漆 酶的應用具有重要作用。
[0004] 但是，利用絲狀真菌生產漆酶還存在一些問題，如發酵周期長、培養基要求高、酶 活力低，菌絲在發酵罐中易受高剪切力的損傷。解決的辦法只有通過克隆出漆酶基因然后 進行異源表達以提高產量。此外，通過異源表達還可以利用定點突變來提高漆酶的理化性 質如較高的氧化還原電位，更接近于中性的最適反應pH值及較高的熱穩定性等。
[0005] 眾所周知，基因的異源表達受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的影響。有些雖 有蛋白條帶但沒檢測不到酶活等。因此，如何實現Cerrena來源的漆酶的異源表達、活性表 達、高效表達是目前亟需解決的問題。
【發明內容】
[0006] 為了克服上述問題，本發明提供了一種Cerrena來源的漆酶的活性表達、高效表達 方法，是將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的漆酶在畢赤酵母菌中進行表達。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述畢赤酵母是P.pichia GS115。
[0008] 在本發明的一種實施方式中，所述表達是以PPIC9K為表達載體進行表達。
[0009]在本發明的一種實施方式中，所述方法，具體是將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的漆 酶基因克隆到表達載體PPIC9K上得到重組載體，然后再轉化到畢赤酵母P.pichia GS115中 進行表達。
[0010] 本發明的第二個目的是一種畢赤酵母基因工程菌，所述工程菌表達核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 的漆酶。
[0011] 在本發明的一種實施方式中，所述畢赤酵母基因工程菌，是以P.pichia GS115為 宿主、PPIC9K為載體表達SEQ ID N0.1的漆酶基因。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述畢赤酵母基因工程菌的構建方法：（1)化學合成 法合成SEQ ID NO. 1所示的基因片段；（2)將基因片段連接到pPIC9K上得到重組載體 pPIC9K-Lcc3' ；（3)將重組載體線形化后電轉入P.pichia GS115,篩選陽性克隆并驗證，即 得到畢赤酵母基因工程菌。
[0013] 本發明的第三個目的是提供利用所述畢赤酵母基因工程菌發酵生產漆酶的方法， 是將基因工程菌在BMGY培養基中，溫度30°C、轉速220rpm下培養至0D 2~6,離心收集菌體， 重懸于BMMY培養基中，在溫度30°C、轉速220rpm下培養，添加甲醇和Cu2+誘導表達，發酵上清 即含有漆酶。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述甲醇的添加方式為每24h添加0.5%的甲醇。 [0015]在本發明的一種實施方式中，所述0.5%的甲醇，是指每100mL發酵液中添加0.5mL 甲醇。
[0016] 本發明的有益效果：
[0017] 本發明實現了 Cerrena來源的漆酶的活性表達、高效表達。而且本發明使用畢赤酵 母表達系統來表達漆酶Lcc3 '，還具有遺傳穩定、表達水平高、蛋白可翻譯后加工、產物可分 泌、可高密度發酵等許多優點。
【附圖說明】
[0018] 圖1:甲醇誘導畢赤酵母表達外源基因 Lcc3和Lcc3 '的胞外上清漆酶活力曲線；
[0019] 圖2:重組漆酶Lcc3和Lcc3' 的SDS-PAGE圖。
【具體實施方式】
[0020] 重組漆酶酶活測定
[0021] (1) ImM的ABTS配制：準確稱取0.02743g的ABTS用蒸餾水定容至50mL，放于棕色瓶 中，4 C冰箱中保存備用；
[0022] (2)0.1M的pH3.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的配制:分別準確稱取檸檬酸、檸檬酸 鈉3.3622g、1.1765g與燒杯，并用蒸餾水定容至200mL，4°C冰箱中保存備用；
[0023] (3)粗酶液的制備:發酵液8000g離心10min，取上清作為粗酶液，備用；
[0024]重組漆酶酶活測定方法：
[0025]取上述（1)中ABTS 0.5mL，（2)中檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.4mL，于30°C水浴鍋中 保溫5min后，加入0. lmL上述(3)所述的粗酶液，在420nm處測3min內吸光度的變化。
[0026]漆酶活力計算公式：
[0028] AOD/At:每分鐘吸光值的變化。
[0029] ε :顯色物的摩爾消光系數(mM-Vm-4 ABTS在420nm處的摩爾消光
[0030] 系數為 ε = 36111^01^
[0031] 實施例1畢赤酵母基因工程菌的構建
[0032] 采用化學合成的方法合成序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID NO. 1所述的基因片段，將 純化后的目的基因片段加4尾連接到?1?-181'載體分別得到重組質粒?1?-181'-1^〇3/1(^3'， 分別將質粒PMD-18T-Lcc3/Lcc3'和pPIC9K同時用EcoR I和Not頂每切連接得到重組載體 pPIC9K-Lcc3/Lcc3'，用Sal I線形化后電轉入P.pichia GS115中。其中核苷酸序列為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.1的基因都是來源于Cerrena來源的漆酶，SEQ ID N0.1的漆酶比SEQ ID NO.2的漆酶缺少前端63個核苷酸。
[0033] 電轉方法:取一管感受態細胞轉移至酶切濃縮后的線性化質粒中，均勻混合，再轉 移至2mm預冷的電轉杯中，冰上放置3-5min后進行電轉。電轉化儀設置參數為：電壓1500V， 電阻200Ω，電容25yF。
[0034] 電轉化后立即加入lmL lmol/L的山梨醇溶液，混勻后轉移至1.5mL EP管中，30°C 復蘇lh，離心后除上清至剩余100yL，重懸菌體后涂布MD平板，30°C培養箱中培養3d后就可 得到單菌落轉化子。
[0035]隨機挑取43個單菌落分別點種于含G418 (1、2、3、4mg/mL)抗性的YPD平板上，挑取 G418含量為4mg/ml的YPD平板上的各43個單克隆進行陽性驗證，驗證正確的菌株即為構建 成功的漆酶Lcc3(核苷酸序列如SEQIDN0.2所示)和Lcc3'（核苷酸序列如SEQIDN0.1所 示)的畢赤酵母基因工程菌。
[0036]實施例2重組畢赤酵母基因工程菌的搖瓶發酵
[0037]將陽性重組菌劃線與YPD平板上培養3天左右，挑取單克隆與含25ml BMGY培養基 的250mL三角瓶中，30°C、220r/min培養16~18h使0D600達2~6,將菌液離心，生理鹽水離心 洗滌2次，菌體重懸于含25mL BMMY培養基的250mL三角瓶中，30°C、220r/min培養，每24h添 加0.5%甲醇誘導表達。定時取樣測定酶活力（圖1)。有圖1可知，發酵96h時酶活力達到最 大，其中表達Lcc3'（核苷酸序列如SEQ ID N0.1)的畢赤酵母基因工程菌的漆酶酶活(62U/ 〇比表達1^(^3的高出104.72%。
[0038] 發酵液上清的SDS-PAGE顯示，對照菌株(畢赤酵母GS115-pPIC9K-空)無明顯條帶， 而重組菌在63kDa左右有條帶（圖2)，比軟件預測的漆酶分子量53.3kDa大，可能是由于畢赤 酵母中進行的糖基化所致。
[0039] YDP培養基配方:1 %酵母粉，2 %胰蛋白胨，2 %葡萄糖。
[0040] BMGY培養基配方：1 %甘油，2 %胰蛋白胨，1 %酵母粉，1.34 % YNB，4 X 10-5 %生物 素，10 % pH6.0磷酸鹽緩沖液。
[0041 ] BMMY培養基配方：1 %酵母粉，2 %胰蛋白胨，1.34 % YNB，4 X 10-5 %生物素，10 % pH6.0磷酸緩沖液，0.5 %甲醇。
[0042]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種畢赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述畢赤酵母基因工程菌表達核苷酸序列 如SEQ ID N0.1的漆酶。2. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以P.pichia GS115為宿主構建得到的。3. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以PPIC9K為表達 載體構建得到的。4. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的構建方法：（1)化 學合成法合成SEQ ID NO. 1所示的基因片段；（2)將基因片段連接到pPIC9K上得到重組載體 pPIC9K-Lcc3' ；（3)將重組載體線形化后電轉入P.pichia GS115,篩選陽性克隆并驗證，即 得到畢赤酵母基因工程菌。5. -種發酵生產生產漆酶的方法，其特征在于，所述方法將權利要求1-4任一所述的基 因工程菌在BMGY培養基中，于溫度30°C、轉速220rpm下培養至0D 2~6,離心收集菌體，重懸 于BMMY培養基中，在溫度30°C、轉速220rpm下培養，添加甲醇和Cu2+誘導表達，發酵上清即含 有漆酶。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲醇的添加方式為每24h添加0.5 %的 甲醇。7. -種表達Cerrena來源的漆酶的方法，其特征在于，所述方法是將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的漆酶在畢赤酵母菌中進行表達。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法具體是:將核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的漆酶基因克隆到表達載體pPIC9K上得到重組載體，然后再轉化到畢赤酵母P.pichia GS115中進行表達。9. 權利要求1-4任一所述基因工程菌生產得到的漆酶。10. 權利要求9所述漆酶在紡織、化學、生物或環境領域的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種Cerrena來源的漆酶的高效表達方法，屬于生物工程技術領域。本發明以P.pichia？GS115為宿主、pPIC9K為載體表達SEQ？ID？NO.1的漆酶基因。本發明的方法實現了Cerrena來源的漆酶的活性表達、高效表達。而且本發明使用畢赤酵母表達系統來表達漆酶Lcc3’，還具有遺傳穩定、表達水平高、蛋白可翻譯后加工、產物可分泌、可高密度發酵等許多優點。
【IPC分類】C12N1/19, C12N9/02, C12N15/53, C12R1/84, C12N15/81
【公開號】CN105524852
【申請號】CN201610049312
【發明人】劉松, 陳堅, 堵國成, 王晨蕾
【申請人】江南大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月25日