一株釀酒酵母及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株釀酒酵母及其應用，屬于發酵技術領域。
【背景技術】
[0002] 酵母(Yeast)是一種肉眼看不見的微小單細胞微生物，能將糖發酵成酒精和二氧 化碳，是一種天然發酵劑，分布于整個自然界，它有自己的生命現象，是一種典型的兼性厭 氧微生物，在有氧氣和沒有氧氣存在的條件下都能夠存活。多數酵母可以分離于富含糖類 的環境中，比如一些水果(葡萄、蘋果、桃等)或者植物分泌物(如仙人掌的汁）。一些酵母在 昆蟲體內生活。酵母菌是單細胞真核微生物，形態通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸 檬形或藕節形等。比細菌的單細胞個體要大得多，一般為1~5微米或5~20微米，無鞭毛，不 能游動。
[0003] 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)在分類學上屬于真核生物原界、真菌 界、子囊菌門、酵母亞門、半子囊菌綱、酵母目、酵母科、酵母屬。釀酒酵母菌落呈圓形，有光 澤，平坦，邊緣整齊，在麥芽汁中培養細胞呈小圓形或卵圓形。適宜生長溫度為28°C~30°C， 最適pH值為4~5。釀酒酵母是與人類關系最廣泛的一種酵母，不僅因為傳統上它用于制作 面包和饅頭等食品及釀酒，在現代分子和細胞生物學中用作真核模式生物，其作用相當于 原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發酵中最常用的生物種類。釀酒酵母的細胞為球形 或者卵形，直徑5-10μπι。其繁殖的方法為出芽生殖。
[0004] 格瓦斯，又叫卡瓦斯、克瓦斯，產自俄羅斯，翻譯為中文是"用面包發酵的飲料"，是 一種谷物發酵飲料。它是以谷物、山花蜜、漿果、糖等天然物質為原料，經多種微生物發酵而 成的低醇飲品。其口感醇香微甜，具有開胃、健脾之功效，還能降血壓、消除疲勞。格瓦斯因 其悠久的歷史和香醇的口感，與德國啤酒、美國可樂、保加利亞布扎一起被譽為世界四大民 族飲品。本發明涉及的釀酒酵母從格瓦斯的傳統發酵中篩選，釀酒酵母是格瓦斯發酵過程 中的有益酵母，賦予格瓦斯獨特的醇香口味和微量的酒精度。篩選傳統發酵過程中的釀酒 酵母，為闡述格瓦斯風味形成機制奠定一定的基礎。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已于2014年12月1日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10124,保 藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0006] 本發明所述的釀酒酵母，分離自新疆某種以傳統方法發酵的格瓦斯，該菌株具有 典型特征的GTG-PCR指紋;其ITS序列經在NCBI網站上進行比對，表明該菌與一株釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae有最高匹配度，為99%。
[0007] 本發明還提供了一種應用所述釀酒酵母發酵格瓦斯的方法，將培養良好的釀酒酵 母在卡瓦斯傳統發酵過程的前期發酵中加入，可縮短傳統發酵格瓦斯發酵周期。
[0008] 所述釀酒酵母的保藏方法如下：從生長良好的YEro培養基平板中取單菌落移入新 鮮的液體YEro培養基中，28°C搖床培養24h，取0.9mL移入盛有0.9mL無菌甘油(35 %，v/v)的 甘油管中，放_70°C冰箱保存。
[0009] 所述YEro培養基為:蛋白胨20g · L-、酵母粉10g · L-S葡萄糖20g · L-IpH自然。
[0010] 本發明提供的釀酒酵母具有耐酸性，在pH為3的條件下生長良好，可以和乳酸菌共 同發酵，得到風味良好的格瓦斯成品。應用于傳統發酵格瓦斯，能夠縮短60h的發酵時間。同 時，賦予格瓦斯獨特的醇香口感和微量的酒精度。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已于2014年12月1日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10124,保藏地址為北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
【附圖說明】
[0013] 圖1 Rep-PCR(GTG-PCR)擴增指紋圖譜，M:10kb Marker，l:樣品。
[0014] 圖2釀酒酵母CGMCC No.10124生長曲線及pH為3的趨勢線
[0015] 圖3釀酒酵母G03生長曲線及pH為3的趨勢線
[0016] 圖4釀酒酵母掃描電鏡圖，A、B:Mag 5000x，C、D:Mag ΙΟΟΟΟχ。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1釀酒酵母篩選及鑒定
[0018] 從傳統發酵格瓦斯中取lml樣品，梯度稀釋到ΚΓ5，涂布于YEro平板，28°C培養5天。 挑取乳白色單菌落反復進行平板劃線分離，重復三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。
[0019] 所述YEPD培養基為:蛋白胨20g · L-、酵母粉10g · L-、葡萄糖20g · L-IpH自然。滅 菌條件：115°C，15min。待冷卻至45°C左右加入制霉菌素，添加量為50μg/ml。
[0020] 鑒定主要通過：1)菌落特征觀察：用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在2.0_左右，圓 形，表面光滑，乳白色等符合酵母菌菌落特征的菌株。2)個體形態觀察:用光學顯微鏡觀察， 挑選卵圓形，大小（1-5)μπιΧ(5-30)μπι，視野中有明顯出芽細胞的菌株。將滿足鑒定條件的 菌株挑出甘油管保藏。
[0021 ]以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于YEPD培養基中，28°C、150轉/分鐘培養 24h。取適量培養液離心lmin(12000rpm，4°C)，棄盡上清液，得到適量菌體，用酵母基因組 DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用酵母ITS序列通用引物對擴增基因組DNA，反應條件為:94 °C預變性5min后進入以下循環：94°C變性45s，55°C退火40s，72°C延伸60s，35個循環；72°C 延伸1 Omin。經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果良好。將擴增產物寄送生工基因測序，在NCBI網 站上進行BLAST序列比對，確定為釀酒酵母。該菌株具有典型特征的GTG-PCR指紋，即菌株專 一性的特征指紋，如圖1所示；測序分析，其ITS序列（基因間隔序列）基因型如SEQ ID NO. 1 所示，在NCBI網站上進行比對的結果是，該菌與一株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae (序列10:61^|1^021686.1)有最高匹配度，為99%。
[0022]實施例2釀酒酵母的活化及種子液的制備
[0023]將甘油管保藏的釀酒酵母接入YEPD液體培養基，在28°C、150rpm搖瓶培養36h，達 到菌種活化的目的。
[0024] 制備麥汁液體培養基，取少量菌液至10ml麥汁培養基中，28°C靜置培養36h;從其 中取lml菌液，接種至10ml麥汁培養基中，25°C靜置培養36h;從其中取lml菌液，接種至 100ml麥汁培養基中，23°C靜置培養48h，得到種子液。用于格瓦斯的接種發酵。
[0025] 實施例3釀酒酵母在格瓦斯發酵中的應用效果
[0026] 按照傳統格瓦斯的發酵工藝，用本發明篩選的釀酒酵母進行格瓦斯的發酵，大體 流程如下：
[0027] 面粉-醒發-烘烤-冷卻-粉碎-糖化-冷卻-自然發酵-過濾成品
[0028]依據《GB 10789-2007飲料通則》檢驗，用本發明選育的釀酒酵母發酵后的格瓦斯 飲品指標如下：
[0029] pH： 3.36
[0030] 總酸含量:0.2025g/100mL
[0031] 總糖含量:2.875g/L
[0032] 總氮含量:7.135mgN/100mL
[0033] 經感官品評分析，其風味、口感均達到優質格瓦斯飲品的標準，而且，相比于目前 常用的釀酒酵母，本發明篩選的酵母能夠有效地促進格瓦斯發酵，縮短60h的發酵周期。
[0034] 實施例4釀酒酵母耐酸性實驗-測生長曲線
[0035] 釀酒酵母耐酸性實驗所使用的培養基為不同pH值的YEH)培養基。YEPD培養基為： 蛋白胨2g/L，酵母粉1 g/L，葡萄糖2g/L，pH值梯度分別為3、4、5、6、7。115°C滅菌15分鐘。
[0036] 將常用釀酒酵母工業菌株G03作為對照，以1 %接種量取_70°C甘油貯存液接種于 YEH)培養基中，28°C，150轉/分鐘培養36h。以1 %接種量轉接至不同pH值的YEH)培養基中， 28°C，150轉/分鐘。測生長曲線，每2h取樣，紫外分光光度計測兩株酵母培養液的0D560nm 值，共24h取樣12次。通過對比，可知兩株釀酒酵母的生長特性。
[0037]由圖2可知，釀酒酵母CGMCC No.10124在低pH值(pH為3)下，生長良好(在第4h即進 入對數生長期）；與圖3對比可知，釀酒酵母CGMCC No. 10124在酸性培養條件下，生長趨勢明 顯優于常用釀酒酵母G03。從而可知，本發明提供的釀酒酵母耐酸性良好。
【主權項】
1. 一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年12月1日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10124,保藏地址為北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。2. 權利要求1所述釀酒酵母在釀酒中的應用。3. 權利要求1所述釀酒酵母在釀造格瓦斯中的應用方法。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，是將釀酒酵母的種子液在格瓦斯傳統發酵 過程的前發酵階段添加入到發酵液中。
【專利摘要】本發明公開了一株釀酒酵母及其應用，屬于發酵技術領域。所述釀酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)已于2014年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.10124。將該菌株應用于格瓦斯傳統發酵生產過程，具有縮短傳統發酵格瓦斯周期、耐酸性良好可與乳酸菌共同發酵的特點。CGMCC No.1012420141201
【IPC分類】C12G3/02, C12N1/16, C12R1/865
【公開號】CN105524851
【申請號】CN201610129186
【發明人】李崎, 鄭英訓, 劉春鳳, 鄭飛云, 李永仙, 王金晶, 朱林江
【申請人】江南大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年3月7日